專(zhuān)利名稱(chēng)：脯氨酸蓄積能力高的稻科植物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脯氨酸蓄積能力高、耐鹽性、耐干燥性、耐冷性都很高的稻科植物及其生產(chǎn)方法。
人們已知在包括鹽生植物在內(nèi)的幾種植物中，植物如果受到高鹽脅迫和干燥脅迫，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)蓄積脯氨酸(氨基酸的一種)。蓄積的脯氨酸能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)的滲透壓和抑制由于脅迫造成的功能蛋白質(zhì)的變性。植物內(nèi)的脯氨酸是在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)兩個(gè)酶的催化下由谷氨酸合成的。而脯氨酸在脯氨酸脫氫酶(ProDH)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶(P5CDH)兩個(gè)酶的催化下可分解為谷氨酸。
上述植物如果受到高鹽脅迫或干燥脅迫等水脅迫(難吸收水的狀態(tài))，P5CR活性及其基因表達(dá)水平都升高，P5CS被激活，但P5CR活性及其基因表達(dá)仍處于一定的低水平。另外代謝體系的基因表達(dá)和酶活性也變成了被抑制的狀態(tài)。可是一旦水脅迫被解除，合成體系的基因表達(dá)和酶活性被抑制，ProDH基因表達(dá)被快速誘導(dǎo)，酶活性也提高，蓄積在細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸也快速代謝為谷氨酸。
從以上代謝過(guò)程可以認(rèn)為水脅迫時(shí)脯氨酸合成中P5CS成了限速酶，而水脅迫解除后的脯氨酸代謝中ProDH成了限速酶(Yoshiba等，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)381095-1102(1997))。

發(fā)明內(nèi)容
隨著地球環(huán)境的惡化，干燥和半干燥造成的鹽類(lèi)土壤的增加以及由于人口增加造成的食物供應(yīng)不足狀況越來(lái)越嚴(yán)重。所以耐高鹽脅迫、干燥脅迫以及低溫脅迫(難吸收水狀態(tài))的作物的育種在解決世界的糧食問(wèn)題中起著重要的作用，現(xiàn)在從各個(gè)方面在進(jìn)行研究，有希望取得成果。
本發(fā)明的目的在于著眼于植物脯氨酸合成和分解代謝過(guò)程中的限速酶Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脫氫酶(ProDH)的重要性，通過(guò)基因重組技術(shù)對(duì)這些酶基因的表達(dá)進(jìn)行控制，提供脯氨酸蓄積能力高，因而耐鹽性、耐干燥性、耐冷性都提高的稻科植物及其生產(chǎn)方法。
可以通過(guò)導(dǎo)入脯氨酸合成體系中的P5CS基因使其表達(dá)過(guò)量，或是導(dǎo)入分解代謝體系中的ProDH基因的反義(帶有反向堿基序列)基因來(lái)抑制脯氨酸的分解，或是同時(shí)導(dǎo)入P5CS基因和ProDH基因，一方面抑制了脯氨酸的分解，而另一方面又促進(jìn)脯氨酸合成等手段使得水稻和稻科植物的細(xì)胞內(nèi)蓄積高濃度的脯氨酸。
本發(fā)明通過(guò)蓄積高濃度的脯氨酸，可以在分子水平上對(duì)具有耐鹽性、耐干燥性或耐冷性的水稻和稻科植物進(jìn)行育種(分子育種)。
到目前為止有關(guān)通過(guò)促進(jìn)合成或抑制分解來(lái)提高作為抗?jié)B透溶質(zhì)的脯氨酸濃度還沒(méi)有報(bào)道。本發(fā)明的發(fā)明人著眼于P5CS基因和ProDH基因的重要性，為了解決以前沒(méi)有解決的新的技術(shù)課題，對(duì)容易進(jìn)行基因?qū)氲乃酒贩N的選定、提高愈傷組織形成速度、水稻用基因?qū)胼d體的構(gòu)建等各個(gè)方面進(jìn)行了研究，開(kāi)發(fā)出新的技術(shù)，直至完成本發(fā)明。
在本發(fā)明中提供了分別或聯(lián)合導(dǎo)入來(lái)自水稻或Arabidopsis thaliana的脯氨酸的合成基因、脯氨酸分解基因的反義基因，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化的稻科植物及其生產(chǎn)方法。
在本發(fā)明的稻科植物中導(dǎo)入了編碼脯氨酸合成酶的基因、或是導(dǎo)入了脯氨酸分解酶的反義基因、或是同時(shí)導(dǎo)入了這兩個(gè)基因。通過(guò)這樣構(gòu)建，可以培養(yǎng)出耐鹽性、耐干燥性和耐冷性都提高的稻科植物。另外，從本發(fā)明的稻科植物收獲的成熟種子，特別是水稻種子歷經(jīng)數(shù)代仍具有保持高的脯氨酸蓄積能力的特點(diǎn)。
本發(fā)明雖然是以水稻或稻科食物作為對(duì)象，但只要是屬于稻科植物并沒(méi)有特別限定。屬于稻科的植物有水稻、玉米、小麥、大麥、黑麥、矮草、谷子和稗子等。本發(fā)明特別優(yōu)選適合于水稻。


圖1A-
圖1D表示重組了脯氨酸合成體系酶P5CS基因和脯氨酸分解代謝酶ProDH基因及其反義基因的水稻用載體。
圖2表示通過(guò)基因操作導(dǎo)入了
圖1A-
圖1D給出的載體的水稻沒(méi)有表現(xiàn)出脅迫的脯氨酸蓄積量。
圖3表示重組了圖2給出的與脯氨酸相關(guān)基因的基因重組水稻的耐鹽性。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的實(shí)施例的稻科植物中，導(dǎo)入了來(lái)自水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸(抗?jié)B透溶質(zhì))的合成基因、脯氨酸分解基因的反義基因中的任一個(gè)或?qū)烧叨紝?dǎo)入后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
向本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物導(dǎo)入一種基因的例子有(1)含有序列號(hào)1記載的序列(堿基序列和氨基酸序列)的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(2)含有序列號(hào)2記載的序列(堿基序列和氨基酸序列)的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(3)含有序列號(hào)3記載的序列(堿基序列和氨基酸序列)的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向堿基序列)基因。
向本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物導(dǎo)入兩種基因的例子有(1)含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向堿基序列)基因的兩種基因。(2)含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因與含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向堿基序列)基因一前一后地(串聯(lián))連接的兩種基因。
在本發(fā)明實(shí)施例使用的載體中插入了含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向堿基序列)基因中的任一個(gè)基因，或是插入了水稻或Arabidopsis thalianaP5CS基因與上述的反義基因一前一后地連接的兩個(gè)基因。
本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物可以通過(guò)以下的任一操作獲得。(1)將上述載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖后從愈傷組織再分化植物體。(2)將上述載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的原生質(zhì)體，從使該原生質(zhì)體增殖后的集群中使植物體再分化。(3)與通過(guò)基因操作導(dǎo)入上述載體后獲得的稻科植物進(jìn)行雜交。
作為本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物的生產(chǎn)方法有諸如以下的一些例子。(1)利用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)將上述載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖后，使植物體再分化。(2)通過(guò)電穿孔將上述載體導(dǎo)入取自稻科植物的原生質(zhì)體，從使該原生質(zhì)體增殖后的集群中使植物體再分化。(3)與通過(guò)基因操作導(dǎo)入上述載體后獲得的稻科植物進(jìn)行雜交。
