專利名稱：：荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法，尤其是一種荒漠苔蘚Tortuladesertorum及其生物結(jié)皮快速增殖方法。背景資料土壤生物結(jié)皮在干旱_半干旱地區(qū)分布廣泛，特別是在維管植物難以生存地區(qū)，對(duì)當(dāng)?shù)赝恋刭Y源維持和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。生物結(jié)皮有以下幾方面主要功能固氮作用，為荒漠植物和土壤微生態(tài)系統(tǒng)提供氮素；把金屬螯合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌招螒B(tài)；提高土壤積聚能力，降低風(fēng)蝕和沙土流失；構(gòu)建一個(gè)粗糙表面，從而可以捕獲水分或者養(yǎng)分含量豐富顆粒。這些功能決定了其在沙漠修復(fù)和植被管理當(dāng)中重要作用。但沙漠生物結(jié)皮極易遭受破壞，一旦遭到破壞，會(huì)加速沙漠化進(jìn)程。根據(jù)結(jié)皮大小，一塊完整結(jié)皮自然恢復(fù)時(shí)間從幾年到十幾年不等，周期漫長(zhǎng)。苔蘚是幾種生物中最高形式，苔蘚結(jié)皮代表結(jié)皮進(jìn)化最高水平，進(jìn)一步改良，有可能在上面產(chǎn)生更高級(jí)植物；如果苔蘚結(jié)皮退化，則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌问浇Y(jié)皮如藻結(jié)皮，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)樯衬?，因此苔蘚結(jié)皮是沙漠向土壤過(guò)渡標(biāo)志，可以作為沙漠環(huán)境條件改善與否指示物。如果能人工快速培養(yǎng)出大量的荒漠苔蘚材料，經(jīng)過(guò)馴化后與其他的工程手段相結(jié)合，勢(shì)必能夠在荒漠地區(qū)荒漠化治理和生態(tài)重建方面起到重要作用。用于城市綠地和高爾夫球場(chǎng)等功能區(qū)的生物材料多為草坪。在北方干旱-半干旱地區(qū)維持草坪往往需要人工澆灌，造成地下水資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。這主要是因?yàn)楦叩戎参锶绺叽髥棠?、草類?9%的水分通過(guò)蒸散消耗而損失掉，僅1%的水分用于光合作用。而相對(duì)低等的苔蘚植物，特別是荒漠苔蘚植物，在其長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)形成抗御水分喪失的外在結(jié)構(gòu)和適應(yīng)極端干燥的代謝機(jī)制，其在生長(zhǎng)過(guò)程中需要非常少量的水分就可以維持自身的生長(zhǎng)和繁殖，并且全部的水分來(lái)自空氣當(dāng)中，因此非常適合用于干旱-半干旱地區(qū)城市綠化。如果能提高其生長(zhǎng)速度并用于城市綠地建設(shè)，就能降低草坪耗水量，從而減輕城市供水壓力。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利(申請(qǐng))號(hào)為200310125467.0的專利提供一種被培育的苔蘚耐干燥性優(yōu)良、且在苔蘚培育其間易形成群落的苔蘚培育片，和使用該苔蘚培育片的結(jié)構(gòu)綠化方法。該專利所用的生物材料為日本砂蘚(RacomitriumjaponicumDozyetMolk.)、硬葉砂蘚(RacomitriumbarbuloidesCard.)和灰蘚(HypunumplumaeformeWils.)三種非荒漠地區(qū)生長(zhǎng)的耐干苔蘚，其采用整個(gè)配子體種植在紙張、纖維碎末上，施加肥料后形成一般的苔蘚結(jié)皮，沒(méi)有涉及荒漠苔蘚培養(yǎng)，而該專利獲得的苔蘚結(jié)皮僅能夠用于相對(duì)濕潤(rùn)地區(qū)墻體綠化或者其他場(chǎng)所綠化，不能用于干旱地區(qū)或者荒漠地區(qū)生態(tài)修復(fù)。進(jìn)一步檢索中，尚未發(fā)現(xiàn)通過(guò)組織培養(yǎng)、簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮的快速繁殖的報(bào)道。