多功能熒光蛋白納米線及其介導(dǎo)的免疫分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，特別涉及一種多功能熒光蛋白納米線及其介導(dǎo)的免疫分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白微陣列分析(ProteinMicroarray)技術(shù)又稱蛋白芯片技術(shù)，可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用篩查、高通量靶標(biāo)蛋白檢測(cè)、各種蛋白質(zhì)譜學(xué)分析、蛋白-核酸相互作用分析、蛋白質(zhì)-小分子(藥物篩選)相互作用分析等。其基本原理類似于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，將大量不同的目標(biāo)蛋白按照指定順序固定于固相載體(玻片、云母)表面，通過熒光標(biāo)記抗體或相互作用分子指示靶標(biāo)蛋白的位置，從而獲取相互作用的信息。蛋白芯片技術(shù)使得復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和多目標(biāo)分子同時(shí)檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)。
[0003]傳統(tǒng)的蛋白芯片是通過在抗體或相互作用分子的表面修飾熒光分子來進(jìn)行信號(hào)輸出，其修飾的熒光分子數(shù)量有限，過多的熒光分子修飾也會(huì)影響抗體或相互作用分子的結(jié)合能力，這限制了蛋白芯片靈敏度的提高。隨著技術(shù)的發(fā)展，常規(guī)蛋白芯片的分析靈敏度1-100ng/mL(Espina V等，Protein microarray detect1n strategies:focus on directdetect1n technologies，J.Tmmunol.Methods.290,121-133,2004.)已經(jīng)無(wú)法滿足臨床檢測(cè)和科學(xué)研究需求，亟需高靈敏的蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)。
[0004]現(xiàn)有蛋白芯片的熒光檢測(cè)信號(hào)放大方法主要包括:
[0005](I)銀染增強(qiáng)(CN101539573、CN1743845A)，通過在特異性結(jié)合分子標(biāo)記的納米金的表面進(jìn)行銀離子的還原，從而使標(biāo)記的納米金信號(hào)增強(qiáng)，是一種基于化學(xué)反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)增方法;然而，銀染增強(qiáng)的方法過程復(fù)雜，容易產(chǎn)生較強(qiáng)的背景信號(hào)，靈敏度提升有限。
[0006](2)量子點(diǎn)(Mei Hu等，Ultrasensitive ,Multiplexed Detect1n of CancerB1markers Directly in Serum by Using a Quantum Dot-Based MicrofluidicProtein Chip,ACS Nan0.2010.Jan;4(1):488-494.)，該方法利用量子點(diǎn)本身較好的熒光性質(zhì)，將其標(biāo)記在抗體等特異性結(jié)合分子上，從而提高蛋白芯片的熒光信號(hào)響應(yīng);然而，量子點(diǎn)修飾過程復(fù)雜，容易發(fā)生熒光淬滅，批量生產(chǎn)的質(zhì)控困難，且成本高昂，至今未進(jìn)入大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]( 3 )碳納米管介導(dǎo)的拉曼增強(qiáng)(Beauso I e i I SA 等，A probability-basedapproach for high-throughput protein phosphorylat1n analysis and sitelocalizat1n,Nat B1technol.2008.Nov；26(ll): 1285-92.)，通過在碳納米管的表面反復(fù)還原金和銀，形成粗糙的金屬表面，從而得到表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)，用于蛋白芯片檢測(cè)的信號(hào)放大;然而，碳納米管拉曼標(biāo)記的制備、標(biāo)記過程復(fù)雜，需要專用的儀器，方法不通用。
[0008](4)病毒載體介導(dǎo)的焚光信號(hào)放大(Kim E.Sapsford等，A cowpea mosaic virusnanoscaffold for multiplexed antibody conjugat1n:AppIi cat 1n as animmunoassay tracer,B1sens B1electron.2006,21(8): 1668-1673.)，利用病毒顆粒較大的比表面積和豐富的表面反應(yīng)基團(tuán)，同時(shí)修飾抗體和熒光染料，通過病毒顆粒本身來結(jié)合大量的熒光分子，從而在結(jié)合目標(biāo)分子時(shí)提高熒光分子的數(shù)量來達(dá)到信號(hào)放大的目的；然而，病毒載體介導(dǎo)的熒光信號(hào)放大方法靈敏度提升有限，且制備過程復(fù)雜，不可控。
[0009]上述現(xiàn)有技術(shù)中，無(wú)論是通過提高標(biāo)記分子的熒光強(qiáng)度(或通過化學(xué)反應(yīng)來提高標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度)還是提高標(biāo)記熒光分子數(shù)量來放大蛋白芯片的信號(hào)，均存在靈敏度提升不足、制備復(fù)雜、成本尚等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)中免疫檢測(cè)尤其是蛋白芯片檢測(cè)靈敏度不足、制備復(fù)雜等缺點(diǎn)，提供一種多功能熒光蛋白納米線及其介導(dǎo)的免疫分析信號(hào)放大方法，以熒光分子作為信號(hào)分子，在位于多功能熒光蛋白納米線兩端的熒光分子表面修飾功能配體作為結(jié)合分子，可用于提高免疫檢測(cè)靈敏度。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明一方面提供一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側(cè)的熒光分子，其中，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，至少一個(gè)所述熒光分子表面連接功能配體，至少一個(gè)所述熒光分子表面未連接功能配體。
