專利名稱：以成熟胚為外植體的君子蘭離體快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物繁殖方法，具體涉及是花卉的無性快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，是根據(jù)植物細(xì)胞的全能性，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等)、組織(如形成層、表皮、皮層、胚乳等)或細(xì)胞(如 大孢子、小孢子、體細(xì)胞等)以及原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人 工條件下，誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，形成完整的植株或產(chǎn)生具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其它 產(chǎn)品的技術(shù)。由植物組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的再生植株除了極低的體細(xì)胞無性系變異外基本都能 保持親本(外植體來源植株)的優(yōu)良性狀。植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)明以來已經(jīng)取得了很大的 進(jìn)展，自上世紀(jì)60年代以來植物組織培養(yǎng)已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究階段成為一種大規(guī)模成批量 的工廠化生產(chǎn)方法。君子蘭，是石蒜科君子蘭屬的多年生草本觀賞植株。原產(chǎn)南非高山，性 喜溫涼，于本世紀(jì)初經(jīng)由德國(guó)和日本引入我國(guó)，并安家落戶。是我國(guó)名貴花卉，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較 高。它株型端莊、葉、花、果并美，深受國(guó)內(nèi)外花卉愛好者的青睞。目前，君子蘭的繁殖方式 主要為種子繁殖與分株繁殖，而這兩種方式的繁殖速度都很慢君子蘭一年只開一次花，且 種子需要9個(gè)月才能成熟；分株繁殖一年最多分出1 3株。由于君子蘭高度雜合，種子繁 殖得到珍品君子蘭的得率很低，即便以珍品君子蘭做父母本得到珍品的幾率仍很低，珍品 君子蘭在國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)一直供不應(yīng)求。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)離體快速繁殖君子蘭可以大 規(guī)模產(chǎn)生株型統(tǒng)一的珍品君子蘭，進(jìn)一步滿足國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)的需求。參考國(guó)際國(guó)內(nèi)相關(guān)文 獻(xiàn)我們得知前人所做的君子蘭組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)雖然已經(jīng)初步獲得成功，但脫分化率及再生率 低、依品種不同平均一塊外植體能再生出零點(diǎn)幾到二點(diǎn)幾株苗。這就限制了君子蘭組織培 養(yǎng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明可使君子蘭在一年以內(nèi)實(shí)現(xiàn)真正的快速繁殖，非常適 合工廠化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服君子蘭傳統(tǒng)繁殖方法產(chǎn)生君子蘭個(gè)體株型千差萬別、繁殖速度慢的缺點(diǎn)； 也為了克服前人君子蘭組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中脫分化率低、分化率低、再生周期長(zhǎng)、不適合工廠化 生產(chǎn)的缺點(diǎn)。提供一種以成熟胚為外植體的君子蘭離體快速繁殖方法本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是1.外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)取成熟果實(shí)中的胚，放入無菌超凈臺(tái)中，用75% (體積/體積)酒精浸泡30 60秒，用0. 1 0. 2% (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡2 5分鐘，無菌水沖洗3 5遍，將裸胚上黃色致密的長(zhǎng)度大約2mm的一端切下，接種在含2， 4-D2 4mg/L、蔗糖3 4 % (質(zhì)量/體積)、瓊脂0. 45 0. 7 % (質(zhì)量/體積)的MS培 養(yǎng)基上，20 30°C每天40W日光燈照射8 9小時(shí)。40 50天繼代一次，待愈傷(黃色) 或者綠色膨大長(zhǎng)到直徑5mm左右時(shí)即可誘導(dǎo)分化。2.不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黃色愈傷或綠色膨大組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:MS+KT(0. 25 0. 5mg/L)+2，4-D(0. 75 1. 5mg/L) +3 ~ 4% (質(zhì)量 / 體積)蔗糖 +0. 45 0. 7 % (質(zhì)量/體積)瓊脂，40 50天繼代一次，20 30°C每天光照8 12小 時(shí)。30 40天可見再生芽產(chǎn)生。