在這些生產(chǎn)方法中提供了脯氨酸蓄積能力高而且耐鹽性、耐干燥性和耐冷性提高的稻科植物的生產(chǎn)方法。
另外，從本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物收獲的成熟種子，特別是水稻種子歷經(jīng)數(shù)代仍保持高的脯氨酸蓄積能力。
以下通過(guò)以水稻為例按照步驟詳細(xì)說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例的稻科植物及其生產(chǎn)方法的例子。不用說(shuō)以下說(shuō)明的步驟無(wú)論是原來(lái)步驟還是變更過(guò)的步驟也都適用于水稻以外的稻科植物。
(基因的克隆)最開(kāi)始是從水稻幼苗提取mRNA，利用該mRNA合成cDNA。將該cDNA與由質(zhì)粒或嗜菌體構(gòu)建的載體連接，導(dǎo)入宿主微生物(E.coli)中，制備重組DNA。導(dǎo)入該重組DNA的轉(zhuǎn)化體通過(guò)使用Arabidopsis thalianaP5CS基因作為探針的蝕斑雜化技術(shù)進(jìn)行篩選。由于水稻以及Arabidopsisthaliana P5CS基因的序列已有報(bào)道(Yoshiba等人，植物學(xué)(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.)(1997)33857-865)，以這些序列作為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，然后利用PCR進(jìn)行篩選，篩選出目的轉(zhuǎn)化體。從得到的轉(zhuǎn)化體分離出目的質(zhì)粒，如果需要，可以用限制性?xún)?nèi)切酶切，然后通過(guò)對(duì)質(zhì)粒載體亞克隆使其克隆。Arabidopsis thaliana P5CS基因也用與水稻克隆化同樣的方法進(jìn)行克隆。但是，提取mRNA的樣品可以是從通常環(huán)境下培育的，但最好是實(shí)施高鹽脅迫(浸在250mM NaCl溶液中)或干燥脅迫處理的樣品。因?yàn)檫@樣操作可以誘導(dǎo)對(duì)高鹽脅迫或干燥脅迫應(yīng)答的P5CS基因(Yoshiba等人，植物(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，PlantMol.Biol.(1997)33857-865、Yoshiba等人，細(xì)胞生理學(xué)(Plant CellPhysiol.)(1997)381095-1102)。
另外Arabidopsis thaliana ProDH基因(序列已經(jīng)由Kiyosue等人報(bào)道過(guò)植物細(xì)胞(Plant Cell)(1996)81323-1335)也可以利用上述方法進(jìn)行克隆。但是提取mRNA的樣品最好是用給予干燥脅迫(大約處理10小時(shí))后，然后再浸入水中吸收水的樣品或者是浸入脯氨酸溶液吸收脯氨酸的樣品等。這樣做是由于ProDH基因受到水脅迫期間其表達(dá)受到抑制，而通過(guò)高濃度的脯氨酸又可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)(Kiyosue等人Plant Cell)(1996)81323-1335、Yoshiba等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(PlantCell Physiol.)(1997)381095-1102)。
如果使用以上樣品，P5CS基因和ProDH基因不僅可以從水稻或Arabidopsis thaliana分離出，也可以從其他稻科植物中分離出來(lái)。
(基因?qū)胼d體的構(gòu)建)克隆的各個(gè)P5CS基因和ProDH基因用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶從質(zhì)粒中切出，然后如
圖1A-
圖1D所示的那樣連接在將pBI載體改進(jìn)的水稻用載體花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子的后面。在
圖1A-
圖1D中，RB代表右邊界，35Spro代表花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子、P5CS代表水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸合成體系的酶基因、ProDH代表Arabidopsis thaliana的脯氨酸分解代謝體系的酶基因、Noster代表胭脂堿合成酶基因的終止子、HTP代表潮霉素抗性基因、LB代表左邊界。而箭頭表示基因的有意義方向。
在
圖1A-
圖1D中，
圖1A表示構(gòu)建的載體圖，載體中的序列依次為RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
圖1B與上述A相比，RB-35SPro-P5CS-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB的次序與
圖1A的構(gòu)建相同，但基因P5CS序列為反義序列。
圖1C替換了上述
圖1A構(gòu)建的基因P5CS，基因ProDH換成反義序列，構(gòu)建成的載體中基因的次序?yàn)镽B-35SPro-35SProDH(反義)-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB。
圖1D是在上述A的構(gòu)建中基因ProDH為反義序列、而將上述C給出的構(gòu)建一前一后地連接，構(gòu)建的載體為RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-ProDH(反義)-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
眾所周知35S啟動(dòng)子是強(qiáng)力啟動(dòng)子，是無(wú)論在哪種組織中都能穩(wěn)定誘導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。而插入基因的方向?qū)τ赑5CS是有義方向，而對(duì)于ProDH是反義方向連接。
連接了基因的載體利用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入根癌土壤桿菌EHA101菌中。導(dǎo)入各個(gè)構(gòu)建載體(
圖1A-
圖1D)的根癌土壤桿菌通過(guò)含有細(xì)菌培養(yǎng)用胨(10g/l)、細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(10g/l)、氯化鈉(5g/l)、1M氯化鎂(2ml/l)、潮霉素B(50mg/l)的YEP培養(yǎng)基于28℃下培養(yǎng)，使其增殖。用導(dǎo)入了構(gòu)建載體(
圖1A-
圖1D)的根癌土壤桿菌感染水稻愈傷組織進(jìn)行基因?qū)?。?gòu)建載體D是按照將兩個(gè)基因(P5CS基因和ProDH基因)一前一后地連接之后同時(shí)導(dǎo)入那樣設(shè)計(jì)的，而如果將構(gòu)建載體A和C混合共感染也可獲得與構(gòu)建載體D感染同樣的效果。
另外，雖然在各個(gè)構(gòu)建載體中都連接了HPT(潮霉素)基因，但由于它是用來(lái)作為解析導(dǎo)入基因的效果的基礎(chǔ)研究用，為的是更有效地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植物體，所以在實(shí)際的鹽害地或干燥地栽培時(shí)不必插入它。
(基因?qū)胗盟居鷤M織的誘導(dǎo))成熟的水稻種子剝?nèi)ぶ螅胖糜?0％乙醇10分鐘，3％次氯酸鈉1小時(shí)進(jìn)行殺菌。殺菌后，用滅菌水將種子洗3次，然后放置在含有1g/l的酪蛋白氨基酸、30g/l的蔗糖、2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸、2g/l脫乙酰吉蘭糖膠的pH5.8的N6培養(yǎng)基(2N6培養(yǎng)基)上，于28℃在黑暗條件下培養(yǎng)3～5周。
(向水稻愈傷組織導(dǎo)入基因)上述誘導(dǎo)的直徑為1～3mm的水稻愈傷組織載置于2N6培養(yǎng)基，于28℃在黑暗條件下培養(yǎng)3～4日。通過(guò)這樣培養(yǎng)可以提高愈傷組織細(xì)胞的分裂活性。通過(guò)將培養(yǎng)的愈傷組織與在YEP培養(yǎng)基中增殖的導(dǎo)入了各個(gè)構(gòu)建載體的根癌土壤桿菌液(菌濃度OD660nm測(cè)定值為0.1)混合使其感染進(jìn)行基因?qū)?。然后愈傷組織于25℃在黑暗條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，用1mg/4ml濃度的頭孢噻肟水溶液將附著在愈傷組織表面上多余的菌洗幾次進(jìn)行殺菌，用滅菌的一次性紙巾等擦過(guò)后，放置在含有250mg/l的頭孢噻肟、10mg/l的潮霉素B的2N6培養(yǎng)基(一次選擇培養(yǎng)基)上，于28℃在黑暗條件下培養(yǎng)1周。
