專利名稱：用于獲得菊苣屬重組植物的方法以及用該方法獲得的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得菊苣屬重組植物的方法，其中所述植物適合于促成栽培并具有通過分表達(dá)別源于菊苣(Cichorium intybus L)和苦苣(Cichorium endivia L)的表型性狀的組合而確定的表型。
適合促成栽培的菊苣種植物也叫做萵苣菜(endives)，在整個(gè)歐洲和亞洲的溫和地區(qū)廣泛栽培。它是一種十分多枝的植物，堅(jiān)硬的分枝相互間隔開。較低的葉通常是全裂的，裂片或節(jié)片排列在兩邊，間隔開且通常倒生，有一個(gè)末端裂片；上部的葉是全緣的，其基部環(huán)繞著莖干，較高處的葉簡(jiǎn)化為相對(duì)小的苞葉。根薄壁組織細(xì)胞從一些物質(zhì)中產(chǎn)生多糖(淀粉、菊粉等)，其中所述物質(zhì)源于合成它們的綠色器官。在生長期間，隨著多糖在其中聚積，根的薄壁組織增生而導(dǎo)致不斷向外膨脹，以致形成塊莖狀根(tuberous root)。
菊苣種以及更具體地該種的一些品種如Witloof品種產(chǎn)生塊莖狀根的能力使這類植物適合在黑暗中通過“促成”栽培。21天的促成栽培包括將萵苣菜在裝有營養(yǎng)液的盆中培養(yǎng)，該營養(yǎng)液處于約18℃至21℃的溫度，同時(shí)空氣溫度比營養(yǎng)液溫度低1℃到3℃。通過在黑暗中促成培育萵苣菜以便使得葉萎蔫以產(chǎn)生葉的外緣僅有輕微黃色的基本上是白色的成熟植物。
萵苣菜生產(chǎn)者正在尋找新的產(chǎn)品以便使他們的產(chǎn)品多樣化以及使他們能向最終消費(fèi)者提供多種萵苣菜。
傳統(tǒng)上通過大規(guī)模地在堆滿盆的室內(nèi)促成生產(chǎn)萵苣菜，其中盆內(nèi)置有浸沒在營養(yǎng)液中的萵苣菜根，處于黑暗條件、在溶液和室溫條件下，并處于精確控制的濕度測(cè)定條件下進(jìn)行。因此，萵苣菜的促成栽培在設(shè)備和勞力上都需要重大的經(jīng)濟(jì)投資來完成播種、根收獲以及在培養(yǎng)室內(nèi)促成的多個(gè)分別的步驟以便大規(guī)模地生產(chǎn)萵苣菜。
通過促成栽培萵苣菜的目的在于生產(chǎn)用于銷售的菊苣。菊苣基本上由在黑暗中萎蔫、源于根頸的葉組成。促成培養(yǎng)周期處于高度精確的且計(jì)劃了的培養(yǎng)條件、周期以及進(jìn)度表的控制下以便優(yōu)化生產(chǎn)成本。
為了給消費(fèi)者提供新穎而多樣的能以合理價(jià)錢銷售的源于萵苣菜的植物，要求新穎的植物應(yīng)適于目前傳統(tǒng)上用于萵苣菜的生產(chǎn)條件。實(shí)際上，特定地適用于菊苣種新植物生產(chǎn)的新工業(yè)投資將不能與市場(chǎng)在經(jīng)濟(jì)上達(dá)到一致。因而，任何想通過促成生產(chǎn)的新品種應(yīng)該能夠整合進(jìn)已開發(fā)的萵苣菜生產(chǎn)體系。
據(jù)申請(qǐng)人所知，在現(xiàn)有技術(shù)中從來沒有描述過任何這樣的在具有塊莖狀根的菊苣與苦苣之間進(jìn)行重組的方法，其中所述的方法可用于商業(yè)實(shí)用性植物的生產(chǎn)并且該植物具有由每個(gè)初始親本品系的遺傳特征表達(dá)的表型特征的組合。
菊苣和苦苣的F1代種間雜種已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)有描述，尤其可注意到由Charles RICK在1953年實(shí)現(xiàn)的雜交(1953年，Proceedings of theAmerican Society for Horticultural Science，61卷，459-466頁)，CharlesRICK已經(jīng)描述在這兩個(gè)物種之間在田間的雜交事件。RICK也描述了在田間通過F1代植物的自體受精生產(chǎn)獲得F2代植物。RICK觀察到F2代植物表達(dá)的表型特征特別是關(guān)于它們的壯實(shí)性有很大的可變性。上面所提到的作者從中推斷，因?yàn)樗鼈兿喈?dāng)大地減少了致育性和壯實(shí)水平，分別源于菊苣及萵苣菜的基因的許多組合不是“協(xié)調(diào)的”。據(jù)RICK所說，在菊苣和苦苣之間有幾乎不能逾越的基因障礙，雖然在這兩物種之間能例外地觀察到一些基因交換(見Rick中的464頁，1953年)。RICK也觀察到菊苣和苦苣兩者基因組的不同，從而它們?cè)谕ㄟ^自體受精的后代中產(chǎn)生了不完全的減數(shù)分裂和不育。
第16世紀(jì)在意大利通過偶然雜交(Annemieke M KiersEndive，Chicory and their wild relatives，Gorteria Supplément 5，2000年7月)，“Castel Franco”型F1代雜種植物長期以來已經(jīng)被視為在那些物種之間基因交換的唯一實(shí)例。最近的分子研究(Kiers，2000年)顯示兩物種并不是相關(guān)的，而且Castel Franco型與菊苣相關(guān)。
