專利名稱：一種促進植物生長和/或提高植物抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中一種促進植物生長和/或提高植物抗性的方法。
背景技術：
非生物環(huán)境因子(如干旱、鹽堿等)嚴重影響農作物的正常生長發(fā)育和產量，環(huán)境污染和人口爆炸則使糧食的供應更趨緊張。因而需要培育高抗性和高產優(yōu)質的糧食作物。對于植物在逆境下反應的分子機制的研究，目前的難點在于已知的脅迫反應基因太少，因此研究植物對逆境響應的機制，最重要的就是發(fā)現(xiàn)更多的脅迫反應基因，并研究它們在逆境中的作用。
植物谷胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase，GST)在植物中是一類很豐富的酶，由一個古老而高度分歧的基因家族編碼。GST的主要功能是催化生物體內某些內源或外源的有害物質的親電子集團與谷胱甘肽的疏基結合，使其分解，或形成易溶于水的物質，排出體外。
劉新仿等發(fā)現(xiàn)擬南芥的一個GST與植物對紫外輻射損傷的耐受性有關；王麗萍等從鹽地堿篷中克隆出一個與耐鹽有關的GST。Bianchi等研究煙草Nt107基因在擬南芥中的同源基因GST8，在快速的脫水和漸進的干旱時，GST8的表達逐漸增加。推測GST8可能的作用是消除由干旱脅迫引起的活性氧的毒害。
對玉米GST研究，始于Frear在1970年對玉米抗除草劑阿特拉津GST的研究，發(fā)現(xiàn)玉米GST具有促進玉米體內GSH與三氮苯類除草劑阿特拉津的軛合作用，從而迅速消除其對玉米的毒性。對玉米谷胱甘肽轉移酶基因BZ2研究發(fā)現(xiàn)，BZ2編碼的蛋白在花青素生物合成的最后一步起作用，最終使花色素在玉米的液泡內凝集。目前，在玉米中已經發(fā)現(xiàn)42個谷胱甘肽轉移酶，根據序列的相似性分為三類類型I、II、III，其中絕大多數玉米谷胱甘肽轉移酶基因的功能研究并沒有報道。玉米谷胱甘肽轉移酶ZmGST7，由227個氨基酸殘基組成，其編碼基因ZmGST7，由840個堿基組成，其編碼序列為第25-708位堿基(GenBank AJ010440)。目前，并沒有發(fā)現(xiàn)它具有促進植物生長和/或具有抗逆功能的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種促進植物生長和/或提高植物抗性的方法。
本發(fā)明所提供的促進植物生長和/或提高植物抗性的方法，是將植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因導入目的植物，得到生長加快和/或抗性提高的轉基因植株。
所述植物谷胱甘肽轉移酶可來源于玉米、擬南芥、鹽地堿篷或水稻，優(yōu)選為玉米，所述植物谷胱甘肽轉移酶優(yōu)選為ZmGST7。
所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因通過植物表達載體導入目的植物；所述植物表達載體為Ti類質粒載體或病毒載體。
所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動子、增強啟動子或誘導型啟動子。
在所述表達載體中，啟動所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因轉錄的啟動子可為花椰菜花葉病毒35S啟動子。所述表達載體優(yōu)選為35S-ZmGST7。
在所述表達載體中，啟動所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因轉錄的啟動子還可為擬南芥rd29A基因啟動子。所述表達載體優(yōu)選為RD29AP-ZmGST7。
為了便于對轉基因植物或轉基因植物細胞進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入可選擇性標記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉基因植物釋放的安全性，在構建植物表達載體時也可不攜帶任何標記基因，在苗期進行特定PCR分子標記篩選。
含有所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
實驗結果表明玉米基因ZmGST7在正常條件下可以促進轉基因擬南芥的生長，并且在低濃度的滲透脅迫下能夠提高植物抗性。本發(fā)明的方法對于培育新型耐逆園林植物和農作物具有重要實用價值和經濟效益。


