專利名稱：一種預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用生物工程領(lǐng)域中的技術(shù)手段預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從McPherron等(1993)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)基因以來(lái)，GDF9基因在小鼠、大鼠、綿羊、人等物種中相繼被克隆分析。Incerti等(1994)用小鼠的GDF9的cDNA作為探針，從小鼠的129SvEv基因組文庫(kù)中分離了包含GDF9基因的大于20kb的序列，研究發(fā)現(xiàn)GDF9基因由一個(gè)2.9kb的內(nèi)含子隔開(kāi)的兩個(gè)外顯子所編碼。McGrath等(1995)報(bào)道GDF9在成年小鼠卵巢中特異性表達(dá)，使用原位雜交方法，GDF9 mRNA的表達(dá)被唯一定位在卵母細(xì)胞上。Dong等(1996)在對(duì)小鼠發(fā)育中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員的功能分析中，識(shí)別了一個(gè)新的家族成員——生長(zhǎng)分化因子9，它對(duì)卵巢卵泡發(fā)生是必需的；GDF9 mRNA僅在卵母細(xì)胞中表達(dá)；GDF9不足的雌性小鼠，卵泡發(fā)育受阻，導(dǎo)致完全不育；GDF9是體內(nèi)體細(xì)胞功能所必需的第一個(gè)卵母細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子。Jaatinen等(1999)報(bào)道大鼠GDF9多肽長(zhǎng)度是440個(gè)氨基酸，成熟肽是135個(gè)氨基酸，GDF9蛋白在大鼠卵巢初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中高度表達(dá)，表明它主要在卵泡發(fā)生早期起作用。Bodensteiner等(1999)在小鼠和人的GDF9基因外顯子2同源區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并用該引物對(duì)綿羊基因組進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)噬菌斑雜交對(duì)綿羊的GDF9基因文庫(kù)進(jìn)行鏡檢，分離出綿羊GDF9基因全序列(GenBank登錄號(hào)AF078545)。Bodensteiner等(2000)首次證實(shí)GDF9 mRNA表達(dá)被唯一定位到綿羊卵母細(xì)胞。Sadighi等(2002)根據(jù)綿羊的最新基因圖譜，將GDF9基因定位在第5號(hào)染色體的BM7247到BMS2258之間。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用羊GDF9基因多態(tài)性方便、可靠地預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法。
一種預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析，檢測(cè)GDF9基因的第152位堿基是A還是G。
GDF9基因的第152位堿基是A或G，導(dǎo)致了其編碼氨基酸的不同，使該位點(diǎn)的氨基酸殘基為天冬酰胺或天冬氨酸。
所述對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析的方法是用下述引物對(duì)羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增
F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′然后進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。
引物是根據(jù)Bodensteiner等(1999)報(bào)道的綿羊GDF9基因全序，用Oligo 6.0軟件在外顯子1處設(shè)計(jì)的，片段為162bp，當(dāng)?shù)?52位堿基是A時(shí)，其純合型羊的基因型為AA；當(dāng)?shù)?52位堿基是G時(shí)，其純合型羊的基因型為BB；雜合型羊的基因型為AB；基因型為AA的產(chǎn)羔數(shù)大于AB型。
所述單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)方法進(jìn)行。
本發(fā)明的方法特別適用于綿羊產(chǎn)羔數(shù)的預(yù)測(cè)。尤其是在小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？说绕贩N中得到了充分驗(yàn)證。4個(gè)綿羊品種均檢測(cè)到AA基因型，AB基因型只出現(xiàn)在湖羊、多賽特羊和薩福克羊中，僅在薩福克羊中檢測(cè)到BB基因型；在4個(gè)綿羊品種中，A等位基因頻率明顯高于B等位基因頻率。
本發(fā)明巧妙地利用PCR-SSCP法檢測(cè)羊GDF9基因的SNPs，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩福克羊GDF9基因的多態(tài)性。并以生長(zhǎng)分化因子9基因作為候選基因，發(fā)現(xiàn)了其與羊高繁殖力之間的關(guān)系。用本發(fā)明引物擴(kuò)增的片段的AA型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)之間存在極顯著的正相關(guān)。為綿羊繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供了依據(jù)。本發(fā)明的方法在羊，尤其是綿羊的育種中具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，并且在畜牧繁育中將得到廣泛應(yīng)用。