有鑒于此，加上我國(guó)當(dāng)前沙漠化及城市沙塵暴情勢(shì)加劇，三北防護(hù)林部分區(qū)域?qū)嵭Ш蛧?yán)重耗費(fèi)地下水資源，荒漠苔蘚繁殖技術(shù)突破及苔蘚結(jié)皮構(gòu)建方法在生態(tài)保護(hù)方面顯得格外重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于干旱地區(qū)綠化、荒漠化治理的苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，解決荒漠苔蘚自然繁殖速度緩慢技術(shù)難題，為干旱-半干旱地區(qū)城市綠化和荒漠化治理提供可行的生物材料。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟l:荒漠環(huán)境采集的干燥荒漠苔蘚TortuladesertorumBroth.配子體的活性恢復(fù)；步驟2:荒漠苔蘚快速繁殖上述活性恢復(fù)材料的葉片與基體分離，將分離后的葉片植入載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，得到該荒漠苔蘚培養(yǎng)材料；步驟3:荒漠苔蘚結(jié)皮構(gòu)建分離步驟2得到的苔蘚配子體葉片，將分離后的葉片在載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)出的原絲體移栽至載有河沙的培養(yǎng)皿中，改變培養(yǎng)溫度，再培養(yǎng)形成完整的苔蘚結(jié)皮；步驟2和3中培養(yǎng)基選擇Knop培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液，其組成為1.0g/LCa(N03)24H20、0.25g/LKH2P04、0.12g/LKCl、0.25g/LMgS047H20以及微量FeCl36H20。步驟4:苔蘚生物結(jié)皮微組裝與抗性馴化步驟3中培育出的苔蘚結(jié)皮壓入培養(yǎng)盤中，放置在室內(nèi)環(huán)境中，噴水保持濕潤(rùn)，使其蔓延生長(zhǎng)成片狀；上述步驟1是將干燥的苔蘚樣品以完全復(fù)水方式復(fù)活48小時(shí)。上述步驟1中復(fù)水溫度控制在0°C-4°C，光照強(qiáng)度〈20WnolnT2s—1PPFD，光照周期8小時(shí)。上述步驟2中培養(yǎng)條件具體為溫度分別為白天20。C、黑夜1(TC，濕度控制在65%-80%，光照強(qiáng)度為85-120Mmolm—2s_1PPFD。上述步驟2中，培養(yǎng)光周期設(shè)定為16小時(shí)，培養(yǎng)周期為2個(gè)月。上述步驟3中在載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件具體為溫度分別為白天20。C、黑夜1(TC，濕度控制在65%-80%，光照強(qiáng)度為85-120陶olra—2s—ipPFD，培養(yǎng)時(shí)間為一個(gè)月。上述步驟3中改變培養(yǎng)溫度，是指將培養(yǎng)溫度從白天2(TC和黑夜l(TC改變?yōu)榘滋?5。C和黑夜15'C，再培養(yǎng)一個(gè)月。上述步驟3中培養(yǎng)基質(zhì)是砂粒、砂土混合物，其中砂和土的質(zhì)量比>2。上述步驟2或3中所涉及的苔蘚材料無(wú)消毒處理、培養(yǎng)基中不含糖或者激素。上述步驟4中馴化光照強(qiáng)度按照l(shuí)OOPmolm—2s—'PPFD，150Wnolm—2s—'PPFD，250Mmolm—2s—1PPFD，400Mmolm—2s—'PPFD依次遞增。本發(fā)明的有益效果荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮具有抗干旱、耗水量小、固氮、抗風(fēng)沙以及降低水土流失等生態(tài)作用，快速增殖技術(shù)可以推進(jìn)苔蘚植物在干旱-半干旱地區(qū)城市綠地和沙漠化修復(fù)中的應(yīng)用，具有顯著的生態(tài)意義。從結(jié)皮產(chǎn)生周期上，一塊完整的荒漠苔蘚結(jié)皮，依靠自然生長(zhǎng)條件需要10年左右的時(shí)間才能夠形成；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)，僅需要2-3個(gè)月時(shí)間就能夠形成一片初始荒漠苔蘚結(jié)皮，改變了荒漠苔蘚結(jié)皮依賴惡劣自然環(huán)境自我繁殖現(xiàn)狀，為荒漠苔蘚在荒漠地區(qū)土壤沙漠化人工修復(fù)應(yīng)用提供基礎(chǔ)?