圖1A為35S-ZmGST7的BamHI、HindIII、Xhol分別酶切鑒定結果圖1B為RD29AP-ZmGST7的EcoRI、NcoI、KpnI、SalI分別酶切鑒定結果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
T0表示經過沾花侵染后的植株，T1表示T0代自交產生的種子及由它所長成的植株，T2表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株。
實施例1、利用ZmGST7促進擬南芥生長和提高擬南芥抗性
1、轉ZmGST7植株的獲得(1)構建ZmGST7的植物表達載體所利用的含有ZmGST7克隆來自于用抑制差減雜交方法構建的差減文庫。具體的文庫構建方法均按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNA Subtraction Kit試劑盒推薦的條件進行，得到的ZmGST7 cDNA片段連接到pGEM T-easy載體上(購于Promega公司)，并轉化到DH5α大腸桿菌細胞。所有克隆經過測序后發(fā)現(xiàn)其中一個克隆包含完整的ZmGST7基因編碼序列，命名為pGEM T-easy-ZmGST7。
用EcoRI酶切pGEM T-easy-ZmGST7質粒，獲得ZmGST7片段，將其連接到pGEM-7Zf(+)載體(購于Promega公司)的EcoRI識別位點間，經過基因方向的鑒定，用XbaI與SacI雙酶切，得到兩端含有XbaI與SacI酶切位點的ZmGST7片段，將此片段連接到用限制性內切酶XbaI和SacI去除GUS基因的pBI221(購于BioLabs公司)載體上的限制性內切酶XbaI和SacI的識別位點間，經限制性內切酶EcoRI和HindIII酶切鑒定，得到含有ZmGST7基因序列的重組載體pBI221-ZmGST7-35S。pBI221-ZmGST7-35S用PstI酶切，EcoRI部分酶切，得到含有35S啟動子和NOS終止子的ZmGST7片段，最后將該片段連接到植物表達載體p3301上(p3301購自澳大利亞CAMBIA公司)的限制性內切酶PstI和EcoRI的識別位點間，再用BamHI、HindIII、Xhol分別酶切鑒定，酶切鑒定結果如圖1A所示，BamHI酶切得到一條大小為13kb的條帶；HindIII酶切得到一條大小為11.5kb的條帶和一條2kb的條帶；Xhol酶切得到一條大小為10.6kb的條帶，一條1.8kb的條帶和一條560bp的條帶；表明得到結構正確的由花椰菜花葉病毒35S啟動子啟動ZmGST7轉錄的重組表達載體35S-ZmGST7。
用NotI酶切pGEM T-easy-ZmGST7，獲得ZmGST7片段，連接到pBluescriptIIKS/SK(+)(購于MBI Fermentas公司)載體的限制性內切酶NotI的識別位點間，經過基因方向的鑒定，用Xbal與SacI雙酶切，得到兩端含有Xbal與SacI酶切位點的ZmGST7片段，將此片段連接到用限制性內切酶Xbal與SacI去除GUS基因的pBI221(購于BioLabs公司)載體上的限制性內切酶Xbal與SacI的識別位點間，得到含有ZmGST7基因序列的重組載體pBI221-ZmGST7。用HindIII和Xbal酶切去除pBI221-ZmGST7載體的35S啟動子。根據Yamaguchi Shinozaki等(MOLECULAR AND GENERAL GENETICS，1993，236331-340)發(fā)表的rd29A基因的5’端序列，設計了一對兩端分別帶有HindIII和Xbal酶切位點的特異引物(P15’-AAAAGCTTACGCATGATTTGATGGAG-3’(序列1)，P25’-AGTCTAGAAACCCTTTATTCCTGATGATTG-3’(序列2))，由上海生物工程公司合成。從擬南芥基因組DNA進行PCR擴增，反應體系為為25μl，包括1μl DNA模板，2.5μl10×buffer，2.5μl dNTPs(2mM)，1μl引物P1(10mM)，1μl引物P2(10mM)，0.3μlTaq酶(5U/μl)，16.7μl ddH2O。反應條件為94℃預變性3分鐘；94℃，45秒，65℃，45秒，72℃，1分鐘，35個循環(huán)后于72℃保溫延伸10分鐘。