在現(xiàn)有技術(shù)也已經(jīng)描述了將菊苣和苦苣的F1代雜種隨后通過克隆專門在體外繁殖，特別是用于胚胎發(fā)育研究的目的(Blervaq A.S.等，1995年，Protoplasma，186卷163-168頁)。也已經(jīng)公開了菊苣和苦苣的F1代雜種植物具有對(duì)蕪菁花葉病毒(TuMV)有抗性的表型特征，該特征可能是通過源于菊苣的TuMV抗性基因的顯性而獲得的(Providenti等，1979年，J.Amer.Soc.Hort.Sci，104(6)卷726-728頁)。
根據(jù)申請(qǐng)者所知，從前述分析可以了解至今都未曾公開促成培養(yǎng)的源于菊苣和苦苣之間基因重組的菊苣。本領(lǐng)域的那些熟練技術(shù)人員甚至對(duì)在那些物種兩者之間成功獲得重組植物并更特別地獲得易于由中間產(chǎn)品組成以為了選擇有塊莖狀根、適合促成培養(yǎng)和具有使得它們能作為蔬菜植物進(jìn)行工業(yè)栽培的壯實(shí)性和致育性的技術(shù)特征的重組植物有技術(shù)偏見。
至今尚未公開任何用于獲得來自這些種之間雜交的重組菊苣屬植物的方法，而本發(fā)明公開的方法步驟可達(dá)到此目的。
本發(fā)明提供了這種獲得有塊莖狀根并適合促成培養(yǎng)的菊苣和苦苣之間的重組植物的方法。
更特別地，申請(qǐng)者已試圖研發(fā)一種用于獲得這種菊苣種重組植物的方法，該方法包括雜交育種和田間栽培步驟及體外培養(yǎng)和體外克隆步驟。特別地，對(duì)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法必要的培養(yǎng)和體外克隆步驟使得能克服第一代重組植物由于細(xì)菌和真菌病原體大規(guī)模感染而遭遇的許多技術(shù)問題。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是獲得有塊莖狀根的菊苣屬重組植物的方法，該方法特征在于其包括以下步驟a)在一批有塊莖狀根的多個(gè)菊苣種的雌株和一批多個(gè)苦苣種的雄株之間實(shí)施雜交育種并獲得由所述雜交育種產(chǎn)生的F1代雜種植物群；b)對(duì)由步驟a)產(chǎn)生的F1代雜種植物實(shí)施自體受精并獲得源于所述雜交育種的F2代重組植物；c)選擇芽或根無任何由病毒、細(xì)菌或真菌特別是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、核盤菌(Sclerotinia Sclerotiorum)或甚至由隱地疫霉(Phytophtora cryptogea)感染引起的明顯變化的F2代重組植物。
d)在以下促成條件下促成培養(yǎng)于步驟c)中選擇的F2代重組植物10-18天-營養(yǎng)液溫度15℃至17℃；-室溫15至17℃；e)克隆在步驟d)末期獲得的F2代植物并獲得再生芽；f)移植再生芽至合適的培養(yǎng)基直至獲得重組幼株。
在該方法的步驟a)中，在一批有塊莖狀根并適合促成培養(yǎng)的多個(gè)菊苣種雌株和一批多個(gè)苦苣種雄株之間實(shí)施“人工”雜交育種。
菊苣種的任何品種都能用于在該方法的步驟a)。
特別地，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能方便地利用適合水培促成的稱為《VIDENA》的菊苣品種。VIDENA品種可從Collection Nationale duGroupe d’Etudes et de contrle des Variétés Et des Semences(GEVES，Domaine de la Boisselière，49250，Brion，F(xiàn)rance)在參考《Ref 500》及在獲取號(hào)n°925下公開獲得。
該方法的步驟a)中，可使用苦苣的任何品種。然而，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員能有利地使用《Grosse Pommant Seule》品系，該品系從the CollectionNationale du GEVES(Brion，法國)在參考《Ref 13746》和獲取號(hào)n°693下公開獲得。
在步驟a)末期，獲得由上文描述的種間雜交育種產(chǎn)生的一批F1代雜種植物。
本方法的步驟b)中，通過步驟a)中獲得的F1代雜種植物自體受精完成雜交育種。
自體受精有利地按常規(guī)在封閉的場(chǎng)地并存在昆蟲如兩翼昆蟲時(shí)進(jìn)行，隨后自體受精通過所述昆蟲將取自F1代雜種植物的花的雄配子傳播至鄰近的F1代雜種植物的雌性生殖器而得以進(jìn)行，由此雌性生殖器接觸到雄配子。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能有利地使用如Hayes等(Methods of plantbreeding，Mc Grow-Hill Book公司，1955年，第5章，80-93頁)描述的用于洋蔥的常規(guī)自體受精技術(shù)，這種技術(shù)能直接應(yīng)用于菊苣種植物的自體受精。
獲得由F1代雜種植物自體受精產(chǎn)生的F2代種子。