(轉(zhuǎn)化愈傷組織的選擇和植物體的再分化)將在含有頭孢噻肟培養(yǎng)基中培養(yǎng)的愈傷組織置于含有30mg/l的潮霉素B的培養(yǎng)基(二次選擇培養(yǎng)基)中，于28℃在黑暗條件下培養(yǎng)3周。然后將愈傷組織移到含有30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、酪蛋白氨基酸2g/l、MES緩沖液11g/l、萘乙酸(NAA)2mg/l、kinetin 1mg/l、頭孢噻肟250mg/l、潮霉素B 30mg/l、脫乙酰吉蘭糖膠4g/l的pH5.8的MS培養(yǎng)基(再分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，于28℃在亮處培養(yǎng)3周。導(dǎo)入了基因的愈傷組織形成綠色斑點(diǎn)，從該斑點(diǎn)分化出芽和根。將分化的愈傷組織再移到含有蔗糖30g/l蔗糖、頭孢噻肟250mg/l、潮霉素B 30mg/l、瓊脂8g/l的去除了植物激素的pH5.8的MS培養(yǎng)基(植物體形成培養(yǎng)基)中，通過(guò)于28℃在亮處培養(yǎng)數(shù)周使植物體培育得更大些。
(轉(zhuǎn)化水稻植物體的培育和種子形成)再分化的水稻于培養(yǎng)皿內(nèi)培育到高度大約4～5cm后移入加入了育苗用土壤的花盆中，在照度大約為2萬(wàn)流明的人工氣象培育箱內(nèi)于28℃的溫度條件下一直培育到從第4個(gè)葉長(zhǎng)到第5個(gè)葉為止。將幼苗移到加了含有適量肥料的黑土的盆中，于溫室內(nèi)培育到種子成熟。再分化的當(dāng)代的植物體是T0代，從該植物體收獲的種子培育為T(mén)1代，一直培育到T2～T3代。在實(shí)際農(nóng)田栽培時(shí)，要對(duì)各代多次進(jìn)行各種安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)安全之后再推向市場(chǎng)。
(從轉(zhuǎn)化水稻提取脯氨酸和濃度測(cè)定)脯氨酸從T2代或T3代的轉(zhuǎn)化水稻幼苗(第4葉展開(kāi)后的幼苗)的葉提取。將在人工氣象培育箱中培育的水稻幼苗的葉用剪刀等剪成大約200mg大小的片，然后在研缽內(nèi)加入液氮研磨到成粉末狀為止。粉末樣品加入純水再用勻漿器研磨粉碎。粉碎了的樣品于97℃加熱6分鐘后進(jìn)行冰冷，然后于4℃，17000G條件下離心10分鐘，分離出上清。向得到的上清中加入氯乙酸(最終濃度為5％)混合，離心10分鐘(4℃，17000G)，使蛋白質(zhì)沉淀。作為抗?jié)B透溶質(zhì)的脯氨酸包含在離心后的上清中，其濃度可以通過(guò)高效液相色譜(HPLC)測(cè)定。脯氨酸的定性定量首先要通過(guò)HPLC測(cè)定濃度一定的各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以他們的保留時(shí)間作為基礎(chǔ)進(jìn)行換算，來(lái)定量實(shí)際的基因重組水稻葉所含有的脯氨酸的量。
圖2表示的是導(dǎo)入各種基因的重組水稻沒(méi)有給予脅迫時(shí)的脯氨酸含量。圖中左側(cè)空白部位為沒(méi)有重組與脯氨酸相關(guān)的基因的對(duì)照，而右側(cè)5個(gè)涂黑的條塊圖分別表示插入了與脯氨酸相關(guān)的基因的基因重組水稻的各個(gè)體系。可以看出脯氨酸的量由于導(dǎo)入的基因的種類(lèi)不同而不同。
左數(shù)第2列是反義導(dǎo)入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
圖1B)的水稻幾乎沒(méi)有蓄積脯氨酸。左數(shù)第3列是有義導(dǎo)入Arabidopsis thaliana P5CS基因(AtP5CS)(
圖1A)的水稻，與對(duì)照相比，能看出脯氨酸蓄積量在增加。同樣左數(shù)第4列和第5列反義導(dǎo)入Arabidopsis thaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻(
圖1C)和有義導(dǎo)入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
圖1A)的水稻，分別與對(duì)照相比，能看出脯氨酸蓄積量在增加。與此相對(duì)應(yīng)，右端的有義導(dǎo)入水稻P5CS基因(OsP5CS)、反義導(dǎo)入Arabidopsisthaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻與上述導(dǎo)入一種基因的水稻相比，可以確認(rèn)蓄積的脯氨酸量要高得多(最高的比對(duì)照高100倍以上)。而且可以看出就有義導(dǎo)入基因的水稻來(lái)說(shuō)，在脯氨酸蓄積方面導(dǎo)入OsP5CS(左數(shù)第5列)要比導(dǎo)入AtP5CS(左數(shù)第3列)效果稍微好些。
(耐鹽性試驗(yàn)和基因重組水稻的耐鹽性的提高)圖3表示的是使用圖2右側(cè)4列給出的幾個(gè)可確認(rèn)有脯氨酸蓄積的基因重組水稻體系，于250mM濃度(大約是海水鹽濃度的一半)進(jìn)行耐鹽性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果?？瞻撞糠譃闆](méi)有插入與脯氨酸相關(guān)的基因的對(duì)照，涂黑的部分代表基因重組水稻。耐鹽性實(shí)驗(yàn)按照以眾所周知的存活率為指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法(特開(kāi)平09-266726號(hào)，發(fā)明的名稱(chēng)植物耐鹽性的簡(jiǎn)易評(píng)價(jià)方法)進(jìn)行。沒(méi)有導(dǎo)入與脯氨酸相關(guān)的基因的對(duì)照在鹽處理3天后都枯死了，而與此相反，蓄積脯氨酸的重組水稻在鹽處理的第3天存活率為95％，即使處理5天存活率仍高達(dá)65％。由此看出，通過(guò)利用基因重組提高水稻蓄積脯氨酸的能力可以使耐鹽性提高。
因此，利用本發(fā)明培育的稻科作物進(jìn)一步進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)等詳細(xì)解析，使之品種化，將來(lái)有可能在鹽類(lèi)集積的土壤或沙化土壤中栽培，有望提高糧食生產(chǎn)。另外，對(duì)于應(yīng)付處于發(fā)展中國(guó)家出現(xiàn)的人口增加也帶來(lái)了很大的希望。
利用本發(fā)明可以培育成使脯氨酸蓄積能力提高的基因重組稻科植物。另外，由于利用本方法培育的稻科植物的脯氨酸蓄積量提高，所以提高植物的耐鹽性成為可能。
序列表<110>Hitachi，LTD.
RIKEN日本農(nóng)業(yè)科學(xué)國(guó)際研究中心生物技術(shù)高級(jí)研究所(BRAIN)<120>通過(guò)脯氨酸和它的產(chǎn)物的濃度蓄積研究發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻植物及其耐環(huán)境脅迫的家族。<130>NT01P0353<160>3<210>1<211>2549<212>DNA<213>Oryza sativa L.<220><221>CDS<222>99..2249<300><301>Yumiko Igarashi，Yoshu Yoshiba，YukikaSanada，Kazuko Yamaguchi-Shinozaki，Keishiro Wada，Kazuo Shinozaki<302>Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的特征以及該基因表達(dá)和在Oryza sativa L中耐鹽性之間的關(guān)系。