專(zhuān)利名稱(chēng)：微生物葉面增效劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體是指微生物葉面增效劑。
背景技術(shù)：
我國(guó)微生物肥料的研發(fā)和應(yīng)用始于20世紀(jì)50年代，由于研究經(jīng)費(fèi)匱乏，長(zhǎng)期以 來(lái)，微生物肥料產(chǎn)業(yè)整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、利用程度較低等問(wèn)題。 目前世界上已有70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)開(kāi)發(fā)應(yīng)用微生物肥料，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，微 生物肥料的使用已達(dá)肥料總量的20%以上，總產(chǎn)量以10% 20%的速度遞增。而我國(guó)年產(chǎn) 微生物肥僅占化肥產(chǎn)量的0. 5%。據(jù)專(zhuān)家測(cè)算，如果這一比例達(dá)到3%，就能減少50萬(wàn)噸化 肥用量，增產(chǎn)糧食100億公斤。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，作物種植面積廣闊。農(nóng)業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)，是“安天下的 產(chǎn)業(yè)”。我國(guó)和世界大多數(shù)農(nóng)業(yè)國(guó)家一樣，目前均面臨著因過(guò)量使用化肥、農(nóng)藥、激素而造成 的環(huán)境污染、土壤酸化板結(jié)、地力衰退、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、有毒化學(xué)物質(zhì)殘留超標(biāo)、危害人類(lèi) 健康等日趨嚴(yán)峻問(wèn)題。尤其是食品安全、餐桌污染給人類(lèi)帶來(lái)的危害，已引起國(guó)際社會(huì)普遍 關(guān)注。因此，發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，生產(chǎn)綠色食品，保障人民健康，倍受各國(guó)政府重視和支持。“綠 色、環(huán)保、健康”已成為當(dāng)今社會(huì)發(fā)展的主題?！敖鉀Q21世紀(jì)農(nóng)業(yè)問(wèn)題，關(guān)鍵靠生物技術(shù)”，已 成為世界各國(guó)專(zhuān)家、政要的共同認(rèn)識(shí)。利用生物技術(shù)修復(fù)土壤、降解毒害、消除污染、促進(jìn)植 物和動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)防病抗逆能力、提高產(chǎn)量改善品質(zhì)，其獨(dú)特卓越的功效已為農(nóng)業(yè)工作者 所認(rèn)識(shí)和接受。生物工程，被喻為“21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”。應(yīng)用生物技術(shù)研制的綠色食品生 產(chǎn)資料和環(huán)保產(chǎn)品，具有巨大的市場(chǎng)需求和發(fā)展空間。我國(guó)微生物肥料的市場(chǎng)前景極為廣 闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用微生物菌種和先進(jìn)的生物技術(shù)研制微生物葉面增效劑。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的工藝流程路線(xiàn)如下1、側(cè)孢芽孢桿菌制劑的制備菌種(安瓿管)——試管斜面菌種培養(yǎng)——搖瓶菌 種培養(yǎng)——種子罐深層液體發(fā)酵培養(yǎng)——封閉式固體發(fā)酵箱培養(yǎng)——半成品——檢測(cè)合 格。2、弗氏鏈霉菌代謝物的制備菌種(安瓿管)——菌種誘變——試管斜面——搖 瓶培養(yǎng)——種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)——發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)——后處理——半成品——檢 測(cè)合格。3、微生物葉面增效肥的制備發(fā)酵好的側(cè)孢芽孢桿菌制劑確定活菌數(shù)，配制含量50 100億/克側(cè)孢芽孢桿 菌制劑和發(fā)酵好的弗氏鏈霉菌代謝物按重量百分比2 5% 95 98%比例混配——檢 測(cè)——包裝一一成品。