在本方法的步驟b)的末期，從上述的F2代種子獲得F2代重組植物。
在步驟b)的末期，申請(qǐng)者觀察到許多的F2代重組植物很快有缺陷并死亡。發(fā)現(xiàn)許多的其它F2代植物對(duì)多種細(xì)菌或真菌病原體特別是對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)和對(duì)核盤菌(SclerotiniaSclerotiorum)及隱地疫霉(Phytophtora cryptogea)真菌非常敏感。
確實(shí)，在該方法步驟b)末期獲得的F2代植物掘根顯示苦苣的根和源于種間雜交育種的材料都比菊苣的根對(duì)核盤菌更敏感。菊苣的根接下來遭受鄰近有病的植物污染。
因此，該方法步驟c)由選擇在步驟b)末期獲得的其芽或根沒有顯示出任何肉眼能看到的由病毒、細(xì)菌或真菌感染特別地由胡蘿卜軟腐歐文氏菌、核盤菌或甚至是由隱地疫霉感染引起的改變的F2代重組植物組成。
在步驟d)中，將在步驟c)中選擇的F2代重組植物的根在經(jīng)特別改變的非經(jīng)典條件下通過促成培養(yǎng)以便在促成步驟d)末期獲得完全沒有任何細(xì)菌或真菌感染的小的F2代重組植物。
促成培養(yǎng)步驟d)中的特定條件在于結(jié)合了持續(xù)時(shí)間和溫度的技術(shù)特性。
在規(guī)定的溫度條件下，申請(qǐng)者觀察到促成步驟d)能實(shí)施周期為10-18天的促成，這一周期使得能獲得充分發(fā)育的幼株以用于在下一步驟e)中克隆而保持基本上沒有任何由病原體更特別是由細(xì)菌或真菌感染引起的肉眼可見的改變。當(dāng)促成步驟d)的持續(xù)時(shí)間為11-17天時(shí)獲得最好的結(jié)果，甚至促成周期為12-16天時(shí)獲得更有利的結(jié)果。為了獲得沒有任何由細(xì)菌或真菌感染引起的重大變化的重組幼株的最適宜生長條件，促成步驟的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選為13-15天并且最優(yōu)選地是14天，而不是常規(guī)的21天促成周期。
用維持在15℃至17℃，優(yōu)選15.5℃至16.5℃的溫度，最適宜的溫度是16℃而不是用于常規(guī)促成培養(yǎng)的溫度18℃至21℃的促成營養(yǎng)液完成促成步驟d)。同時(shí)，室溫即環(huán)境溫度與營養(yǎng)液保持的溫度即15℃至17℃相同，有利地是15.5℃至16.5℃并且最優(yōu)選地為16℃。
令人驚訝地是，用于促成培養(yǎng)步驟d)的短的持續(xù)時(shí)間和特別低的溫度使得能獲得具有滿意衛(wèi)生質(zhì)量特性的幼株以便隨后在體外克隆該幼株。
促成步驟d)的其它條件特別是營養(yǎng)液成分是經(jīng)典的。這些特別是由Leteinturier等(L’endive-Guide Pratique.édition du CTIFL，1991年9月，71頁)描述。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，在步驟c)選擇F2代雜種植物后，在促成步驟d)之前進(jìn)行步驟c1)，該步驟中將在步驟c)選擇的根通過浸沒在含有抗細(xì)菌劑和抗真菌劑混合物的消毒液中進(jìn)行處理。有利地，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員使用腐霉利(procymidon)(液態(tài)Sumisclex，SOPRA公司出售)，特別是以60g/hL的終濃度用于抑制核盤菌生長，以及對(duì)于mancozebe(Dithane DG，ROHM&HAAS公司出售)，特別是以400g/hl的濃度，用以抑制疫霉的生長。
在上文促成培養(yǎng)步驟d)之后，因而獲得的幼小菊苣有利地在隨后的克隆步驟e)之前基于在非常多樣且?guī)缀醪痪|(zhì)的F2代重組植物種群中的表型特征的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行選擇。
因此，在促成步驟d)末期獲得的F2代幼株群是非常異質(zhì)的。該F2代重組群包含具有非常多樣的表型特征的幼株，一些幼株具有的表型特征使它們與親本品系菊苣更相關(guān)，一些幼株具有的表型特征使它們與親本品系苦苣更相關(guān)。
然而，所有選擇后接受促成培養(yǎng)步驟d)的F2代重組幼株均具有塊莖狀根，使得它們適合促成培養(yǎng)，這是本發(fā)明要達(dá)到的目的。擁有塊莖狀根的重組特征最初由親本品系菊苣的基因組提供。所有選擇的F2代重組幼株也均具有鋸齒狀葉。擁有鋸齒狀葉的重組特征最初由親本品系苦苣的基因組提供。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的所有經(jīng)選擇F2代重組植物具有的這種表型特征的組合一般而言使得能定義在該方法步驟f)末期獲得的重組植物和在本說明書后面描述的本發(fā)明的額外步驟如步驟g)-j)而能夠獲得的重組植物。