<303>植物分子生物學(xué)<304>33<306>857-865<307>1996-12-03<308>D49714<309>1995-03-16<400>1gcggctgcgg cggcaaggcg gcgagacgtg ggagagggat ttacaggtag agggagaggg 60tggaggagga gaggctgagg ctaggaagcg gtttcgcc atg gcg agc gtc gac ccg 116Met Ala Ser Val Asp Pro1 5tcc cgg agc ttc gtg agg gac gtg aag cgc gtc atc atc aag gtg ggc 164Ser Arg Ser Phe Val Arg Asp Val Lys Arg Val Ile Ile Lys Val Gly10 15 20act gca gtt gtc tcc aga caa gat gga aga ttg gct ttg ggc agg gtt 212Thr Ala Val Val Ser Arg Gln Asp Gly Arg Leu Ala Leu Gly Arg Val25 30 35gga gct ctg tgc gag cag gtt aag gaa ctg aac tct tta gga tac gaa 260Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Glu Leu Asn Ser Leu Gly Tyr Glu40 45 50gtg att ttg gtc acc tca ggt gct gtt gga gtg ggg cga cag cga ctt308Val Ile Leu Val Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Gly Arg Gln Arg Leu55 60 65 70agg tac cgg aag ctt gtc aat agc agc ttt gct gat ctg caa aag cca356Arg Tyr Arg Lys Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu Gln Lys Pro75 80 85cag atg gag tta gat gga aag gct tgt gcc gct gtt ggt cag agt gga404Gln Met Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Ala Val Gly Gln Ser Gly90 95 100ctg atg gct ctt tac gat atg ttg ttt aac caa ctg gat gtc tcg tca452Leu Met Ala Leu Tyr Asp Met Leu Phe Asn Gln Leu Asp Val Ser Ser105 110 115tct caa ctt ctt gtc acc gac agt gat ttt gag aac cca aag ttc cgg500Ser Gln Leu Leu Val Thr Asp Ser Asp Phe Glu Asn Pro Lys Phe Arg120 125 130gag caa ctc act gaa act gtt gag tca tta tta gat ctt aaa gtt ata548Glu Gln Leu Thr Glu Thr Val Glu Ser Leu Leu Asp Leu Lys Val Ile135 140 145 150cca ata ttt aat gaa aat gat gcc atc agc act aga aag gct cca tat596Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Lys Ala Pro Tyr155160 165gag gat tca tct ggt ata ttc tgg gat aat gac agt tta gca gga ctg644Glu Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu Ala Gly Leu170 175 180ttg gca ctg gaa ctg aaa gct gat ctc ctt att ctg ctc agt gat gtg692Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Ser Asp Val185 190 195gat ggg ttg tat agt ggt cca cca agt gaa cca tca tca aaa atc ata740Asp Gly Leu Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Glu Pro Ser Ser Lys Ile Ile200 205 210cac act tat att aaa gaa aag cat cag caa gaa atc act ttt gga gac788His Thr Tyr Ile Lys Glu Lys His Gln Gln Glu Ile Thr Phe Gly Asp215 220 225 230aaa tct cgt gta ggt aga gga ggc atg aca gca aaa gtg aag gct gct836Lys Ser Arg Val Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val Lys Ala Ala235 240 245gtc ttg gct tca aat agc ggc aca cct gtg gtt att aca agt ggg ttt884Val Leu Ala Ser Asn Ser Gly Thr Pro Val Val Ile Thr Ser Gly Phe250 255 260gaa aat cgg agc att ctt aaa gtt ctt cat ggg gaa aaa att ggt act932Glu Asn Arg Ser Ile Leu Lys Val Leu His Gly Glu Lys Ile Gly Thr265 270 275ctc ttt cac aag aat gcg aat ttg tgg gaa tca tct aag gat gtt agt980Leu Phe His Lys Asn Ala Asn Leu Trp Glu Ser Ser Lys Asp Val Ser280 285 290act cgt gag atg gct gtt gcc gca aga gat tgt tca agg cat cta cag1028Thr Arg Glu Met Ala Val Ala Ala Arg Asp Cys Ser Arg His Leu Gln295 300 305 310aat ttg tca tca gag gaa cga aaa aag ata ttg cta gat gtt gca gat1076Asn Leu Ser Ser Glu Glu Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp Val Ala Asp315 320 325gct ttg gag gca aat gag gat tta ata agg tct gag aat gaa gct gat1124Ala Leu Glu Ala Asn Glu Asp Leu Ile Arg Ser Glu Asn Glu Ala Asp330 335 340gta gct gcg gcc caa gtt gct gga tat gag aag cct ttg gtt gct aga1172Val Ala Ala Ala Gln Val Ala Gly Tyr Glu Lys Pro Leu Val Ala Arg345 350 355ttg act ata aaa cca gga aag ata gca agc ctt gca aaa tct att cgt1220Leu Thr Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ala Ser Leu Ala Lys Ser Ile Arg360 365 370acc ctt gca aat atg gaa gac cct ata aac cag ata ctt aaa aag aca1268Thr Leu Ala Asn Met Glu Asp Pro Ile Asn Gln Ile Leu Lys Lys Thr375 380 385 390gag gtt gct gat gat tta gtt ctt gag aaa aca tct tgc cca tta ggt1316Glu Val Ala Asp Asp Leu Val Leu Glu Lys Thr Ser Cys Pro Leu Gly395 400 405gtt ctc tta att gtt ttt gag tcc cga cct gat gcc ttg gtt cag att1364Val Leu Leu Ile Val Phe Glu Ser Arg Pro Asp Ala Leu Val Gln Ile410 415 420gca tct ttg gca att cga agt ggt aat ggt ctt ctc cta aaa ggt gga1412Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Leu Leu Lys Gly Gly425 430 435aaa gaa gct atc aga tca aac acg ata ttg cat aag gtt ata act gat1460Lys Glu Ala Ile Arg Ser Asn Thr Ile Leu His Lys Val Ile Thr Asp440 445 450gct att cct cgt aat gtt ggt gaa aaa ctt att ggc ctt gtt aca act1508Ala Ile Pro Arg Asn Val Gly