鑒別細(xì)菌感染的方法
【專利說明】鑒別細(xì)菌感染的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)涉及至少一種用于鑒別來自腹膜樣品的細(xì)菌感染性質(zhì)的方法，具體而言， 所述感染是否由革蘭氏-陽性和/或革蘭氏-陰性細(xì)菌引起。更具體地，所述方法涉及鑒別 所述樣品中一種或多種細(xì)胞和/或體液標(biāo)志物的相對(duì)量。進(jìn)一步，所述發(fā)明涉及治療方法， 其涉及所述方法的使用，理想地允許在選擇治療方案和/或監(jiān)測(cè)成功治療效果中做出知情 決策。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 細(xì)菌感染依然是世界各地的發(fā)病率和死亡率的主要原因，尤其由于耐抗生素的病 原菌的空前蔓延。而且，標(biāo)準(zhǔn)診斷的不良表現(xiàn)阻礙有效的感染控制，并且因此關(guān)于有效治療 的使用作出不恰當(dāng)?shù)倪x擇。這種令人恐慌的情形正引起對(duì)臨床實(shí)踐，公共衛(wèi)生和生物醫(yī)學(xué) 研究的巨大挑戰(zhàn)。
[0004] 疑似感染的當(dāng)前診斷和治療主要取決于可能的微生物病原體的陽性鑒定，該概念 在一個(gè)多世紀(jì)前由Robert Koch引入但從那以后沒有被改變。細(xì)菌感染的致病病原體的陽 性鑒定不僅對(duì)指導(dǎo)和改善關(guān)于抗生素治療選擇的患者管理是關(guān)鍵性的，而且它提供給我們 關(guān)于背后的炎癥機(jī)制以及如何操作這些機(jī)制以幫助解決感染的重要線索。
[0005]目前，檢測(cè)和定性感染微生物需要經(jīng)典的微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)、基于光譜的分析和/ 或高度復(fù)雜的核苷酸鑒定方法。Mohan et al. 2011描述了核苷酸檢測(cè)和免疫分析檢測(cè)的組 合使用，例如，"針對(duì)在37°C雜交所優(yōu)化的寡核苷酸探針便于與免疫分析整合"來診斷尿路 感染[5] C3Podsiadly et al. 2005 描述了檢測(cè)特異性肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae) IgM、IgG和IgA血清抗體的水平以診斷尿路感染[6]。這些后面的分析被認(rèn)為是不可靠的。
[0006] 而且，與對(duì)常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)依賴相關(guān)的固有延遲明顯地阻礙病原體鑒定。治療醫(yī)生 獲得結(jié)果以能夠特異性的和靶向的治療通常需要兩天或甚至更久。在一些疾病中，如肺結(jié) 核，這需要高達(dá)兩個(gè)月。更重要地，在很多情況下，通過傳統(tǒng)的方法不能培養(yǎng)細(xì)菌，這意味著 患者臨床癥狀背后的原因依然未知。
[0007] 通常，當(dāng)明顯的臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)，感染只是表面的。有效的和特異的治療干預(yù)取決 于致病微生物的早期檢測(cè)和鑒定。照慣例，基于癥狀、起初的臨床發(fā)現(xiàn)和炎癥的其他基本實(shí) 驗(yàn)室標(biāo)志物（如C-反應(yīng)蛋白）確定患者處理。該方法通常是欠佳的因?yàn)樘\統(tǒng)并且缺乏 特異性。通過微生物鑒定和抗生素敏感性試驗(yàn)通常僅獲得增加的特異性，并且這可伴隨感 染最佳處理的延遲。使用廣譜抗生素以覆蓋多種可能的發(fā)病原因的趨勢(shì)促成其他嚴(yán)重問題 如艱難梭菌（C. difficile)感染，以及細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。因此，存在明顯的臨床需求以實(shí) 現(xiàn)感染的較早和較好的檢測(cè)和定性以1)改善患者結(jié)果；2)改善特異性抗感染藥的使用；以 及3)降低抗菌素耐藥性和其他嚴(yán)重感染的發(fā)展。能夠?qū)崿F(xiàn)這種效果的技術(shù)會(huì)提高患者體 驗(yàn)，并且確保患者處理的更持久更經(jīng)濟(jì)有效的方法。