PCR產物用HindIII和Xbal酶切，得到含有HindIII和Xbal酶切位點的RD29A Promoter片段，將此片段連接到已經去除35S啟動子的含有ZmGST7的pBI221-ZmGST7上，經HindIII酶切，EcoRI部分酶切，得到含有RD29A啟動子和NOS終止子的ZmGST7片段，最后連接到植物表達載體p3301上的限制性內切酶HindIII和EcoRI的識別位點間，再用EGoRI、NcoI、KpnI、SalI分別酶切鑒定，酶切鑒定結果如圖1B所示，NcoI酶切得到一條大小為11.5kb的條帶和一條1.92kb的條帶；KpnI酶切得到一條大小為11.2kb的條帶和一條2.27kb的條帶；EcoRI酶切得到一條大小為12.26kb的條帶和一條1.2kb的條帶；SalI酶切得到一條大小為10.9kb的條帶，一條2.26kb的條帶和一條280bp的條帶；表明得到結構正確的由擬南芥rd29A基因啟動子啟動ZmGST7轉錄的重組表達載體RD29AP-ZmGST7。
(2)轉化植物將重組表達質粒35S-ZmGST7或RD29AP-ZmGST7轉化農桿菌GV3101，并提取質粒做酶切及PCR擴增檢測，篩選陽性菌株用于轉化植物。
將陽性農桿菌菌株分別接入YEB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～6小時，OD600約0.5時，5000g，離心15分鐘收集菌體細胞，用含有1×MS大量元素和5％蔗糖的溶液重懸細胞，加入體積百分含量為0.02％的表面活性劑silwet L-77(購自GE Silicones公司)用于轉化植物。轉化擬南芥采用沾花侵染(floral dipping)的方法，轉化后黑暗低溫(16攝氏度)培養(yǎng)24小時后轉入正常培養(yǎng)條件下生長，即為T0代植株。收獲T0代植株上的種子(T1代種子)，將7000粒T1代種子平鋪到MS培養(yǎng)基上春化3天，然后直接播種到營養(yǎng)土中生長，正常生長20天后，用0.5‰(體積百分比)的除草劑草丁膦(PPT)噴霧篩選轉化植株。在噴施抗除草劑后轉化植株仍然能夠正常生長，同時提取轉化植株的基因組DNA，利用引物AAGACCTGGGCAACAAGAGCGA和TGGCGAAGAAATAGAGACACACCTTA進行PCR擴增ZmGST7基因，利用引物CCAGAAACCCACGTCATGCC和CAGGAACCGCAGGAGTGGA進行PCR擴增除草劑抗性基因bar基因，進一步鑒定轉化植株(未轉化植株中無相應的ZmGST7基因和除草劑抗性基因擴增條帶)，結果得到100株T1代轉化植株。T1代轉化植株按照株系分別收獲T2代種子。T2代種子種植后，用同樣的方法鑒定轉化植株，并收獲T3代種子，結果得到50個35S-ZmGST7轉化株系的T3代種子(每個株系各1000粒)和50個RD29AP-ZmGST7轉化株系的T3代種子(每個株系各1000粒)。
2、轉ZmGST7植株的生長性狀觀察將含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代種子、轉RD29AP-ZmGST7的T3代種子(各取10個轉化株系，每個株系各30粒)首先播種于含有7mg/L草丁膦的MS培養(yǎng)基上，4℃春化3天，光照培養(yǎng)生長4天，篩選能夠存活的幼苗；未轉化植株的種子(30粒)播種于MS培養(yǎng)基上，4℃春化3天，光照培養(yǎng)生長4天，作為對照幼苗。將篩選的轉基因幼苗和對照幼苗同時轉移到MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿直立放置，擬南芥幼苗倒置生長4天后，每個株系取10株觀察比較植株根系，結果表明含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株幼苗的根長(平均為2.74cm)明顯比對照(平均為2.15cm)的長，方差分析達到極顯著水平(1％的顯著水平)，而含有ZmGST7的轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株幼苗的根長(平均為2.26cm)與對照相比差異不大(表1)。
表1.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株倒置生長4天后的根長(cm)比較