早至根據(jù)本發(fā)明方法步驟b)末期獲得的F2代植物是重組植物，即在源于菊苣的DNA和源于苦苣的DNA之間的多個(gè)重組事件后，具有與兩親本植物各自倍性相同倍性的重組基因組的植物。根據(jù)本發(fā)明的F2代植物的重組基因組因此表達(dá)表型特征的組合，一些表型特征原來是在菊苣中存在的，并且一些表型特征原來是在苦苣中存在的。
因此根據(jù)本發(fā)明方法，促成步驟d)后緊隨著步驟d1)，其中將得到的幼小菊苣根據(jù)下列三種表型類型在克隆步驟e)之前得以選擇(i)PPI板狀根頸上有許多窄葉；(ii) GPI表型與萵苣菜相似，但有窄且鋸齒狀的葉；并且(iii) TFR和SCA有很多鋸齒的分支葉。
上面描述的表型類型(iii)的所有F2代重組植物具有次于葉主軸的軸，這在


圖1的總圖中有圖解，這是在菊苣上從未觀察到的特征。在一些萵苣菜基因型中，例如萵苣菜“Barbe de Capucin”(野生菊苣)，可以觀察到冠檐(limb)的邊緣能出現(xiàn)淺鋸齒，即它的(i)鋸齒深度與(ii)鋸齒尖和葉軸之間長度這兩者之間的比率不超過0.25(見
圖1)，而該比率在根據(jù)本發(fā)明的F2代重組植物中相當(dāng)?shù)馗?。同時(shí)，在萵苣菜基因型如Barbe deCapucin中，鋸齒只存在于上面的第三葉。
在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟d)末期以可再生的方式獲得的F2代重組植物的三種類型進(jìn)一步在下面描述，該描述涉及測(cè)定使得能定義它們的幾種表型特征，這在
圖1中描述，并且分別是以下特征-主軸(1)和葉的二級(jí)軸(secondary axis)(2)；-葉基(leaf basis)的寬度(3)；-葉的高度(4)；-鋸齒深度(5)和鋸齒尖到葉軸之間的長度(6)-存在二級(jí)鋸齒列(7)。
PPI重組植物類型的描述
-在促成完成時(shí)每根有100多片葉(重組特征源于苦苣)，而傳統(tǒng)萵苣菜的最大量為20-35。
-無二級(jí)軸；-每片葉的葉基非常窄葉基寬度/葉高度的比率為0.06-0.10，而傳統(tǒng)萵苣菜的最小值為0.10；-冠檐深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85，相較于菊苣的一些基因型的比率為0-0.25。
-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒列；-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐(limb)的顏色是黃色或紅色；GPI重組植物類型的描述-對(duì)于傳統(tǒng)的萵苣菜而言，在促成完成時(shí)每根獲得20到35片葉；-無二級(jí)軸；-從冠檐直到葉基的深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85，相較于菊苣的一些基因型的比率為0-0.25。
-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒列；-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐的顏色是黃色或紅色；TFR和SCA重組植物類型的描述TFR產(chǎn)品類型的描述-對(duì)于傳統(tǒng)的萵苣菜而言，在完成促成時(shí)每根獲得20到35片葉；-次于主軸的2到5個(gè)始于葉的基部部分(the basal halfofthe leaf)的軸；-冠檐的深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85；-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒；
-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐的顏色是黃色或紅色；SCA產(chǎn)品類型的描述該定義與TFR類型重組植物的定義相似。
鋸齒淺并且鋸齒列幾乎不存在。
對(duì)于TFR，其主要特征是存在二級(jí)軸(該特征只在一些苦苣中出現(xiàn)而從未在菊苣中出現(xiàn))。
F2代重組植物群和根據(jù)上文描述的三種表型類型(i)-(iii)而選擇的F2代重組植物亞群在除那些上文提到的那些以外的表型特征的表達(dá)中都不是均質(zhì)的。例如，F(xiàn)2代重組植物的亞群(i)-(iii)在它們本身之間依次包含廣泛的表型種類，然而這可以理解為它們共同擁有作為將它們分為同一類的基礎(chǔ)的表型特征。
而且，申請(qǐng)者觀察到除了那些作為選擇不同F(xiàn)2代植物的基礎(chǔ)的表型特征外，其它表型特征的表達(dá)在貫穿連續(xù)世代即貫穿連續(xù)生殖周期(包括通過上面定義的(i)-(iii)亞群的自體受精)是不穩(wěn)定的。
在本發(fā)明方法的步驟e)中，克隆F2代重組植物群或甚至上文定義的表型類型(i)-(iii)的亞群以便獲得再生芽。