繼代4個(gè)月時(shí)從一塊愈傷可分化出200多株再生芽苗。3.根的誘導(dǎo)再生植株轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA (1 2mg/L) +蔗糖2 % (質(zhì)量/體積)+瓊 脂0. 45 0. 7% (質(zhì)量/體積)的生根培養(yǎng)基上，20 30°C每天10小時(shí)左右光照。4.再生植株移栽植株生根后即可移栽。腐殖土 121°C滅菌30 60分鐘。移栽 前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈。7天左右澆一次透水便可成活。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于取材不受季節(jié)限制(成熟種子可長(zhǎng)期保存)；外植體體積小， 適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因；基于每粒種子的基因背景不盡相同(君子蘭高度雜合，大多采 用異花授粉)，可在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因沉默；使君子蘭在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生基 因背景完全相同、株型統(tǒng)一的再生植株；再生體系穩(wěn)定，以來源于10株成齡君子蘭(包括彩 葉君子蘭)的成熟種胚為外植體的脫分化率及分化率均可達(dá)70% 100%;再生系數(shù)高，由 原始的一塊愈傷組織經(jīng)反復(fù)繼代可分化出幾百株叢生芽；叢生芽生根率可達(dá)100%，生長(zhǎng) 健壯；移栽成活率高，可達(dá)100%。本發(fā)明的有益效果是可以使不同品種的君子蘭在相對(duì)短 的時(shí)間內(nèi)大規(guī)模繁殖出遺傳背景相同、外觀整齊的植株，植株移栽后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，平均單 株再生苗的成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)際操作對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的范圍不僅局限于以下 的實(shí)施例。實(shí)施例1:1.外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)取成熟果實(shí)中的種胚，于無菌超凈臺(tái)中75% (體 積/體積)酒精浸泡30秒，用0. 1 % (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡2分鐘，無菌水沖洗3 遍，將裸胚上黃色致密的長(zhǎng)度大約2mm的一端切下，接種在含2，4-D2mg/L、蔗糖3% (質(zhì)量/ 體積)、瓊脂0. 45% (質(zhì)量/體積)的MS培養(yǎng)基上，20°C每天40W日光燈照射8小時(shí)。40 天繼代一次，待愈傷(黃色)或者綠色膨大長(zhǎng)到直徑5mm左右時(shí)即可誘導(dǎo)分化。2.不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黃色愈傷或綠色膨大組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)基:MS+KT0. 25mg/L+2，4-D0. 75+3% (質(zhì)量/體積)蔗糖+0. 45% (質(zhì)量/體積)瓊脂， 40天繼代一次，20°C每天光照10小時(shí)。30 40天可見再生芽產(chǎn)生。繼代4個(gè)月時(shí)從一塊 愈傷可分化出200多株再生芽苗。3.根的誘導(dǎo)再生植株轉(zhuǎn)到l/2MS+NAA(lmg/L) +蔗糖2% (質(zhì)量/體積)+瓊脂 0. 45% (質(zhì)量/體積)的生根培養(yǎng)基上，20C每天10小時(shí)左右光照。4.再生植株移栽植株生根后即可移栽。腐殖土 121°C滅菌30分鐘。移栽前將植 株上的瓊脂等雜物沖洗干凈。7天左右澆一次透水便可成活。實(shí)施例2:1.外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)取成熟果實(shí)中的胚于無菌超凈臺(tái)中，用75% (體 積/體積)酒精浸泡60秒，用0.2% (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡5分鐘，無菌水沖洗5 遍，將裸胚上黃色致密的長(zhǎng)度大約2mm的一端切下，接種在含2，4-D4mg/L、蔗糖4% (質(zhì)量 /體積)、瓊脂0. 7% (質(zhì)量/體積)的MS培養(yǎng)基上，30°C每天40W日光燈照射9小時(shí)。50天繼代一次，待愈傷(黃色)或者綠色膨大長(zhǎng)到直徑5mm左右時(shí)即可誘導(dǎo)分化。2.不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黃色愈傷或綠色膨大組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)基MS+KT0· 5mg/L+2,4-Dl. 5mg/L+4% (質(zhì)量/體積)蔗糖+0. 7% (質(zhì)量/體積)瓊 月旨，50天繼代一次，30°C每天光照12小時(shí)。30 40天可見再生芽產(chǎn)生。繼代4個(gè)月時(shí)從 一塊愈傷可分化出上百株再生芽苗。3.根的誘導(dǎo)再生植株轉(zhuǎn)到l/2MS+NAA2mg/L+蔗糖2% (質(zhì)量/體積)+瓊脂0. 7% (質(zhì)量/體積)的生根培養(yǎng)基上，30°C每天10小時(shí)左右光照。