將上述含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代種子、轉RD29AP-ZmGST7的T3代種子(各取10個轉化株系，每個株系各30粒)首先播種于含有7mg/L草丁膦的MS培養(yǎng)基上，4℃春化3天，光照培養(yǎng)生長7天，篩選能夠存活的幼苗；未轉化植株的種子(30粒)播種于MS培養(yǎng)基上，4℃春化3天，光照培養(yǎng)生長4天，作為對照幼苗。將篩選的轉基因幼苗和對照幼苗同時播種于小花盆中，生長到二十天后，明顯觀察到含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7植株比對照抽苔、開花提前3-4天，而轉RD29AP-ZmGST7植株則與對照抽苔時間一致。表2顯示移栽后的第二十天測量植株抽苔高度的差異。轉35S-ZmGST7植株與對照的差異達到極顯著水平(p＜0.01)。
表2.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株移栽后的第二十天植株抽苔高度(cm)的比較


3、轉ZmGST7植株的抗性觀察將含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代種子，含有ZmGST7的轉RD29AP-ZmGST7的T3代種子(各取10個轉化株系，每個株系各30粒)首先播種于含有7mg/L草丁膦的MS培養(yǎng)基上，未轉化植株的種子(30粒，對照)播種于MS培養(yǎng)基，4℃春化3天，光照培養(yǎng)生長4天，將能夠存活的幼苗再轉移到含有不同濃度的甘露醇(100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L)的MS培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿直立放置，擬南芥幼苗倒置生長，4天后測量彎曲向下生長的根長。結果表明含有ZmGST7的轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株的幼苗在低濃度的甘露醇脅迫下相對根長比對照更長，尤其在200mmol/L甘露醇時達到極顯著水平。含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T2代植株在低濃度的甘露醇脅迫下相對根長比對照長，但差異的幅度沒有轉RD29AP-ZmGST7的幼苗明顯，只有在200mmol/L甘露醇時達到顯著水平(表3-表6)。
表3.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株在100mmol/L的甘露醇脅迫下生長4天的根長(cm)比較

表4.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株在200mmol/L的甘露醇脅迫下生長4天的根長(cm)比較

表5.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株在300mmol/L的甘露醇脅迫下生長4天的根長(cm)比較


表6.含有ZmGST7的轉35S-ZmGST7的T3代植株、轉RD29AP-ZmGST7的T3代植株與未轉化植株在400mmol/L的甘露醇脅迫下生長4天的根長(cm)比較

本實施例的結果表明，玉米基因ZmGST7能夠明顯促進植物生長，并在低水平的滲透脅迫下能夠提高植物的抗性。
序列表<160>2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaaagcttac gcatgatttg atggag 26<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2agtctagaaa ccctttattc ctgatgattg 30
權利要求
1.一種促進植物生長和/或提高植物抗性的方法，是將植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因導入目的植物，得到生長加快和/或抗性提高的轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽轉移酶來源于玉米、擬南芥、鹽地堿篷或水稻。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽轉移酶來源于玉米。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽轉移酶為ZmGST7。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因通過植物表達載體導入目的植物；所述植物表達載體為Ti類質粒載體或病毒載體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于在所述表達載體中，啟動所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因轉錄的啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述表達載體為35S-ZmGST7。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于在所述表達載體中，啟動所述植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因轉錄的啟動子是擬南芥rd29A基因啟動子。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述表達載體為RD29AP-ZmGST7。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進植物生長和/或提高植物抗性的方法。本發(fā)明所提供的促進植物生長和/或提高植物抗性的方法，是將植物谷胱甘肽轉移酶的編碼基因導入目的植物，得到生長加快和/或抗性提高的轉基因植株。所述植物谷胱甘肽轉移酶可來源于玉米、擬南芥、鹽地堿篷或水稻，優(yōu)選來源于玉米。所述植物谷胱甘肽轉移酶優(yōu)選為ZmGST7。ZmGST7在正常條件下可以促進轉基因擬南芥的生長，并且在低濃度的滲透脅迫下能夠提高植物抗性。本發(fā)明的方法對于培育新型耐逆園林植物和農作物具有重要實用價值和經濟效益。
文檔編號A01G7/06GK1692701SQ200510069380
公開日2005年11月9日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權日2005年5月16日
發(fā)明者王國英, 鄭軍, 王建華, 趙晉鋒, 曹永國 申請人:中國農業(yè)大學