圖1為用本發(fā)明引物對(duì)不同綿羊品種擴(kuò)增片段的SSCP分析圖2為綿羊GDF9基因cDNA 152處AA和BB基因型的序列比較具體實(shí)施方式
本發(fā)明中所用的材料及實(shí)驗(yàn)方法1、實(shí)驗(yàn)材料小尾寒羊50只、多賽特羊50只、薩福克羊50只，血樣均采自北京市興綠原農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司種羊場(chǎng)(北京市順義區(qū)楊鎮(zhèn))；湖羊130只血樣采自浙江省余杭湖羊場(chǎng)。具有產(chǎn)羔記錄的小尾寒羊母羊(150只)血樣采自山東省嘉祥種羊場(chǎng)。所采血樣均為10ml/只，血樣用ACD抗凝，-20℃凍存。
2、羊血液中DNA的提取冷凍血液在室溫融化以后，取700μl移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動(dòng)，12000g離心15分鐘，棄去上清液
↓再取700μl血液移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動(dòng)，12000g離心15分鐘，棄去上清液↓加入600μl DNA抽提緩沖液，重懸沉淀物↓加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，混勻，用封口膜封住↓55℃水浴過(guò)夜↓將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，直至兩相混合形成乳濁液，12000g離心，10分鐘↓取上清，再加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心，10分鐘↓取上清，加入等體積酚氯仿，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心，10分鐘↓取上清，加入等體積氯仿，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心10分鐘↓取上清，加入2倍體積的無(wú)水冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，可見(jiàn)白色DNA沉淀↓將DNA挑出放到1.5ml離心管中，12000g離心10分鐘，去上清，然后加4℃預(yù)冷的70％乙醇洗兩次，12000g離心10分鐘，去上清↓將DNA干燥(注意不能太干燥)↓加適量TE溶解3、數(shù)據(jù)處理配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較產(chǎn)羔數(shù)在標(biāo)記基因型之間的差異yij＝μ+Gi+eij其中yij為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值(第1胎產(chǎn)羔數(shù)，第2胎產(chǎn)羔數(shù))；μ為群體平均值；Gi為第i種標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；eij為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用SAS的GLM(General LinearModel)過(guò)程完成。
引物設(shè)計(jì)根據(jù)Bodensteiner等(1999)報(bào)道的綿羊GDF9基因全序，用Oligo 6.0軟件在外顯子1處設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增片段為162bp，引物由上海生工生物工程公司合成。
引物F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′本研究建立的最佳PCR條件如下反應(yīng)體系為25μl10×緩沖液2.5μl，Mg2+終濃度為2.0mmol/L，引物50ng，dNTP終濃度為200μmol/L，1U TaqDNA聚合酶，模板100ng。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，63℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
4、SSCP分析2μl PCR產(chǎn)物和5μl的上樣緩沖液(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)，98℃變性10min，迅速插入冰中，放置5min，使之保持變性狀態(tài)。樣品在14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)中電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶。
5、克隆測(cè)序經(jīng)SSCP分析后，不同純合基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳并回收，回收后的DNA用pMD-18T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，酶切鑒定后，在PE377測(cè)序儀上測(cè)序。
實(shí)施例1、采用PCR-SSCP技術(shù)分析GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？搜?個(gè)綿羊品種的多態(tài)性。
1、PCR擴(kuò)增用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)不同綿羊品種的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性好，可直接進(jìn)行SSCP分析。
2、SSCP檢測(cè)結(jié)果用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)，在擴(kuò)增片段上發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB和BB，結(jié)果如圖1所示，圖中1，3，5，7為AB型；2為BB型；4，6為AA型。
3、不同基因型的純合子個(gè)體的克隆測(cè)序?qū)兒献觽€(gè)體進(jìn)行克隆測(cè)序，如圖2所示，結(jié)果表明，AA型與GenBank(AF078545)中序列一致，而B(niǎo)B型與AA型相比在cDNA的第152處有一個(gè)A→G的單堿基突變，導(dǎo)致第51個(gè)氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷?br> 4、不同綿羊品種GDF9基因型頻率和基因頻率分析對(duì)小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？搜蜻M(jìn)行了GDF9基因型檢測(cè)，計(jì)算了不同綿羊品種的基因型頻率和基因頻率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 4個(gè)綿羊品種GDF9基因的基因頻率和基因型頻率

由表1可見(jiàn)4個(gè)綿羊品種均檢測(cè)到AA基因型，AB基因型只出現(xiàn)在湖羊、多賽特羊和薩?？搜蛑?，僅在薩?？搜蛑袡z測(cè)到BB基因型；在4個(gè)綿羊品種中，A等位基因頻率明顯高于B等位基因頻率。
實(shí)施例2 GDF9基因擴(kuò)增片段與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析1、GDF9基因擴(kuò)增片段對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的影響方差分析表明，GDF9基因擴(kuò)增片段對(duì)小尾寒羊第一胎產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P＜0.05)，對(duì)第二胎產(chǎn)羔數(shù)有極顯著影響(P＜0.01)。
2、GDF9基因擴(kuò)增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤GDF9基因擴(kuò)增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值(LSM)及標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，擴(kuò)增片段兩種基因型第一胎產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值的關(guān)系是AA＞AB，并且兩者之間差異顯著(P＜0.05)，AA型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)比AB型多0.30只。兩種基因型第二胎產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值的關(guān)系也是AA＞AB，并且兩者之間差異極顯著(P＜0.01)，AA型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)比AB型多0.77只。
表2 GDF9基因擴(kuò)增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

注同一位點(diǎn)同一性狀具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著，小寫(xiě)為顯著(P＜0.05)，大寫(xiě)為極顯著(P＜0.01)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析，檢測(cè)GDF9基因的第152位堿基是A還是G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析的方法是用下述引物對(duì)羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′然后進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于當(dāng)?shù)?52位堿基是A時(shí)，其純合型羊的基因型為AA；當(dāng)?shù)?52位堿基是G時(shí)，其純合型羊的基因型為BB；雜合型羊的基因型為AB；基因型為AA的產(chǎn)羔數(shù)大于AB型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)方法進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述羊?yàn)榫d羊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述羊的品種為小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？恕?br> 7.權(quán)利要求1所述的方法在羊畜牧繁育中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的方法在羊育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用。目的是提供一種利用羊GDF9基因多態(tài)性方便、可靠地預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法。本發(fā)明預(yù)測(cè)羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析，檢測(cè)GDF9基因的第152位堿基是A還是G。所述對(duì)羊GDF9基因多態(tài)性進(jìn)行分析的方法是用下述引物對(duì)羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′，R5′GCCTTATAGA GCCTCTTCA TGT3′，然后進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。本發(fā)明的方法在羊，尤其是綿羊的育種中具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，并且在畜牧繁育中將得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61D19/00GK1523119SQ03104508
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月17日
發(fā)明者儲(chǔ)明星, 李碧俠, 王金玉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所