Glu Lys Leu Ile Gly Leu Val Thr Thr455 460 465 470aga gat gag atc gca gat ttg cta aag ctt gat gat gtc att gat ctt1556Arg Asp Glu Ile Ala Asp Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val Ile Asp Leu475 480 485gtc act cca aga gga agt aat aag ctt gtc tct caa atc aag gcg tca1604Val Thr Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Ser Gln Ile Lys Ala Ser490 495 500act aag att cct gtt ctt ggg cat gct gat ggt ata tgc cac gta tat1652Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp Gly Ile Cys His Val Tyr505 510 515att gac aaa tca gct gac atg gat atg gca aaa ctt att gta atg gat1700Ile Asp Lys Ser Ala Asp Met Asp Met Ala Lys Leu Ile Val Met Asp520 525 530gca aaa act gat tac cca gca gcc tgc aat gca atg gag acc tta cta1748Ala Lys Thr Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn Ala Met Glu Thr Leu Leu535 540 545550gtt cat aag gat ctt atg aag agt cca ggc ctt gac gac ata tta gta1796Val His Lys Asp Leu Met Lys Ser Pro Gly Leu Asp Asp Ile Leu Val555 560 565gca cta aaa aca gaa gga gtt aat att tat ggt gga cct att gcg cac1844Ala Leu Lys Thr Glu Gly Val Asn Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ala His570 575 580aaa gct ctg gga ttt cca aaa gct gtt tca ttt cat cat gag tat agt1892Lys Ala Leu Gly Phe Pro Lys Ala Val Ser Phe His His Glu Tyr Ser585 590 595tct atg gcc tgc act gtt gag ttt gtt gat gat gtt caa tca gca att1940Ser Met Ala Cys Thr Val Glu Phe Val Asp Asp Val Gln Ser Ala Ile600 605 610gac cat att cat cgt tat gga agt gct cat aca gat tgt atc gtc act1988Asp His Ile His Arg Tyr Gly Ser Ala His Thr Asp Cys Ile Val Thr615 620 625 630aca gat gat aag gta gca gag act ttt cta cgc aga gtt gat agt gct2036Thr Asp Asp Lys Val Ala Glu Thr Phe Leu Arg Arg Val Asp Ser Ala635 640 645gct gta ttt cat aat gca agt acg aga ttc tct gat ggg gct cgt ttt2084Ala Val Phe His Asn Ala Ser Thr Arg Phe Ser Asp Gly Ala Arg Phe650 655 660gga ttg ggt gct gag gtt ggc ata agc aca ggg cgt atc cat gcc cgt2132Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile His Ala Arg665 670 675gga cca gtg ggt gtt gaa ggt ctc tta act aca cga tgg atc ttg cga2180Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp Ile Leu Arg680 685 690gga cgt ggg caa gtg gtg aat ggt gac aag gat gtc gtg tac acc cat2228Gly Arg Gly Gln Val Val Asn Gly Asp Lys Asp Val Val Tyr Thr His695 700 705 710aag agt ctt cct ttg caa tgaggtcaaa tgctcctttt agcctgttca 2276Lys Ser Leu Pro Leu Gln715ggagtaggtg aatatccttt taagaatgga ttgactactt tattttgtca tcttgtacaa 2336gcatcttatt gcggcattcc gatggattat tgattttggg ggttcccact ttcaaatgtg 2396acaccaaaaa taaattcatc agttctgaga gcaagatttt ggaggttcag cttctccatg 2456taataagtaa attcagttct gagaacttgt gtaccaacgc gctatgttgc ttgtaatgag 2516cgatactaac atctgtgatt gcacatatac taa 2549<210>2<211>2571<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>CDS<222>107...2260<301>Yoshu Yoshiba，Tomohiro Kiyasue，Takeshi Katagiri，HirokoUeda，Tsuyoshi Mizoguchi，Kazuko Yamaguchi-Shinozaki，KeishiroWada，Yoshinori Harada，Kazuo Shinozaki<302>Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的誘導(dǎo)和脯氨酸在處于滲透脅迫下的Arabidopsis thaliana中蓄積之間的關(guān)系。<303>The Plant Journal<304>7<305>5<306>751-760<307>1995-01-20<308>D32138<309>1994-07-12<400>2ctgatattta ttttcttacc ttaaatacga cggtgcttca ctgagtccga ctcagttaac 60tcgttcctct ctctgtgtgt ggttttggta gacgacgacg acgata atg gag gag 115Met Glu Glu1cta gat cgt tca cgt gct ttt gcc aga gac gtc aaa cgt atc gtc gtt163Leu Asp Arg Ser Arg Ala Phe Ala Arg Asp Val Lys Arg Ile Val Val5 10 15aag gtt ggg aca gca gtt gtt act gga aaa ggt gga aga ttg gct ctt211Lys Val Gly Thr Ala Val Val Thr Gly Lys Gly Gly Arg Leu Ala Leu20 25 30 35ggt cgt tta gga gca ctg tgt gaa cag ctt gcg gaa tta aac tcg gat259Gly Arg Leu Gly Ala Leu Cys Glu Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ser Asp40 45 50gga ttt gag gtg ata ttg gtg tca tct ggt gcg gtt ggt ctt ggc agg307Gly Phe Glu Val Ile Leu Val Ser Ser Gly Ala Val Gly Leu Gly Arg55 60 65caa agg ctt cgt tat cga caa tta gtc aat agc agc ttt gcg gat ctt355Gln Arg Leu Arg Tyr Arg Gln Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu70 75 80cag aag cct cag act gaa ctt gat ggg aag