在促成培養(yǎng)和任意地表型選擇后，F(xiàn)2代重組植物的表型選擇和克隆按照常規(guī)進(jìn)行，例如在適合再生芽的培養(yǎng)基如在“ER”培養(yǎng)基上，從來自在促成步驟d)末期獲得的幼小菊苣的葉脈片段，任選地用事先于表型類型(i)-(iii)中選擇的F2代植物的葉脈片段進(jìn)行，例如，根據(jù)Margara描述的技術(shù)(Margara J，1989年，Bases de la multiplication végétative，INRA編著)進(jìn)行選擇和克隆。優(yōu)選地，葉脈片段在培養(yǎng)前用次氯酸鈣消毒以為了在合適的培養(yǎng)基中再生芽。
F2代重組植物的克隆步驟，任選地根據(jù)上面提到的(i)-(iii)表型類型選擇它們后，考慮對(duì)由于細(xì)菌或真菌病原體對(duì)由促成產(chǎn)生的幼株的可能感染進(jìn)行預(yù)防控制。確實(shí)，甚至如在上文中描述在促成步驟之前通過用包含抗細(xì)菌劑或抗真菌劑化合物的營養(yǎng)液處理根，該申請(qǐng)者能觀察到在促成步驟d)末期獲得的幼小菊苣對(duì)核盤菌感染相當(dāng)敏感，克隆步驟e)，更特別地當(dāng)它包括于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)之前對(duì)葉脈片段消毒以為了再生芽時(shí)，使得能相當(dāng)?shù)靥岣呖寺〉闹参锊牧系男l(wèi)生條件。
克隆步驟e)之后是在常規(guī)的芽移植(prick out)條件下將得到的再生芽在適合的培養(yǎng)基中的移植步驟，直到F2代雜交幼株得以獲得、克隆并移植。移植步驟f)本身是常規(guī)的并且能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員使用任何這類已知的技術(shù)如在以0.2mg/l終濃度的AIA濃縮的《M4》特定的培養(yǎng)基(Murashige T和Skoog F，1962年，Physiol Plant，15卷473-497頁)進(jìn)行。
例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能有利地使用如本說明書實(shí)施例中描述的移植技術(shù)。
然后如在實(shí)施例中描述的那樣，將在步驟f)末期獲得的經(jīng)克隆并移植的F2代重組幼株適應(yīng)，隨后使其生根并種于溫室或田地。
形成本發(fā)明方法步驟f)的最終產(chǎn)品的經(jīng)克隆并移植的F2代重組植物就它們的表型特征的表達(dá)而論包括根據(jù)表型類型(i)-(iii)中的表型特征最初選擇的經(jīng)克隆并移植的F2代重組植物的亞群，分別形成非常異質(zhì)的群體，或三種非常異源的亞群。例如，根據(jù)本發(fā)明在實(shí)施例中詳細(xì)說明的方法執(zhí)行的具體說明，經(jīng)克隆并移植的F2代重組植物、本發(fā)明方法步驟f)的最終產(chǎn)品如下組成-十種在板狀根頸上共同具有非常多而窄的葉的(i)PPI亞類的F2代重組植物，但之間通過許多其它表型特征區(qū)別；-八種共同具有類似于有窄且鋸齒狀葉的萵苣菜的表型的(ii)GPI表型亞類的F2代重組植物，但之間通過許多其它表型特征區(qū)別。
-四種共同具有分支葉的屬于(iii)SCA表型亞類的F2代重組植物，但之間通過許多其它表型特征區(qū)別。
-三種共同具有鋸齒非常多的有分支葉，但之間通過許多其它表型特征區(qū)別的(iii)TFR表型亞類的F2代重組植物；并且申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，來自根據(jù)本發(fā)明方法在步驟f)末期獲得的25種F2代重組植物中，只有19種在自體受精后生產(chǎn)種子，也就是說在該方法步驟f)末期獲得的19種F2代重組植物中只有6種是高度自交不育的。
用于獲得菊苣種雜種植物的方法，根據(jù)本發(fā)明該方法特征在于它進(jìn)一步包括另外的下列步驟g)地面培養(yǎng)在步驟f)末期獲得的幼小重組植物；h)將在步驟g)末期獲得的F2代重組植物自體受精并且通過在地面培養(yǎng)獲得F3代重組植物。
F3代重組植物群通過它們共同產(chǎn)生塊莖狀根的能力即發(fā)育適合促成培養(yǎng)的根從表型觀點(diǎn)而得以表征。
有利地，將在上述步驟h)獲得的F3代重組植物接受促成步驟(i)，如果可能，在與本方法步驟d)中執(zhí)行的那些促成條件相同的促成條件，即營養(yǎng)液溫度為15℃至17℃，進(jìn)行為期10-18天的促成步驟i)，營養(yǎng)液和室溫優(yōu)選地為相同。
有利地，在上面提到的促成步驟i)之后是F3代重組幼小菊苣的克隆步驟j)，所述的克隆步驟無差別地用由促成培養(yǎng)產(chǎn)生的F3代重組幼株的葉脈片段或終芽(end bud)進(jìn)行。
根據(jù)第一有利地可供選擇的方法，克隆步驟j)包括在促成步驟(i)末期獲得的幼株的葉脈片段的克隆步驟，接下來是F4代重組幼株的再生步驟。
根據(jù)第二有利地可供選擇的方法，克隆步驟j)包括在促成步驟(i)末期獲得的幼株的終芽的克隆和F4代重組幼株的再生的步驟。
至于本方法步驟d)和e)，上面描述的步驟i)和j)考慮控制植物材料的衛(wèi)生條件促成步驟的持續(xù)時(shí)間和溫度的技術(shù)特性的結(jié)合和用于克隆的植物材料的滅菌，如用次氯酸鈣以重量為2.5％的終濃度滅菌的可能性具有限制、甚至完全抑制細(xì)菌或真菌對(duì)所述重組植物材料可能的感染作用。
