一種用于前列腺癌診斷和預后判斷免疫組化檢測試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測試劑技術領域，具體涉及一種用于前列腺癌診斷和預后判斷 免疫組化檢測試劑。
【背景技術】
[0002] 前列腺癌是威脅男性的常見腫瘤之一，在歐美國家，僅次于肺癌，位列男性癌癥死 因的第二位。流行病學資料顯示，前列腺癌發(fā)病具有顯著的地域、種族、年齡差異。多項研究 還指出前列腺癌的發(fā)病與生活習慣、飲食文化、工作壓力、雄性激素水平及家族病史等有相 關性。中國處于前列腺癌的低發(fā)區(qū)，但近年來，我國男性的前列腺癌的發(fā)病呈上升趨勢，與 我國的人口老齡化加劇、生活質量改善及生活方式的改變有關。
[0003] 我國前列腺癌的基礎研究仍相對薄弱，現(xiàn)在常用的前列腺癌診斷方法主要有:直 腸指診、血清PSA、超聲和穿刺、影像學檢查等。這些診斷方法都停留在對前列腺癌發(fā)生的表 象進行檢查以作為診斷及預后判斷的依據(jù)，一方面受病理醫(yī)師經驗等人為因素影響，另一 方面缺乏更深層次的與病人個體發(fā)病因素相關的分子依據(jù)。而在分子水平對前列腺癌進行 相關檢測將對前列腺癌個體化診斷及精準醫(yī)療具有重要意義。
[0004] 腫瘤的發(fā)生與多種因素有關，每個發(fā)病個體又具有不同的發(fā)病因素。目前開展的 基因序列檢測主要從基因突變水平理解腫瘤的異常變化。然而，現(xiàn)有大規(guī)模測序研究結果 表明，幾乎所有的腫瘤相關基因的功能突變率只占腫瘤中的很小部分，在大多數(shù)情況下，其 它因素特別是真正發(fā)揮生物學作用的蛋白質的功能異變才是腫瘤的本質，其影響因素又可 包含蛋白的異常表達、異常修飾、異常調控和異常細胞定位。因此，對腫瘤惡性本質的深刻 認識和有效控制的前提是明確這些功能蛋白分子的異變情況，免疫組織化學是最有效的檢 測手段。免疫組織化學技術應用免疫學抗原抗體反應基本原理，通過抗體對體內蛋白質分 子抗原的特異性識別，以及化學標記的第二抗體的顯色等作用來檢測組織細胞內目標抗原 的表達量及其亞細胞定位。
[0005] 近年來，隨著免疫組織化學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的 是對腫瘤分子機制認識的不斷深入，免疫組化在腫瘤診斷與鑒別中的應用價值得到了普遍 的認可。雖然前列腺特異性抗原PSA、己糖激酶Hk2等非免疫組化檢測指標被廣泛用于前列 腺癌的臨床分子病理診斷，但對前列腺癌的病理分析和臨床用藥所起的作用非常有限、不 夠精準。為了不斷提高前列腺癌的診治水平，更深入的研究前列腺癌的發(fā)病機理，有待其它 分子指標被揭示并納入到臨床應用中，本發(fā)明公開的一種EHD2特異抗體及其免疫組化試劑 為前列腺癌的免疫組化分子病理檢測提供了一個新的分子指標，將有助于前列腺癌的精準 診療。
[0006] 本申請項目前期研究發(fā)現(xiàn)EHD2蛋白的表達與定位在前列腺癌中產生異變，自主研 發(fā)的EHD2特異抗體以及以此抗體為核心的免疫組化試劑可對此異變進行檢測。EHD2(Epsin homology(EH)-domain_containing protein 2)是EHD蛋白的一種，是一類新型膜轉運調控 蛋白，含有高度保守的結構域。參與受體內吞等胞膜轉運的多步調控，是整個胞膜轉運機 制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，在多種細胞中起分子與物質運輸及信號傳導等關鍵作用，它的 失調將導致細胞信號應答失當及細胞功能紊亂，并可能進而引發(fā)疾病。因此對EHD2進行免 疫組化檢測將更客觀準確地反映腫瘤的異化本質和患者個體的臨床特性。目前，由EHD2特 異抗體制備的免疫組化試劑未見報道，EHD2抗體在制備前列腺癌免疫組化檢測試劑中的應 用也沒有先例。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種用于前列腺癌診斷和預后判斷免疫組化檢測 試劑。

【發(fā)明內容】

[0008] 為解決【背景技術】中提到的問題，本發(fā)明公開了一種用于前列腺癌診斷和預后判斷 免疫組化檢測試劑。
[0009] 本發(fā)明解決的技術問題通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0010]為解決【背景技術】中提到的目前在臨床上對腫瘤的判別主要還是基于在組織病理 水平對腫瘤組織和腫瘤細胞進行常規(guī)形態(tài)學觀察，受病理醫(yī)師經驗等人為因素影響較大， 缺乏更深層次的與病人個體發(fā)病因素相關的分子依據(jù)的問題，本發(fā)明公布了一種用于前列 腺癌診斷和預后判斷免疫組化檢測試劑。