gct tgt gct ggt gtt gga403Gln Lys Pro Gln Thr Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Gly Val Gly85 90 95caa agc agt ctt atg gct tac tat gag act atg ttt gac cag ctt gat451Gln Ser Ser Leu Met Ala Tyr Tyr Glu Thr Met Phe Asp Gln Leu Asp100 105 110 115gtg acg gca gct caa ctt ctg gtg aat gac agt agt ttt aga gac aag499Val Thr Ala Ala Gln Leu Leu Val Asn Asp Ser Ser Phe Arg Asp Lys120 125 130gat ttc agg aag caa ctt aat gaa act gtc aag tct atg ctt gat ttg547Asp Phe Arg Lys Gln Leu Asn Glu Thr Val Lys Ser Met Leu Asp Leu135 140 145agg gtt att cca att ttc aat gag aat gat gct att agc acc cga aga595Arg Val Ile Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Arg150 155 160gcc cca tat cag gat tct tct ggt att ttc tgg gat aac gat agc tta643Ala Pro Tyr Gln Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu165 170 175gct gct cta ctg gcg ttg gaa ctg aaa gct gat ctt ctg att ctt ctg691Ala Ala Leu Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu180 185 190 195agc gat gtt gaa ggt ctt tac aca ggc cct cca agt gat cct aac tca739Ser Asp Val Glu Gly Leu Tyr Thr Gly Pro Pro Ser Asp Pro Asn Ser200 205 210aag ttg atc cac act ttt gtt aaa gaa aaa cat caa gat gag att aca787Lys Leu Ile His Thr Phe Val Lys Glu Lys His Gln Asp Glu Ile Thr215 220 225ttc ggc gac aaa tca aga tta ggg aga ggg ggt atg act gca aaa gtc835Phe Gly Asp Lys Ser Arg Leu Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val230 235 240aaa gct gca gtc aat gca gct tat gct ggg att cct gtc atc ata acc883Lys Ala Ala Val Asn Ala Ala Tyr Ala Gly Ile Pro Val Ile Ile Thr245 250 255agt ggg tat tca gct gag aac ata gat aaa gtc ctc aga gga cta cgt931Ser Gly Tyr Ser Ala Glu Asn Ile Asp Lys Val Leu Arg Gly Leu Arg260 265 270 275gtt gga acc ttg ttt cat caa gat gct cgt tta tgg gct ccg atc aca979Val Gly Thr Leu Phe His Gln Asp Ala Arg Leu Trp Ala Pro Ile Thr280 285 290gat tct aat gct cgt gac atg gca gtt gct gcg agg gaa agt tcc aga1027Asp Ser Asn Ala Arg Asp Met Ala Val Ala Ala Arg Glu Ser Ser Arg295 300 305aag ctt cag gcc tta tct tcg gaa gac agg aaa aaa att ctg ctt gat1075Lys Leu Gln Ala Leu Ser Ser Glu Asp Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp310 315320att gcc gat gcc ctt gaa gca aat gtt act aca atc aaa gct gag aat1123Ile Ala Asp Ala Leu Glu Ala Asn Val Thr Thr Ile Lys Ala Glu Asn325 330 335gag tta gat gta gct tct gca caa gag gct ggg ttg gaa gag tca atg1171Glu Leu Asp Val Ala Ser Ala Gln Glu Ala Gly Leu Glu Glu Ser Met340 345 350 355gtg gct cgc tta gtt atg aca cct gga aag atc tcg agc ctt gca gct1219Val Ala Arg Leu Val Met Thr Pro Gly Lys Ile Ser Ser Leu Ala Ala360 365 370tca gtt cgt aag cta gct gat atg gaa gat cca atc ggc cgt gtt tta1267Ser Val Arg Lys Leu Ala Asp Met Glu Asp Pro Ile Gly Arg Val Leu375 380 385aag aaa aca gag gtg gca gat ggt ctt gtc tta gag aag acc tca tca1315Lys Lys Thr Glu Val Ala Asp Gly Leu Val Leu Glu Lys Thr Ser Ser390 395 400cca tta ggc gta ctt ctg att gtt ttt gaa tcc cga cct gat gca ctt1363Pro Leu Gly Val Leu Leu Ile Val Phe Glu Ser Arg Pro Asp Ala Leu405 410 415gta cag ata gct tca ctt gcc atc cgt agt gga aat ggt ctt ctg ctg1411Val Gln Ile Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Leu Leu420 425 430 435aag ggt gga aag gag gcc cgg cga tca aat gct atc tta cac aag gtg1459Lys Gly Gly Lys Glu Ala Arg Arg Ser Asn Ala Ile Leu His Lys Val440 445 450atc act gat gca att cca gag act gtt ggg ggt aaa ctc att gga ctt1507Ile Thr Asp Ala Ile Pro Glu Thr Val Gly Gly Lys Leu Ile Gly Leu455 460 465gtg act tca aga gaa gag att cct gat ttg ctt aag ctt gat gac gtt1555Val Thr Ser Arg Glu Glu Ile Pro Asp Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val470 475 480atc gat ctt gtg atc cca aga gga agc aac aag ctt gtt act cag ata1603Ile Asp Leu Val Ile Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Thr Gln Ile485 490 495aaa aat act aca aaa atc cct gtg cta ggt cat gct gat gga atc tgt1651Lys Asn Thr Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp Gly Ile Cys500 505 510 515cat gta tat gtc gac aag gct tgt gat acg gat atg gca aag cgc ata1699His Val Tyr Val Asp Lys Ala Cys Asp Thr Asp Met Ala Lys Arg Ile520 525 530gtt tct gat