一、原料菌選育通過(guò)對(duì)土壤中大量微生物的分離、篩選，將防病、促生長(zhǎng)、抗逆性強(qiáng)的側(cè)孢芽孢桿 菌作為生產(chǎn)菌株之一，該菌株經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所進(jìn)行了菌種毒力 試驗(yàn)，證實(shí)該菌株按食品經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。該菌株的中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心菌株保藏編號(hào)為CGMCC NO. 1755 ；從土壤中分離出另一株 菌株鏈霉菌，該菌株促長(zhǎng)、防病、抗病功效顯著，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為弗氏鏈 霉菌，該菌株的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心菌株保藏編號(hào)為CGMCC NO. 2721。原料菌株之一側(cè)孢芽孢桿菌的特性1、菌種選育形態(tài)學(xué)特性形狀及排列菌體桿狀，端稍細(xì)，單生成對(duì)、成堆；芽孢呈橢圓形，(1 1. 2) X O. 5 幻μ m,附著于芽孢一側(cè)有獨(dú)木舟形體，芽孢在紡錘形孢囊中側(cè)生、中生。運(yùn)動(dòng)及鞭毛能運(yùn)動(dòng)。2、生理特性(1)明膠穿刺培養(yǎng)液化陽(yáng)性；液化速度慢，弱。(2)淀粉水解陰性。(3)與氧的關(guān)系有氧、無(wú)氧均能生長(zhǎng)。(4)酪蛋白水解陽(yáng)性。(5)酪氨酸水解陰性。(6) 二羥丙酮的形成陰性。3、培養(yǎng)學(xué)特性培養(yǎng)時(shí)任選一種培養(yǎng)基培養(yǎng)
權(quán)利要求
1.微生物葉面增效劑，其特征在于它的制備工藝流程路線(xiàn)如下(1)側(cè)孢芽孢桿菌制劑的制備菌種——試管斜面菌種培養(yǎng)一搖瓶菌種培養(yǎng)一種 子罐深層液體發(fā)酵培養(yǎng)一封閉式固體發(fā)酵箱培養(yǎng)一側(cè)孢芽孢桿菌制劑半成品一檢 測(cè)合格；(2)弗氏鏈霉菌代謝物的制備菌種——菌種誘變——試管斜面菌種培養(yǎng)——搖瓶菌 種培養(yǎng)——種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)——發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)——后處理——弗氏鏈霉菌代 謝物半成品——檢測(cè)合格；(3)微生物葉面增效肥的制備發(fā)酵好的側(cè)孢芽孢桿菌制劑確定活菌數(shù)，配制含量50 100億/克側(cè)孢芽孢桿菌制劑 半成品和發(fā)酵好的弗氏鏈霉菌代謝物按重量比2 5% 98 95%比例混配，然后檢測(cè)、 包裝、制得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng) 基以及培養(yǎng)方式為以下任選一種洋菜培養(yǎng)基培養(yǎng)、洋菜斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、J-肉汁培養(yǎng)液 培養(yǎng)、明膠穿刺培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述側(cè)孢芽孢桿菌制劑的 生產(chǎn)工藝為菌種——斜面菌種培養(yǎng)——搖瓶菌種培養(yǎng)——種子罐深層液體發(fā)酵培養(yǎng)—— 封閉式固體發(fā)酵箱培養(yǎng)——側(cè)孢芽孢桿菌制劑半成品——檢測(cè)合格，其中，種子罐發(fā)酵過(guò) 程中的溫度為32士 1°C、通氣條件1 0.3 0.5V/V、發(fā)酵時(shí)間為18 20小時(shí)；封閉式固 體發(fā)酵箱培養(yǎng)的條件為濕度60% 90%、溫度28 35°C、發(fā)酵時(shí)間為96 120小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述弗氏鏈霉菌代謝物 的制備工藝菌種——菌種誘變——試管斜面培養(yǎng)——搖瓶培養(yǎng)——種子罐液體發(fā)酵培 養(yǎng)——發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)——后處理——弗氏鏈霉菌代謝物半成品——檢測(cè)合格；其 中，種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)中的發(fā)酵溫度為^±rC、通氣條件1 0.5 0.8￥八、發(fā)酵時(shí)間 為20 M小時(shí)；發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為，發(fā)酵溫度為觀士11、通氣條件1 0.8 1. 2V/V、發(fā)酵時(shí)間為40 48小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于弗氏鏈霉菌的斜面培養(yǎng)基 為以下任選一種察氏培養(yǎng)基、葡萄糖天冬素培養(yǎng)基、甘油天冬素培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng) 基、ISP-2培養(yǎng)基、燕麥粉培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、桑塔氏培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述工藝(2)弗氏鏈霉菌 代謝物的制備中，菌種誘變方法如下(1)紫外線(xiàn)誘變30瓦的紫外燈預(yù)熱30分鐘后，把盛有70ml用生理鹽水制備的指標(biāo)為5. 