；哪μ\結(jié)皮不同于草坪，僅需要空氣相對(duì)含水量在30%以上就可以生長(zhǎng)，無(wú)須人工灌溉，以北京地區(qū)為例，草坪更換為苔蘚結(jié)皮單位面積將節(jié)約水量約120毫米。圖1是荒漠苔蘚配子體復(fù)水方式示意圖其中圖A為10(F?？諝鈴?fù)水，圖B為濾紙復(fù)水，圖C為完全復(fù)水。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)例l:荒漠苔蘚配子體活力恢復(fù)對(duì)荒漠苔蘚從干燥的環(huán)境中復(fù)活方法參見圖1。其中圖A為100%空氣復(fù)水，圖B為濾紙復(fù)水，圖C為完全復(fù)水。用帶蓋子敞口燒瓶裝入1/4-1/3體積去離子水a(chǎn)，將干燥苔蘚配子體c放入尼龍網(wǎng)b后懸掛在液體上方，該復(fù)水方法為100%空氣復(fù)水；將干燥苔蘚c放置在濕濾紙d復(fù)水，該方式為接觸式濾紙復(fù)水；將干燥苔蘚完全浸沒(méi)于去離子水a(chǎn)中為完全復(fù)水方式。按照公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm測(cè)定葉綠素?zé)晒?，其中Fm/Fv為最大葉綠素?zé)晒猓現(xiàn)0為暗適應(yīng)光量子產(chǎn)量，F(xiàn)m為最大光量子產(chǎn)量。熒光的測(cè)定結(jié)果，完全復(fù)水30分鐘后刺葉墻蘚葉片最大葉綠素?zé)晒鉃?.651，接近穩(wěn)定后最大值0.695，表明配子體光合作用能力短時(shí)間內(nèi)已經(jīng)完全恢復(fù)，證明完全復(fù)水方式最適合荒漠苔蘚活性恢復(fù)；其它兩種復(fù)活方式極易造苔蘚干配子體死亡，復(fù)活率低。實(shí)例2:荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖繁殖體確定荒漠苔蘚快速增殖的實(shí)驗(yàn)材料主要采用了配子體的各部分如頂芽、配子體基部以及按照生長(zhǎng)時(shí)間劃分的黃葉、黃綠葉、綠葉和幼葉，各組織的再生潛力參見表l。除碎片無(wú)法計(jì)算外，其它組織的原絲體都有發(fā)生，頂芽產(chǎn)生最大面積的原絲體。就單個(gè)配子體產(chǎn)生的新芽數(shù)目而言，利用頂芽和配子體基部培養(yǎng)單株最高產(chǎn)芽16個(gè)，利用碎片單株產(chǎn)芽量?jī)H0.4，但是利用離體葉片單株產(chǎn)芽達(dá)200個(gè)，遠(yuǎn)高于其他兩種方式，因此離體葉片是荒漠苔蘚快速增殖的最佳選擇。表1外植體對(duì)荒漠苔蘚再生能力影響(平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)例3:荒漠苔蘚及其結(jié)皮快速增殖環(huán)境因素確定培養(yǎng)溫度是荒漠苔蘚快速增殖的一個(gè)重要影響因素，按照荒漠苔蘚原生長(zhǎng)地溫度變化情況，設(shè)定了兩種晝夜溫度20°C(白天)和15。C(黑夜)、25°C(白天)和15'C(黑夜)，評(píng)價(jià)溫度梯度對(duì)荒漠苔蘚再生潛力的影響參見表2。較低溫度2(TC/1(TC培養(yǎng)原絲體面積達(dá)到1.28cm2，與25TVl5r下原絲體面積極顯著差異；較高溫度25'C/15'C產(chǎn)生了4.26個(gè)芽，顯著高于前者，從而高溫下生物量也遠(yuǎn)高于低溫條件，證明適度高溫利于促進(jìn)新芽的產(chǎn)生，低溫利于原絲體的培育。表2不同培養(yǎng)溫度對(duì)荒漠苔蘚刺葉墻蘚綠葉再生能力影響(平均值)再生潛力晝夜溫度20°C/10°C晝夜溫度25。C/15。C原絲體發(fā)生面積(cm2)1.28±0.120.53±0.15新芽個(gè)數(shù)1.33±0.254.26±1.14生物量(mg)1.55±0.323.07±0.49培養(yǎng)濕度、光照周期和光照強(qiáng)度是決定荒漠苔蘚人工快速增殖以及是否能夠推廣至干旱地區(qū)綠化的重要因素，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定最適合荒漠苔蘚快速人工增殖的相對(duì)濕度為60-85%，光照強(qiáng)度在60Mmolm_2s—'和光周期為16h。方差分析結(jié)果表明，相對(duì)濕度和光照周期對(duì)荒漠苔蘚人工培育具有顯著影響，特別是相對(duì)濕度低于30%或者高于90%對(duì)原絲體發(fā)育產(chǎn)生顯著負(fù)影響，但是在北方干旱-半干旱地區(qū)，全面絕大多數(shù)天數(shù)室外空氣濕度可以維持在30-70%之間，非常適合荒漠苔蘚的生長(zhǎng)。