gca aag ttg gac tat cca gca gcc tgt aat gcg atg gaa1747Val Ser Asp Ala Lys Leu Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn Ala Met Glu535 540 545acc ctt ctt gtg cat aag gat cta gag cag aat gct gtg ctt aat gag1795Thr Leu Leu Val His Lys Asp Leu Glu Gln Asn Ala Val Leu Asn Glu550 555 560ctt att ttt gct ctg cag agc aat gga gtc act ttg tat ggt gga cca1843Leu Ile Phe Ala Leu Gln Ser Asn Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Pro565 570 575agg gca agt aag ata ctg aac ata cca gaa gca cgg tca ttc aac cat1891Arg Ala Ser Lys Ile Leu Asn Ile Pro Glu Ala Arg Ser Phe Asn His580 585 590 595gag tac tgt gcc aag gct tgc act gtt gaa gtt gta gaa gac gtt tat1939Glu Tyr Cys Ala Lys Ala Cys Thr Val Glu Val Val Glu Asp Val Tyr600 605 610ggt gct ata gat cac att cac cga cat ggg agt gca cac aca gac tgc1987Gly Ala Ile Asp His Ile His Arg His Gly Ser Ala His Thr Asp Cys615 620 625att gtg aca gag gat cac gaa gtt gca gag cta ttc ctt cgc caa gtg2035Ile Val Thr Glu Asp His Glu Val Ala Glu Leu Phe Leu Arg Gln Val630635 640gat agc gct gct gtg ttc cac aac gcc agc aca aga ttc tca gat ggt2083Asp Ser Ala Ala Val Phe His Asn Ala Ser Thr Arg Phe Ser Asp Gly645 650 655ttc cga ttt gga ctt ggt gca gag gtg ggg gta agc acg ggc agg atc2131Phe Arg Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Val Ser Thr Gly Arg Ile660 665 670 675cat gct cgt ggt cca gtc ggg gtc gaa gga tta ctt aca acg aga tgg2179His Ala Arg Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp680 685 690ata atg aga gga aaa gga caa gtt gtc gac gga gac aat gga att gtt2227Ile Met Arg Gly Lys Gly Gln Val Val Asp Gly Asp Asn Gly Ile Val695 700 705tac acc cat cag gac att ccc atc caa gct taaacaagac ttccgagtgt 2277Tyr Thr His Gln Asp Ile Pro Ile Gln Ala710 715gtgtttgtgt atttggttga gacttgagga gagacacaga ggaggatggg cttttttgtt 2337tcctctctgc ttagtactca tatcctatca ttattattat tactactact tattattgaa 2397accctcgctt atgtagtggt tttgatttag ggttaggatt gcaccaaaaa taagatccac 2457tttaccactt agtcttgctc ataagtacga tgaagaacat ttaattagct tctcttcttg 2517tcattgtaag ctacctacac atttctgatc tttatcaaga tactactact tttc2571<210>3<211>1833<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>CDS<222>113...1612<301>Tomohiro Kiyasue，Yoshu Yoshiba，KazukoYamaguchi-Shinozaki，Kazuo Shinozaki<302>Title編碼線(xiàn)粒體脯氨酸脫氫酶的核基因，參與Arabidopsis中脯氨酸代謝的酶，該酶受脯氨酸的正調(diào)節(jié)，受脫水的負(fù)調(diào)節(jié)。<303>The Plant Cell<304>8<306>1323-1335<307>1996-05-27<308>D83025<309>1995-12-25<400>3agcgtttaga aaaaaacagc gataaaaccg aaacatcaag caaacaaaaa aaaaagagaa 60gagaaattat ttttttttgt tttcgttttc aaaaacaaaa tctttgaatt tt atg gca 118Met Ala1acc cgt ctt ctc cga aca aac ttt atc cgg cga tct tac cgt tta ccc166Thr Arg Leu Leu Arg Thr Asn Phe Ile Arg Arg Ser Tyr Arg Leu Pro
5 10 15gct ttt agc ccg gtg ggt cct ccc acc gtg act gct tcc acc gcc gtc214Ala Phe Ser Pro Val Gly Pro Pro Thr Val Thr Ala Ser Thr Ala Val20 25 30gtc ccg gag att ctc tcc ttt gga caa caa gca ccg gaa cca cct ctt262Val Pro Glu Ile Leu Ser Phe Gly Gln Gln Ala Pro Glu Pro Pro Leu35 40 45 50cac cac cca aaa ccc acc gag caa tct cac gat ggt ctc gat ctc tcc310His His Pro Lys Pro Thr Glu Gln Ser His Asp Gly Leu Asp Leu Ser55 60 65gat caa gcc cgt ctt ttc tcc tct atc cca ace tct gat ctc ctc cgt358Asp Gln Ala Arg Leu Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Asp Leu Leu Arg70 75 80tcc acc gcc gtg ttg cat gcg gcg gcg ata ggt cct atg gtc gac cta406Ser Thr Ala Val Leu His Ala Ala Ala Ile Gly Pro Met Val Asp Leu85 90 95ggg acg tgg gtc atg agc tct aaa ctt atg gac gct tcg gtg acg cgt454Gly Thr Trp Val Met Ser Ser Lys Leu Met Asp Ala Ser Val Thr Arg100 105 110ggc atg gtt tta ggg ctt gtg aaa agt acg ttt tat gac cat ttt tgc502Gly Met Val Leu Gly Leu Val Lys Ser Thr Phe Tyr Asp His Phe Cys115 120 125 130gcc ggt gaa gat gcc gac gca gcc get gag cgc gtg aga agc gtt tat550Ala Gly Glu Asp Ala Asp Ala Ala Ala Glu Arg Val Arg Ser Val Tyr135 140 145gaa gct act ggt ctt aaa ggg atg ctt gtc tat ggc gtc gaa cac gcc598Glu Ala Thr Gly Leu Lys Gly Met Leu Val Tyr Gly Val Glu His Ala150 155 160gat gac gct gta tct tgt gat gat aac atg caa caa ttc att cga acc646Asp Asp Ala Val Ser Cys Asp