優(yōu)選地，根據(jù)完成上述克隆步驟.j)的第一模式，通過在如實(shí)施例中描述的“NF”特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)幼株葉脈片段產(chǎn)生F4代重組幼株。
優(yōu)選地，根據(jù)上述克隆步驟j)的一個(gè)實(shí)施方案，在本方法步驟k)中再生F4代重組幼株，其如實(shí)施例中的描述通過在M4特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)終芽進(jìn)行。
雖然保持高度的表型多樣性，在上面提到的步驟j)末期獲得的F4代重組植物有極好的衛(wèi)生質(zhì)量。更優(yōu)選地，它們不受核盤菌、疫霉菌或胡蘿卜軟腐歐文氏菌的感染。
在每一F4代重組植物的表型亞類中存在本說明書中定義的不同表型亞類(i)-(iv)。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)顯示F4代重組植物能夠在與常規(guī)上用于Witloof型菊苣的那些促成培養(yǎng)條件相同的促成培養(yǎng)條件下很容易地通過促成進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明方法的效果因此顯示為獲得了具有塊莖根(tuberized roots)并適于促成培養(yǎng)的重組菊苣屬植物，從而產(chǎn)生的最終植物材料擁有原始植物至今未知的表型，具體而言，最終植物材料具有以下植物表型-有深鋸齒葉的菊苣，該菊苣看上去不像萵苣菜也不像卷葉萵苣菜。
-具有與萵苣菜的塊莖狀根一樣的塊莖根，這種塊莖根因而使得能滿足萵苣菜(菊苣)生產(chǎn)者常規(guī)使用的生產(chǎn)和促成方法。
而且，也考慮了通過常規(guī)的自體受精確定F4代重組植物的表型特征，上述的F4代重組植物根據(jù)本發(fā)明方法通過本方法完成時(shí)獲得的每一種F4代植物的幾個(gè)連續(xù)再生周期獲得，這著眼于獲得能穩(wěn)定表達(dá)由基因型或基因型組合產(chǎn)生的特征的組合的重組植物品系，所述特征是均質(zhì)表達(dá)的，以便賦予源于Fn代重組植物(其中n表示一個(gè)至少等于6的整數(shù))的一些重組植物穩(wěn)定且均質(zhì)的植物品系特征。
本發(fā)明的另一目的包括使用如本說明書中上文所述的方法獲得的重組植物，所述的重組植物其特征在于它們由來自多個(gè)有塊莖狀根的菊苣種的雌株和來自多個(gè)苦苣種的雄株之間最初雜交育種產(chǎn)生，并且在于它們有4種下面表型類型中的一種(i)PPI板狀根頸上有許多窄葉；(ii)GPI表型與萵苣菜相似，但有窄的鋸齒狀葉；或
(iii)TFR和SCA非常多鋸齒的分支葉。
根據(jù)本發(fā)明的重組植物包括，更特別地是1)在本方法步驟f)末獲得的F2代重組植物；2)在本方法步驟h)末獲得的F3代重組植物；3)在步驟i)末獲得的F3代重組植物；4)在本方法步驟f)末獲得的F4代重組植物；通過下面的圖表和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
附圖
圖1表示根據(jù)本發(fā)明的菊苣種重組植物萎蔫葉(wilted leaf)的理論圖示。這種理論圖示說明不同表型特征，所述特征使得能定義本發(fā)明重組植物或它的一種亞型。
圖2是PPI表型亞類的板狀根頸上有許多窄葉的F4代重組植物的照片。
圖3是有SCA表型亞類具有分支葉的F4代重組植物的照片。
圖4是具有代表TFR表型亞類的有很多鋸齒的分支葉的F4代重組植物的照片。
圖5是表型與具有代表GPI表型亞類的窄鋸齒狀葉的萵苣菜相似的F4代重組植物的照片。
圖6是顯示根據(jù)本發(fā)明的4種F4代GPI型菊苣種重組植物(垂直地排列，在附圖的上部)和菊苣種植物也叫萵苣菜(水平地排列，在附圖的下部)之間的比較的照片。
圖7是詳細(xì)顯示根據(jù)本發(fā)明的F4代GPI型菊苣種重組植物的葉的鋸齒的照片。
圖8是闡明適合促成培養(yǎng)的根據(jù)本發(fā)明的F4代GPI型菊苣種重組植物的照片。
實(shí)施例實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明方法的步驟a)-f)獲得F2代植物A.材料和方法
A.1.培養(yǎng)基在實(shí)施例中使用的《NF》和《M4》培養(yǎng)基的定性和定量組分在以下表I和表II中分別給出。
表I《NF》培養(yǎng)基
*無肌醇的Gamborg維生素表II《M4》培養(yǎng)基
*無肌醇的MS維生素A.2.用菊苣葉脈的體外克隆重組幼株的方法。
1)采樣-選擇內(nèi)部的菊苣葉；-獲取葉脈；-將得到的葉置于無菌器皿中；2)消毒用終濃度為2.5％的次氯酸鈣溶液+幾滴Tween溶液進(jìn)行10分鐘的消毒步驟。隨后，在層流凈化罩下用無菌水進(jìn)行三次連續(xù)的漂洗步驟。