[0008] 腹膜透析（PD)為用于具有嚴(yán)重慢性腎臟疾病的患者的治療。療法涉及經(jīng) Tenckhoff管將專門的透析液引入腹腔，目標(biāo)是通過流體產(chǎn)生的透析梯度去除累積在腎臟 上的難以擴(kuò)散的毒素和水。兩個(gè)過程同時(shí)地發(fā)生在半滲透的腹膜上。富含葡萄糖的透析液 的感染導(dǎo)致腹膜炎，為ro的主要并發(fā)癥，其具有明顯的發(fā)病率和死亡率牽連。
[0009] 腹膜炎可具有對(duì)短期和長(zhǎng)期患者健康的不利影響。在短期內(nèi)，嚴(yán)重的腹膜炎發(fā)作 可導(dǎo)致需要立即去除Tenckhoff管，并且，因此，治療失敗。在長(zhǎng)期內(nèi)，復(fù)發(fā)或嚴(yán)重的腹膜炎 可導(dǎo)致腹膜增厚（纖維化）和膜通透性/功能的明顯改變，其導(dǎo)致治療失敗。腹膜炎發(fā)作 的早期確認(rèn)加上快速檢查、診斷和有效的治療對(duì)成功的結(jié)果是必要的。由于相對(duì)低的細(xì)菌 數(shù)量和培養(yǎng)它們所需的時(shí)長(zhǎng)（通常很多天），使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒別致病微生物可能是困難的。 這導(dǎo)致"培養(yǎng)陰性"腹膜炎的現(xiàn)象，即，所有臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)確認(rèn)診斷結(jié)果，但是在0-50% 的情況下從沒有鑒定到微生物[3]。因此，考慮到微生物確認(rèn)中的延遲，所有患者開始雙重 抗生素治療以涵蓋革蘭氏-陽性和革蘭氏-陰性細(xì)菌。只有當(dāng)（如果）鑒別到微生物，改 進(jìn)抗生素方案。如果ro流體樣本依然是培養(yǎng)陰性的，然后需要患者經(jīng)受延長(zhǎng)的雙重、廣譜 的抗生素治療。
[0010] 如上所述，盡管鑒別生物流體中的微生物的分子試驗(yàn)是可用的，它們通常遭受特 異性的缺乏、不可接受的假陽性高比率、和由于樣品的污染或無癥狀攜帶者的非病原種類 的頻繁鑒定。
[0011] 由此可見，迫切地需要指導(dǎo)療法的醫(yī)療點(diǎn)方法，尤其是在微生物種類或毒性是結(jié) 果的決定因素的情況下。
[0012] 本公開涉及快速診斷腹膜疾病中感染的方法。在本研究中，我們?cè)诔尸F(xiàn)急性腹膜 炎的第一天對(duì)ro患者進(jìn)行詳細(xì)的免疫和微生物分析。該技術(shù)的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的細(xì)胞和 體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)緊隨免疫系統(tǒng)對(duì)感染原的暴露。意外地，這種應(yīng)答在暴露的幾個(gè)小時(shí) 內(nèi)時(shí)是顯而易見的，并且在呈現(xiàn)有特性但不是診斷的"渾濁包"的時(shí)候可在具有急性臨床癥 狀的腹膜透析患者的排出物中檢測(cè)到這種應(yīng)答。按照這樣的方法，這些結(jié)果對(duì)具有疑似感 染的患者的鑒別診斷具有深遠(yuǎn)影響，并且可通過快速的基于生物標(biāo)志物的診斷，較好地預(yù) 測(cè)風(fēng)險(xiǎn)建模，和改善的治療靶向及其最終功效來幫助指導(dǎo)患者處理。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供用于鑒別腹膜樣品中的革蘭氏-陰性細(xì)菌感染的方 法，所述方法包括：
[0015] (a)檢驗(yàn)來自個(gè)體的所述腹膜樣品以測(cè)定所述樣品的總的T細(xì)胞群體內(nèi)的V S 2+T 細(xì)胞的量，并且
[0016] (b)當(dāng)總的T細(xì)胞群體內(nèi)的VS2+T細(xì)胞的量相對(duì)于來自不具有革蘭氏-陰性細(xì)菌 感染的個(gè)體的對(duì)照樣品中總的T細(xì)胞群體內(nèi)的V S 2+T細(xì)胞的量是增加的時(shí)；
[0017] (c)斷定腹膜樣品取自的個(gè)體具有革蘭氏-陰性細(xì)菌感染。