Asp Asn Met Gln Gln Phe Ile Arg Thr165 170 175att gaa gct gcc aaa tct tta cea aca tct cac ttt agc tca gtg gtt694Ile Glu Ala Ala Lys Ser Leu Pro Thr Ser His Phe Ser Ser Val Val180 185 190gtg aag ata act gcc att tgt cca att agt ctt ctg aaa cga gtg agc742Val Lys Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ile Ser Leu Leu Lys Arg Val Ser195 200 205 210gat ctg ctg cgg tgg gaa tac aaa agt ccg aac ttc aaa ctc tca tgg790Asp Leu Leu Arg Trp Glu Tyr Lys Ser Pro Asn Phe Lys Leu Ser Trp215 220 225aag ctc aaa tcg ttt ccg gtt ttc tcc gaa tcg agt cct ctc tac cac838Lys Leu Lys Ser Phe Pro Val Phe Ser Glu Ser Ser Pro Leu Tyr His
230 235 240aca aac tca gaa ccg gaa ccg tta acc gcg gaa gaa gaa agg gag ctc886Thr Asn Ser Glu Pro Glu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu245 250 255gaa gca gct cat gga agg att caa gaa atc tgt agg aaa tgc caa gag934Glu Ala Ala His Gly Arg Ile Gln Glu Ile Cys Arg Lys Cys Gln Glu260 265 270tcc aat gta cca ttg ttg att gat gcg gaa gac aca atc ctc caa ccc982Ser Asn Val Pro Leu Leu Ile Asp Ala Glu Asp Thr Ile Leu Gln Pro275 280 285 290gcg atc gat tac atg gct tat tca tcg gcg atc atg ttc aat gct gac1030Ala Ile Asp Tyr Met Ala Tyr Ser Ser Ala Ile Met Phe Asn Ala Asp295 300 305aaa gac cga cca atc gtt tac aac acg att cag gcg tac ttg aga gac1078Lys Asp Arg Pro Ile Val Tyr Asn Thr Ile Gln Ala Tyr Leu Arg Asp310 315 320gcc ggt gag aga ctg cat ttg gca gta caa aat gct gag aaa gag aat1126Ala Gly Glu Arg Leu His Leu Ala Val Gln Asn Ala Glu Lys Glu Asn325 330 335gtt cct atg ggg ttc aag ttg gtg aga ggg gct tac atg tct agc gaa1174Val Pro Met Gly Phe Lys Leu Val Arg Gly Ala Tyr Met Ser Ser Glu
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1.稻科植物，其特征是，導(dǎo)入了含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
2.稻科植物，其特征是，導(dǎo)入了含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsisthaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
3.稻科植物，其特征是導(dǎo)入了含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向堿基序列)基因。
4.稻科植物，其特征是，導(dǎo)入了含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS基因或含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因。
5.稻科植物，其特征是，將含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS基因或含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因一前一后地連接后導(dǎo)入。
6.載體，其特征是，插入了含有序列號(hào)1記載的序列的水稻P5CS基因、含有序列號(hào)2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列號(hào)3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因中的任一個(gè)基因，或是將水稻或Arabidopsis thaliana P5CS基因與上述的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因一前一后地連接后插入。
7.稻科植物，其特征是將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖后從愈傷組織再分化植物體培育的。
8.稻科植物，其特征是將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的原生質(zhì)體，從使該原生質(zhì)體增殖后的集群中使植物體再分化培育的。
9.稻科植物，其特征是與通過(guò)基因操作將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入后獲得的稻科植物進(jìn)行雜交得到的，導(dǎo)入了將權(quán)利要求6記載的載體。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)記載的稻科植物，是水稻。
11.稻科植物的種子，其特征是從權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)記載的稻科植物收獲的。
12.稻科植物的種子，其特征是權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)記載的稻科植物是水稻，種子是從上述水稻收獲的。
13.稻科植物的生產(chǎn)方法，其特征是利用根癌土壤桿菌將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入來(lái)自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖后，從上述的愈傷組織使植物體再分化。
14.稻科植物的生產(chǎn)方法，其特征是通過(guò)電穿孔將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入取自稻科植物的原生質(zhì)體，從使該原生質(zhì)體增殖后的集群中使植物體再分化。
15.稻科植物的生產(chǎn)方法，其特征是與通過(guò)基因操作將權(quán)利要求6記載的載體導(dǎo)入后獲得的稻科植物進(jìn)行雜交，導(dǎo)入了權(quán)利要求6記載的載體。
全文摘要
為了獲得通過(guò)提高脯氨酸蓄積能力來(lái)提高耐鹽性水平的轉(zhuǎn)化稻科植物，利用基因操作技術(shù)將水稻P5CS(Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶)基因或Arabidopsis thaliana P5CS基因與Arabidopsis thaliana ProDH基因(脯氨酸脫氫酶)的反義(帶有反向堿基序列)基因?qū)氲降究浦参镏小?br> 文檔編號(hào)A01H5/00GK1390939SQ0114407
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2001年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者吉羽洋周, 篠崎和子, 篠崎一雄 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所, 獨(dú)立行政法人國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心, 理化學(xué)研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)