[0013]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，所述成線蛋白為含有能夠組裝成線性納米結(jié)構(gòu)自組裝結(jié)構(gòu)域的蛋白，例如可為酵母朊蛋白(Sup35)、淀粉樣蛋白Ure2、絲素蛋白等。優(yōu)選的，成線蛋白為酵母朊蛋白，Sup35的第1-61位氨基酸為自組裝結(jié)構(gòu)域。
[0014]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，所述熒光分子包括綠色熒光蛋白或其變體蛋白等自身在一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，以及熒光素酶等使底物發(fā)光的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述熒光分子為綠色熒光蛋白。
[0015]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，所述功能配體包括能夠直接(如具有特異性結(jié)合能力的功能化抗體、金屬結(jié)合肽、蛋白A、蛋白G等)或間接(如生物素、親和素等)與抗體或抗原等結(jié)合的化合物，能夠催化不同反應(yīng)的酶分子(如甲基對(duì)硫磷水解酶MPH、辣根過氧化物酶HRP、葡萄糖氧化酶GOD或堿性磷酸酶ALP等)。優(yōu)選的，所述功能配體為生物素。
[0016]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，所述成線蛋白為酵母朊蛋白，所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素。
[0017]具體的，所述綠色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素包括:
[0018]通過分子克隆在所述綠色熒光蛋白的C末端融合生物素接受多肽(b1tinaccepted peptide，BAP)得到融合蛋白基因，將所述融合蛋白基因克隆入表達(dá)載體；
[0019]將生物素蛋白連接酶(B1tin-protein ligase,BirA)克隆入共表達(dá)載體中；
[0020]將所述表達(dá)載體、共表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中培養(yǎng)，活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入誘導(dǎo)表白蛋白和生物素；
[0021 ]經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的綠色熒光蛋白。
[0022]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，表面連接功能配體的熒光分子位于靠近蛋白納米線端部的位置，且其數(shù)量小于表面未連接功能配體的熒光分子的數(shù)量。
[0023]在本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】中，熒光分子為綠色熒光蛋白，功能配體為生物素，多功能熒光蛋白納米線整合了大量的熒光蛋白在其表面，而在多功能熒光蛋白納米線兩端結(jié)合有生物素，通過生物素-親和素-生物素相互作用，可以與生物素化的抗體-抗原復(fù)合物相結(jié)合，從而在一個(gè)抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合大量的熒光蛋白，達(dá)到芯片表面熒光信號(hào)的大幅提尚O
[0024]本發(fā)明還一方面提供一種多功能熒光蛋白納米線的制備方法，包括如下步驟:
[0025](I)通過分子克隆將成線蛋白LP的自組裝結(jié)構(gòu)域與熒光分子FP融合形成融合蛋白基因LP-FP;
[0026](2)通過分子克隆將成線蛋白自組裝結(jié)構(gòu)域與焚光分子融合后，在焚光分子末端連接功能配體L，形成融合蛋白基因LP-FP-L(簡(jiǎn)稱LP-L);
[0027](3)將步驟(I)和步驟(2)得到的融合蛋白基因LP-FP及LP-L分別經(jīng)表達(dá)純化得到融合蛋白LP-FP及LP-L;
[0028](4)將步驟(3)得到的融合蛋白LP-FP及LP-L通過自組裝形成多功能熒光蛋白納米線。
[0029]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述成線蛋白為酵母朊蛋白，所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素，多功能熒光蛋白納米線的制備包括如下步驟:
[0030](I)通過分子克隆將酵母朊蛋白Sup35的自組裝結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白GFP融合形成融合蛋白基因Sup35-GFP;
[0031](2)通過分子克隆將酵母朊蛋白Sup35的自組裝結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白GFP融合后，在綠色熒光蛋白C端連接生物素接受多肽BAP，形成融合蛋白基因Sup35-GFP-BAP (簡(jiǎn)稱Sup35-BAP)；
[0032](3)將步驟(I)和步驟(2)得到的融合蛋白基因Sup35-GFP和Sup35-BAP分別經(jīng)表達(dá)純化得到融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白；
[0033](4)將步驟(3)得到的融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白