[0011] 本發(fā)明解決的技術問題通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0012] -種用于前列腺癌診斷和預后判斷免疫組化檢測試劑，是以一種對人EHD2蛋白特 異的抗體作為一抗或核心抗體；以化學標記包括熒光素、酶、金屬離子或同位素作為通用第 二抗體，通過顯色等作用來檢測組織細胞內目標抗原（多肽和蛋白質）的表達量及其亞細胞 定位。
[0013] 所述EHD2蛋白是指由基因 EHD2編碼的蛋白，所述基因 EHD2的GeneBank國際通用序 列編號為：NM_014601，所述基因 EHD2編碼蛋白的GeneBank國際通用序列編號為：NP_ 055416。
[0014]所述一種對人EHD2蛋白特異的抗體，其特征在于，所述抗體能特異性識別人EHD2 蛋白，所述識別位點的氨基酸序列為：503-SEQ ID N0:1-543,由該氨基酸序列構成的一種 多肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0015] 以所述多肽的氨基酸序列為核心序列對其進行修飾，所述修飾為在所述多肽N端 連接一個半胱氨酸;修飾后的所述多肽經純化后作為抗原對動物進行免疫以制備EHD2抗體 并進行抗原純化。
[0016] 所述免疫組化檢測試劑，用于對前列腺癌組織中EHD2的表達水平和定位進行檢 測，其特征是采用前述對人EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體。
[0017] 作為所述通用第二抗體的酶可為辣根過氧化物酶HRP、骨型堿性磷酸酶、激
[0018] 酶或蛋白酶。
[0019] 有益效果
[0020] 本發(fā)明的有益效果為：
[0021] 本發(fā)明公開了一種EHD2特異抗體在制備前列腺癌免疫組化檢測試劑中的應用，由 于EHD2蛋白參與受體與胞膜轉運的多步調控，以及在各種細胞中對維持物質運輸與信號傳 導等起關鍵作用，與前列腺瘤等疾病的發(fā)生密切相關。因此對EHD2進行免疫組化檢測將更 客觀準確地從分子水平反映腫瘤的異化本質和患者個體的臨床特點，符合腫瘤的精準醫(yī)療 原則和趨勢。
[0022]本發(fā)明公開的EHD2抗體在制備前列腺癌免疫組化檢測試劑中的應用，以對人EHD2 蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體，制備前列腺癌免疫組化檢測試劑，制備出的試劑特 異性好，靈敏度高，顯色性好，能有效判別組織細胞中EHD2基因在蛋白水平的表達情況以及 定位特征，為前列腺癌的個體化精準醫(yī)療提供新的分子依據(jù)。
【附圖說明】
[0023]圖1為免疫印跡檢測結果圖。
[0024]圖2為前列腺增生組織200倍鏡下免疫組化圖。
[0025]圖3為前列腺癌組織200倍鏡下免疫組化圖。
[0026]圖4為前列腺癌組織400倍鏡下免疫組化圖。
【具體實施方式】
[0027] 以下結合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細說明
[0028] 實施例：一種用于前列腺癌診斷和預后判斷免疫組化檢測試劑，是以一種對人 EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體；；以HRP作為第二抗體化學標記，通過稀釋顯色 等作用來檢測組織細胞內目標抗原(多肽和蛋白質）的表達量及其亞細胞定位。
[0029] 所述EHD2蛋白是指由基因 EHD2編碼的蛋白，所述基因 EHD2的GeneBank國際通用序 列編號為：NM_014601，所述基因 EHD2編碼蛋白的GeneBank國際通用序列編號為：NP_ 055416。
[0030 ]所述一種對人EHD 2蛋白特異的抗體，其特征在于，所述抗體能特異性識別人EHD 2 蛋白，所述識別位點的氨基酸序列為：503-SEQ ID N0:1-543,由該氨基酸序列構成的一種 多肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0031]以所述多肽的氨基酸序列為核心序列對其進行修飾，所述修飾為在所述多肽N端 連接一個半胱氨酸;修飾后的所述多肽經純化后作為抗原對動物進行免疫以制備EHD2抗體 并進行抗原純化。
[0032]所述免疫組化檢測試劑，用于對前列腺癌組織中EHD2的表達水平和定位進行檢 測，其特征是采用前述對人EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體。
[0033]作為所述通用第二抗體的酶可為辣根過氧化物酶HRP、骨型堿性磷酸酶、激 [