3)培養(yǎng)-再生-將葉脈置于無菌吸水紙上；-切取約1cm2表面積的葉脈片段；-于合適的玻璃管中在NF培養(yǎng)基上培養(yǎng)；-將管置于培養(yǎng)室中，處于下列的溫度和亮度-等效于白天光照16小時(shí)的亮度，溫度為25℃；-夜間時(shí)間為16小時(shí)的黑暗條件，溫度為20℃。
4)生根于NF培養(yǎng)基上培養(yǎng)約3周后，一旦再生的芽發(fā)育完全后，將芽分開并將每個(gè)幼株移植至管中的M4培養(yǎng)基上以使它們生根。
-將管置于培養(yǎng)室中，處于下列的溫度和亮度條件下-等效于白天光照16小時(shí)的亮度，溫度為25℃；-夜間時(shí)間為16小時(shí)的黑暗條件，溫度為20℃。
5)適應(yīng)一旦長出根，將幼植株于直徑為4cm的蜂窩板的堆肥(在袋中)在濕潤環(huán)境且溫度為20℃進(jìn)行適應(yīng)。
B.用于獲得根據(jù)本發(fā)明的菊苣種的F2代重組植物的方法。
在溫室中將菊苣《1089》品系與苦苣《Grosse pommant seule》品系人工雜交育種以便獲得F1雜種。
將30株F1代植物播種并種植直到3葉階段，隨后于5℃進(jìn)行8周的春化階段以便獲得結(jié)果能力。
b)在兩翼昆蟲存在時(shí)結(jié)果實(shí)并自體受精(在熱的溫室內(nèi))以獲得F2代種子。
c)在田間播種20,000粒F2代種子。
然后掘根除去可見的病害或非正常植物(不定芽、根破裂...)處理10,000個(gè)經(jīng)選擇的根(60g/hl腐霉利和400g/hl Mancozebe)在促成之前將根儲(chǔ)存于0℃冰箱中。
d)16℃下進(jìn)行短的14天促成。
該促成完成時(shí)，系統(tǒng)幾乎全部都受到污染。
因此，不可能在它們的根上獲得能生存的植物。
e)觀察葉部分后，基于4種不同的類型選擇了25種植物PPI選擇10個(gè)SCA選擇4個(gè)TFR選擇3個(gè)GPI選擇8個(gè)為了再生這些經(jīng)選擇植物，用次氯酸鈣將萎蔫的葉脈片段(1cm2)消毒并在NF培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)。每個(gè)經(jīng)選擇的植物培養(yǎng)24個(gè)片段。
f)三周后，在將感染的片段除去后，將再生的芽移植到M4培養(yǎng)基上生根。
該步驟之后在20℃下在濕潤環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)步驟。
實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明方法的步驟g)和h)獲得根據(jù)本發(fā)明的F3代植物除非另外說明，材料和方法是在實(shí)施例1中描述的那些。
g)于5℃下進(jìn)行8周的春化作用后，將植物在熱的溫室栽培。
植物在4月分別地開花，植物在布質(zhì)套筒下以為了將兩翼昆蟲置于其中，并完成自體受精。
總共，選擇的19種植物得到F3代種子。其它植物是不育的。
在步驟h)獲得的F3代重組植物的處理和適應(yīng)F3代的播種是在田間進(jìn)行。
1)當(dāng)觀察植物在田間生長時(shí)，發(fā)現(xiàn)TFR類型十分有缺陷(葉干...)。所選擇的SCA早在田間階段顯示出有核盤菌感染。
當(dāng)一批根作為接種物時(shí)，又將進(jìn)行簡(jiǎn)短的促成操作。
掘根。
處理所選擇的根(60g/hl腐霉利和400g/hl Mancozebe)。
在促成之前將根儲(chǔ)存于0℃冰箱中。
2)在十二月，于16℃在兩周內(nèi)再次將根進(jìn)行促成。
3)極少的植物得以保留PPI選擇了1個(gè)GPI選擇了2個(gè)SCA選擇了3個(gè)為了再生這些經(jīng)選擇的植物，用次氯酸鈣將萎蔫的葉脈片段(1cm2)消毒并在NF培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)。
每個(gè)選擇的植物培養(yǎng)24個(gè)片段。
4)三周后，在將感染的片段除去后，將再生的芽移植到M4培養(yǎng)基上生根。
該步驟后進(jìn)行適應(yīng)步驟。
實(shí)施例3根據(jù)本發(fā)明方法的步驟i)-i)獲得本發(fā)明的F4代植物。
除非另外說明，材料和方法是在實(shí)施例1中描述的那些。
a)于5℃下進(jìn)行8周的春化作用后，將植物在熱的溫室栽培。
植物在1997年4月分別地開花，并在布質(zhì)套筒下以為了將兩翼昆蟲置于其中，并完成自體受精。
b)然后將F4代在田間播種。
在該F4階段，得到的植物在田間沒有表現(xiàn)出缺陷并且將收獲的根按照常規(guī)的生產(chǎn)方案(19℃下3周)進(jìn)行促成。難以處理的F2代和F3代階段得以完成。