7 X IO7個(gè)/ml 的孢子懸液的玻璃缸置于紫外燈管30厘米處，玻璃缸下面放置磁力攪拌器，同時(shí)把無(wú)菌的 轉(zhuǎn)子放到玻璃缸中；開(kāi)動(dòng)攪拌器，開(kāi)啟紫外燈并記時(shí)，分別在0、5、10、15、20、30、40分鐘定 時(shí)取樣IOml置于無(wú)菌離心管中備用；(2)亞硝基胍誘變稱(chēng)取一定量的亞硝基胍，用丙酮助溶，用PH6. 0的磷酸鹽緩沖液配制成20mg/ml的亞硝 基胍母液，丙酮體積與緩沖液體積之比為1 9;在70ml用pH6. 0的磷酸鹽緩沖液制備成孢子數(shù)為5. 7 X IO7個(gè)/ml的孢子懸液，在孢子懸液中加7ml亞硝基胍母液，置200RPMJ8°C搖床處理；分別在作用0、5、10、15、20、25、 30分鐘后定時(shí)取樣IOml于無(wú)菌離心管中3000RPM10分鐘離心，生理鹽水洗滌三次，最后用 IOml生理鹽水懸浮備用；(3)硫酸二乙酯誘變?nèi)ml硫酸二乙酯用Iml丙酮助溶，加入70ml用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液制備成的孢子 數(shù)為5. 7X IO7個(gè)/ml的孢子懸液，置200RPM 28°C搖床處理；0、5、10、15、20、25、30分鐘定 時(shí)取樣IOml于離心管中，每個(gè)離心管加入0. 6ml36%的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，3000RPM10分 鐘離心，生理鹽水洗滌三次，最后用IOml生理鹽水懸浮備用和抑菌物質(zhì)的高產(chǎn)菌多株；這 些高產(chǎn)菌的抑菌活性分別是原始菌株的2-5倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述制備工藝⑵弗氏鏈 霉菌代謝物的制備中，其后處理過(guò)程為發(fā)酵液通過(guò)固液分離，固體部分采用閃蒸法干燥，液 體部分采用噴霧法干燥，合并干粉為弗氏鏈霉菌代謝物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述制備工藝(3)微生物 葉面增效肥的制備將經(jīng)過(guò)種子罐液體發(fā)酵和封閉式固體發(fā)酵的側(cè)孢芽孢桿菌活菌制劑配 制含量50 100億/克側(cè)孢芽孢桿菌半成品與經(jīng)過(guò)種子罐液體深層發(fā)酵和發(fā)酵罐連續(xù)發(fā) 酵工藝生產(chǎn)的弗氏鏈霉菌代謝產(chǎn)物按重量百分比為2 5% 95 98%比例混配。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物葉面增效劑，其特征在于所述產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)為有效 活菌數(shù)彡2億/克，雜菌率彡5%, pH值為6. 0-9. 5，水分彡10 %，細(xì)度是通過(guò)孔徑0. 18mm 的標(biāo)準(zhǔn)篩，通過(guò)率> 90%，刺激圈> 20mm，抑菌率> 50% ；弗氏鏈霉菌代謝產(chǎn)物中含有玉 米素、玉米素核苷、赤霉素、生長(zhǎng)素，以及脫落酸、萘乙酸；玉米素含量28000 41000ng/g ； 赤霉素含量300500 420000ng/g ；生長(zhǎng)素含量15700 32500ng/g ；脫落酸含量140 220ng/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體是指微生物葉面增效劑，本發(fā)明的制備工藝流程路線(xiàn)如下(1)側(cè)孢芽孢桿菌WY9701制劑的制備；(2)弗氏鏈霉菌BD04002代謝物的制備；(3)微生物葉面增效肥的制備；本發(fā)明采用先進(jìn)的“液體深層發(fā)酵+封閉式固體發(fā)酵”的連續(xù)發(fā)酵工藝，利用全封閉自控式固體發(fā)酵設(shè)備，使固體發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程都處于全封閉的自動(dòng)監(jiān)控之下，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基成分、配方、溫度、濕度、通氣、pH值等環(huán)境條件進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)、電子顯示、自動(dòng)控制，不僅大幅度提高產(chǎn)量，而且保證了微生物葉面增效劑的質(zhì)量。
文檔編號(hào)C05F11/08GK102134168SQ201010103139
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者張新雄 申請(qǐng)人:東莞市保得生物工程有限公司