另外，光照強(qiáng)度不同水平間對(duì)荒漠苔蘚生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異，表明荒漠苔蘚具有非常廣泛的光適應(yīng)性，用于構(gòu)建城市綠地存在可能性。實(shí)例4:荒漠苔蘚快速增殖方法選擇完全復(fù)水的離體綠葉作為繁殖體，植于含有Knop固體培養(yǎng)基表層(Kn叩培養(yǎng)基組成為1.0g/LCa(N03)2■、0.25g/LKH2P04、0.12g/LKC1、0.25g/LMgS047H20以及微量FeCl36H20，1.2%的瓊脂)的玻璃培養(yǎng)皿中，輕壓使葉片基部埋于培養(yǎng)基內(nèi)，用封口膠密封。培養(yǎng)溫度設(shè)定在晝夜溫度分別為25°C(白天)和15。C(夜晚)，光周期為16h，培養(yǎng)一個(gè)月后可得到大量原絲體，培養(yǎng)2個(gè)月后得到大量的配子體幼體。實(shí)例5:荒漠苔蘚生物結(jié)皮構(gòu)建構(gòu)建荒漠苔蘚結(jié)皮是荒漠苔蘚用于干旱地區(qū)綠地和荒漠化地區(qū)生態(tài)修復(fù)的重要一個(gè)環(huán)節(jié)?；哪μ\的人工快速增殖特征的研究發(fā)現(xiàn)，荒漠苔蘚在20°C(白天)和1(TC(夜晚)中、瓊脂固體培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生更大面積的原絲體，在25'C(白天)和15°C(黑夜)中、沙礫或沙土培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生更多的新芽，鑒于此將荒漠苔蘚結(jié)皮培育分為兩個(gè)階段原絲體誘導(dǎo)、新芽發(fā)展與原始結(jié)皮形成兩個(gè)階段。離體綠葉植于Kn叩-瓊脂固體培養(yǎng)基中，在2(TC(白天)和l(TC(夜晚)中培養(yǎng)l個(gè)月；然后移植于去營(yíng)養(yǎng)的沙礫中，輕壓后噴霧狀Knop營(yíng)養(yǎng)液，在25°C(白天)和15°C(夜晚)中培養(yǎng)1個(gè)月，最終形成面積為約15cm2的初始荒漠苔蘚結(jié)皮。實(shí)驗(yàn)表明荒漠苔蘚結(jié)皮可以在相對(duì)短期內(nèi)人工培育形成，為在生態(tài)修復(fù)中規(guī)模化應(yīng)用荒漠苔蘚生物結(jié)皮開辟一條新途徑。實(shí)例6:荒漠苔蘚生物結(jié)皮的景觀特征與生態(tài)功能比較人工培育結(jié)皮相對(duì)于野生結(jié)皮形貌特征比較表明，室內(nèi)培養(yǎng)荒漠苔蘚結(jié)皮配子體規(guī)整，顏色鮮艷，且地上部分高度超過(guò)lOrnm，非常適合作為綠地建設(shè)生物材料。人工培育與野生荒漠苔蘚生物結(jié)皮微觀顯示，人工培育的苔蘚生物結(jié)皮同野生結(jié)皮相似，假根發(fā)達(dá)，都具有膠結(jié)固沙的能力，非常適合用于荒漠化地區(qū)土壤改良和生態(tài)固沙。本發(fā)明的方法充分利用組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)荒漠苔蘚人及其生物結(jié)皮的人工快速培育，是荒漠苔蘚人工繁殖的新突破，為荒漠化治理與干旱地區(qū)城市綠化提供新材料應(yīng)用的可能性。權(quán)利要求1、一種荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征在于，包括如下步驟步驟1荒漠環(huán)境采集的干燥荒漠苔蘚TortuladesertorumBroth.配子體的活性恢復(fù)；步驟2荒漠苔蘚快速繁殖上述活性恢復(fù)材料的葉片與基體分離，將分離后的葉片植入載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，得到該荒漠苔蘚培養(yǎng)材料；步驟3荒漠苔蘚結(jié)皮構(gòu)建分離步驟2得到的苔蘚配子體葉片，將分離后的葉片在載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)出的原絲體移栽至載有河沙的培養(yǎng)皿中，改變培養(yǎng)溫度，再培養(yǎng)形成完整的苔蘚結(jié)皮；步驟2和3中培養(yǎng)基選擇Knop培