[0018]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本文提及的革蘭氏-陰性細(xì)菌感染涉及在革蘭氏染色 方案中不能保留結(jié)晶紫染料的細(xì)菌的感染。革蘭氏-陰性細(xì)菌的實(shí)例包括，但是不限于， 不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter)、氣單胞菌屬（Aeromonas)、擬桿菌屬（Sacfero/cfes)、巴爾 通氏體屬（Bartonella)、博代氏桿菌屬（Bordetella)、布魯氏菌屬（Brucella)、伯克氏 菌屬（Burkholderia)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)、衣原體屬（Chlamydia)、金黃桿菌 屬（Chryseobacterium)、梓檬酸桿菌屬（Citrobacter)、腸桿菌屬（Enterobacter)、埃希 氏桿菌屬（Escherichia)、弗朗西斯氏菌屬（Francisella)、梭菌屬（Fusobacterium)、 嗜血桿菌屬（Haemophilus)、哈夫尼菌屬（Hafnia)、螺桿菌屬（Helicobacter)、克雷伯 氏菌屬（Klebsiella)、軍團(tuán)菌屬（Legionella)、莫拉氏菌屬（Moraxella)、摩根氏菌屬 (Morganella)、奈瑟氏菌屬（Neisseria)、泛菌屬（Pantoea)、發(fā)光菌屬（Photobacterium)、 變形桿菌屬（Proteus)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、沙 門氏菌屬（Salmonella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、志賀氏桿菌屬（Shigella)、寡養(yǎng)單胞 菌屬（Stenotrophomonas)、韋榮球菌屬（Veillonella)、弧菌屬（Vibrio)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)〇
[0019] 本文提及的腹膜樣品指來自腹腔的流體樣品，其包括腹腔流出物，通常來自ro患 者，或從腹腔內(nèi)襯膜（腹膜）去除的組織。
[0020] 本文提及的來自不具有革蘭氏-陰性細(xì)菌感染的個(gè)體的對(duì)照樣品指使用任意一 項(xiàng)或多項(xiàng)鑒別革蘭氏-陰性細(xì)菌感染的常規(guī)技術(shù)已表明不具有革蘭氏-陰性細(xì)菌感染的樣 品。
[0021 ] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，可直接地或間接地進(jìn)行檢驗(yàn)來自個(gè)體的所述腹膜 樣品以測(cè)定所述樣品的總的T細(xì)胞群體內(nèi)V S 2+T細(xì)胞的量。通過測(cè)定所述樣品的總的T 細(xì)胞群體內(nèi)V S 2+T細(xì)胞的量來進(jìn)行來自個(gè)體的所述腹膜樣品的直接檢驗(yàn)，以測(cè)定所述樣品 總的T細(xì)胞群體內(nèi)V S 2+T細(xì)胞的量。通過測(cè)定所述樣品的總的T細(xì)胞群體內(nèi)的其他T細(xì) 胞的量，測(cè)定所述樣品的總的T細(xì)胞群體，然后進(jìn)行相減以確定所述樣品的總的T細(xì)胞群體 內(nèi)V S 2+T細(xì)胞的量，來進(jìn)行來自個(gè)體的所述腹膜樣品的間接檢驗(yàn)，以測(cè)定所述樣品的總的T 細(xì)胞群體內(nèi)V 5 2+T細(xì)胞的量。備選地，通過分析替代標(biāo)志物（即，代表V 5 2+T細(xì)胞的標(biāo)志 物），例如通過測(cè)定V 丫 9+T細(xì)胞，pan- Y S +T細(xì)胞，pan- a 〃（ a / 陰性T細(xì)胞）或CD4_ ⑶8 _ ("雙-陰性"或DN) T細(xì)胞，其通常全部或至少大多數(shù)細(xì)胞將為V S 2+T細(xì)胞，來進(jìn)行來 自個(gè)體的所述腹膜樣品的間接檢驗(yàn)，以確定V S 2+T細(xì)胞的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解尋求 的細(xì)胞的性質(zhì)以進(jìn)行這種間接測(cè)定。
[0022] 優(yōu)選地，所述腹膜的樣品為來