4.再生植株移栽植株生根后即可移栽。腐殖土 121°C滅菌60分鐘。移栽前將植 株上的瓊脂等雜物沖洗干凈。7天左右澆一次透水便可成活。實(shí)施例3:1.外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)取成熟果實(shí)的種胚于入無菌超凈臺(tái)中75% (體 積/體積)酒精浸泡40秒，用0. 15% (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡4分鐘，無菌水沖洗 4遍，將裸胚上黃色致密的長(zhǎng)度大約2mm的一端切下，接種在含2，4-D3mg/L、蔗糖3. 5% (質(zhì) 量/體積)、瓊脂0. 6 % (質(zhì)量/體積)的MS培養(yǎng)基上，25 °C每天40W日光燈照射8. 5小時(shí)。 48天繼代一次，待愈傷(黃色)或者綠色膨大長(zhǎng)到直徑5mm左右時(shí)即可誘導(dǎo)分化。2.不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黃色愈傷或綠色膨大組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)基:MS+KT (0. 4mg/L) +2，4_D (1. Omg/L) +3.5% (質(zhì)量 / 體積)蔗糖 +0. 5 % (質(zhì)量 / 體 積)瓊脂，45天繼代一次，25°C每天光照8小時(shí)。30 40天可見再生芽產(chǎn)生。繼代4個(gè)月 時(shí)從一塊愈傷可分化出200多株再生芽苗。3.根的誘導(dǎo)再生植株轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA (1. 5mg/L) +蔗糖2 % (質(zhì)量/體積)+瓊脂 0. 6 (質(zhì)量/體積)的生根培養(yǎng)基上，20 30°C每天10小時(shí)左右光照。4.再生植株移栽植株生根后即可移栽。腐殖土 121°C滅菌45分鐘。移栽前將植 株上的瓊脂等雜物沖洗干凈。7天左右澆一次透水便可成活。
權(quán)利要求
以成熟胚為外植體的君子蘭離體快速繁殖方法，其特征是具體步驟如下1).外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)取成熟果實(shí)中的胚，放入無菌超凈臺(tái)中，用75％(體積/體積)酒精浸泡30～60秒，用0.1～0.2％(質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡2～5分鐘，無菌水沖洗3～5遍，將裸胚上黃色致密的長(zhǎng)度2mm的一端切下，接種在含2，4-D2～4mg/L、蔗糖3～4％(質(zhì)量/體積)、瓊脂0.45～0.7％(質(zhì)量/體積)的MS培養(yǎng)基上，20～30℃每天40W日光燈照射8～9小時(shí)，40～50天繼代一次，待黃色愈傷或者綠色膨大長(zhǎng)到直徑5mm時(shí)即誘導(dǎo)分化；2).不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黃色愈傷或綠色膨大組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基MS+KT(0.25～0.5mg/L)+2，4-D(0.75～1.5mg/L)+3～4％(質(zhì)量/體積)蔗糖+0.45～0.7％(質(zhì)量/體積)瓊脂，40～50天繼代一次，20～30℃每天光照8～12小時(shí)；30～40天見再生芽產(chǎn)生，繼代4個(gè)月時(shí)從一塊愈傷分化出200多株再生芽苗；3).根的誘導(dǎo)再生植株轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA(1～2mg/L)+蔗糖2％(質(zhì)量/體積)+瓊脂0.45～0.7％(質(zhì)量/體積)的生根培養(yǎng)基上，20～30℃每天10小時(shí)光照；4).再生植株移栽植株生根后即可移栽，腐殖土121℃滅菌30～60分鐘，移栽前將植株上的瓊脂及雜物沖洗干凈，7天澆一次透水便成活。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物繁殖方法，具體涉及是花卉的無性快速繁殖方法，本發(fā)明所采用外植體脫毒、接種及愈傷誘導(dǎo)、不定芽的誘導(dǎo)、根的誘導(dǎo)、再生植株移栽等技術(shù)無性快速繁殖君子蘭。取材不受季節(jié)限制，適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因沉默。以來源于10株成齡君子蘭的成熟種胚為外植體的脫分化率及分化率均可達(dá)70％～100％；再生系數(shù)高，由原始的一塊愈傷組織經(jīng)反復(fù)繼代可分化出幾百株叢生芽；叢生芽生根率可達(dá)100％，移栽成活率高，可達(dá)100％?？梢允共煌贩N的君子蘭在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)大規(guī)模繁殖出遺傳背景相同、外觀整齊的植株。植株移栽后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，平均單株再生苗的成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101810141SQ201010126830
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者王麗, 王欽美, 鄒凡雨 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)