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液，其組成為1.0g/LCa(NO3)2·4H2O、0.25g/LKH2PO4、0.12g/LKCl、0.25g/LMgSO4·7H2O以及微量FeCl3·6H2O；步驟4苔蘚生物結(jié)皮微組裝與抗性馴化步驟3中培育出的苔蘚結(jié)皮壓入培養(yǎng)盤中，放置在室內(nèi)環(huán)境中，噴水保持濕潤(rùn)，使其蔓延生長(zhǎng)成片狀；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是上述步驟1是將干燥的苔蘚樣品以完全復(fù)水方式復(fù)活48小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是上述步驟1中復(fù)水溫度控制在(TO4'C，光照強(qiáng)度〈20Mmolm—2s—'PPFD，光照周期8小時(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是上述步驟2中培養(yǎng)條件具體為溫度分別為白天20'C、黑夜10'C，濕度控制在65%-80%，光照強(qiáng)度為85-120Wnolm—2s^PPFD。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是上述步驟2中，培養(yǎng)光周期設(shè)定為16小時(shí)，培養(yǎng)周期為2個(gè)月。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是:上述步驟3中在載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件具體為溫度分別為白天20。C、黑夜10。C，濕度控制在65%-80%，光照強(qiáng)度為85-120MmolnT2s^PPFD，培養(yǎng)時(shí)間為一個(gè)月。7、根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是上述步驟3中改變培養(yǎng)溫度，是指將培養(yǎng)溫度從白天20'C和黑夜l(rC改變?yōu)榘滋?5'C和黑夜15°C，再培養(yǎng)一個(gè)月。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是:上述步驟3中培養(yǎng)基質(zhì)是砂粒、砂土混合物，其中砂和土的質(zhì)量比〉2。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，其特征是:上述步驟4中馴化光照強(qiáng)度按照l(shuí)OOMmoln(-2)s(-1)PPFD，150,1m—2s(-1)PPTO，250Mmolm(-2)s—1PPFD,400Mmolm(-2)s(-1)PPFD依次遞增。全文摘要一種環(huán)保
技術(shù)領(lǐng)域：
的荒漠苔蘚及其生物結(jié)皮快速增殖方法，步驟如下荒漠環(huán)境采集的干燥荒漠苔蘚配子體的活性恢復(fù)；將活性恢復(fù)材料的葉片與基體分離，將分離后的葉片植入載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)得到該荒漠苔蘚培養(yǎng)材料；分離得到的苔蘚配子體葉片，將分離后的葉片在載有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)出的原絲體移栽至載有河沙的培養(yǎng)皿中，改變培養(yǎng)溫度，再培養(yǎng)形成完整的苔蘚結(jié)皮；將培育出的苔蘚結(jié)皮壓入培養(yǎng)盤中，放置在室內(nèi)環(huán)境中，噴水保持濕潤(rùn)，使其蔓延生長(zhǎng)成片狀。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了荒漠苔蘚人及其生物結(jié)皮的人工快速培育，為荒漠化治理與干旱地區(qū)城市綠化提供新材料應(yīng)用的可能性。文檔編號(hào)A01H4/00GK101268739SQ20081003555公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2008年4月3日優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日發(fā)明者東岳,艷王,王正武,許書軍申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)