c)在促成培養(yǎng)期間，所選擇的子代顯示出好的可促成培養(yǎng)能力和好的表型特征，作為用于促成培養(yǎng)菊苣而使其多樣化的起始點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.用于獲得具有塊莖狀根的菊苣屬重組植物的方法，所述方法的特征在于它包括以下步驟a)在一批有塊莖狀根的多個(gè)菊苣種的雌株和一批多個(gè)苦苣種的雄株之間實(shí)施雜交育種并獲得由所述雜交育種產(chǎn)生的F1代雜種植物群；b)對(duì)由步驟a)產(chǎn)生的F1代雜種植物實(shí)施自體受精并獲得源于所述雜交育種的F2代重組植物；c)選擇F2代重組植物，其中所述植物的芽或根無任何由病毒、細(xì)菌或真菌特別是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌、核盤菌或甚至由隱地疫霉感染引起的明顯變化；d)在以下促成條件下將在步驟c)中選擇的F2代重組植物促成10-18天-營養(yǎng)液溫度15℃至17℃；-室溫15至17℃；e)克隆在步驟d)末期獲得的F2代植物并獲得再生芽；f)移植再生芽至合適的培養(yǎng)基直至獲得重組幼株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法的特征在于促成步驟d)后緊隨著步驟d1)，在d1)中對(duì)得到的幼小菊苣根據(jù)下列三種表型類型在克隆步驟e)之前進(jìn)行選擇(i)PPI板狀根頸上有許多窄葉；(ii)GPI表型與萵苣菜相似，但有窄且鋸齒狀的葉，以及(iii)TFR和SCA極具鋸齒狀的分支葉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法的特征在于它包括以下額外的步驟g)地面培養(yǎng)在步驟f)末期獲得的幼小重組植物；h)將在步驟g)獲得的F2代重組植物自體受精并且通過在地面培養(yǎng)獲得F3代重組植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法的特征在于將在步驟h)獲得的F3代重組植物在下列促成條件下進(jìn)行為期10-18天的促成步驟i)-營養(yǎng)液溫度15℃至17℃-室溫15至17℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述方法的特征在于它還包括將在促成步驟i)末期獲得的幼小重組菊苣進(jìn)行克隆的步驟j)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述方法的特征在于克隆步驟j)包括將在促成步驟i)末期獲得的幼株的葉脈片段克隆并再生F4代重組幼株。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述方法的特征在于克隆步驟.j)包括將在促成步驟i)末期獲得的幼株的終芽克隆并再生F4代重組幼株。
8.通過根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的重組植物，其中所述重組植物的特征在于它們具有(i)塊莖狀根和(ii)鋸齒狀葉。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組植物，其中所述重組植物的特征在于它們屬于PPI型并具有下列共有的表型特征-促成完成時(shí)每根有多于100片葉；-無二級(jí)軸；-每片葉的葉基非常窄葉基寬度/葉高度的比率為0.06-0.10；-冠檐的深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85；-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒列；-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐的顏色是黃色或紅色。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組植物，其中所述重組植物的特征在于它們屬于GPI型并具有下列共有的表型特征-促成完成時(shí)每根獲得20-35片葉；-無二級(jí)軸；-從冠檐直到葉基的深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85；-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒列；-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐的顏色是黃色或紅色。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組植物，其中所述重組植物的特征在于它們屬于TFR或SCA型并具有下列共有的表型特征-促成完成時(shí)每根獲得20-35片葉；-葉的基部部分出現(xiàn)的次于主軸的2到5個(gè)軸；-冠檐的深的鋸齒鋸齒深度/鋸齒尖到葉軸的長度的比率為0.60-0.85；-鋸齒的邊緣包含或不含二級(jí)鋸齒列；-葉脈顏色是白色或紅色；-冠檐的顏色是黃色或紅色。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于獲得菊苣屬重組植物的方法，該植物適合于促成栽培并具有通過表達(dá)分別源于菊苣和苦苣的表型性狀的組合而確定的表型。
文檔編號(hào)A01H5/12GK1812710SQ200480017772
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者A·勒孔特 申請(qǐng)人:維爾莫蘭公司