專利名稱：一種植物組織培養(yǎng)中污染防止方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及用植物組織培養(yǎng)中防止污染的方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)中的污染問題一直是組織培養(yǎng)中一個重要的影響因素。高污染率讓 組織培養(yǎng)的成本居高不下，特別在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)植物組培苗的時候，防止污染問題顯 得尤為重要。這就需要改進(jìn)現(xiàn)有的方法，減少植物組織培養(yǎng)過程中的污染率，提高生產(chǎn)效 率，降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種方法，在植物組織培養(yǎng)的基質(zhì)中，又稱培養(yǎng)基，添加一些藥劑來防 止培養(yǎng)過程中受真菌或細(xì)菌的污染。本發(fā)明的小組成員發(fā)現(xiàn)在植物組織培養(yǎng)中，受假單胞 菌屬(Pseudomonas spp.)和芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)等細(xì)菌污染的頻率較高；青霉和 曲霉等真菌污染的頻率也較高。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的小組成員經(jīng)過大量的實驗來篩選 出防止這幾種細(xì)菌或真菌造成的污染有效的藥劑。本發(fā)明提供一種植物組織培養(yǎng)中防止細(xì)菌或真菌污染的方法，包括如下步驟(1) 準(zhǔn)備植物組培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基；(2)在培養(yǎng)基中加入下列藥劑中的一種或幾種80%乙 蒜素、90%鏈 土霉素、0. 5%氨基寡糖素水劑、10% ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉或三氯異氰尿 酸。在一些優(yōu)選的方式中，在步驟(2)中加入的藥劑為乙蒜素、鏈· 土霉素、氨基寡糖 素或三氯異氰尿酸中的一種或幾種。在另一些優(yōu)選的方式中，在步驟⑵中，把所述的藥劑稀釋1000-6000倍后再加入 到步驟(1)中準(zhǔn)備的培養(yǎng)基中。稀釋的倍數(shù)可以是100倍，至少為500倍、至少為1000倍、 或至少為2000倍、至少為2500倍、至少為3000倍、至少為4000倍、至少為5000倍或至少 為6000倍。在一個更優(yōu)選的方式中，當(dāng)步驟(2)中所述的藥劑為乙蒜素、氨基寡糖素或三 氯異氰尿酸的時候；所述藥劑的稀釋倍數(shù)為2000倍。在另一些實施方式中，該方法還包括在步驟(2)之后對培養(yǎng)基進(jìn)行高溫消毒滅 菌。另一方面，本發(fā)明提供植物組織培養(yǎng)中防止細(xì)菌或真菌污染的方法，順次包括如 下步驟(1)準(zhǔn)備植物組培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基；(2)在培養(yǎng)基中加入下列藥劑中的一種或幾 種80%乙蒜素、90%鏈· 土霉素、0. 5%氨基寡糖素水劑、10% ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉或 三氯異氰尿酸；(3)高溫消毒。在一個優(yōu)選的方式中，藥劑為80%乙蒜素。在一個更優(yōu)選的 方式中，80%乙蒜素的稀釋倍數(shù)為100-6000倍，優(yōu)選的為1500-6000倍，可以是2000、3000、 3500、4000、4500、5000 或 6000 倍。另一方面，本發(fā)明提供一種植物組織培養(yǎng)中防止細(xì)菌或真菌污染的方法，順次包 括如下步驟(1)準(zhǔn)備植物組培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基；(2)高溫消毒；(3)在培養(yǎng)基中加入下
3列藥劑中的一種或幾種80%乙蒜素、90%鏈 土霉素、0.5%氨基寡糖素水劑、10% ClO2、過 氧乙酸、次氯酸鈉或三氯異氰尿酸。在一個優(yōu)選的方式中，藥劑為鏈 土霉素。在一個更優(yōu) 選的方式中，鏈· 土霉素的稀釋倍數(shù)為100-6000倍，優(yōu)選的為1500-6000倍，可以是2000、 3000、3500、4000、4500、5000 或 6000 倍。在以上所有的方法中，所述的細(xì)菌為假單胞菌屬或芽孢桿菌屬?；蛘婢鸀榍嗝够?br> 曲^^ ο在以上所有的方法中，所述的真菌為青霉或曲霉的時候，所加的藥劑為乙蒜素、 鏈。土霉素、氨基寡糖素或三氯異氰尿酸的一種或幾種。更優(yōu)選的，當(dāng)真菌為青霉，使用藥 劑乙蒜素、鏈· 土霉素或氨基寡糖素，并且他們的稀釋倍數(shù)為1000倍。在以上所有的方法中，向培養(yǎng)基中加入藥劑的時間或方式可以是以下幾種中的一 種或幾種結(jié)合使用(1)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備通常在蒸餾水中添加一定量的某些營養(yǎng)物質(zhì)成分 來配置植物組織培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基；可以先用蒸餾水來稀釋藥劑到如上所描述的倍數(shù)， 然后再在這些稀釋好的溶液中添加植物組織培養(yǎng)中所需要的營養(yǎng)元素或其他試劑，最后進(jìn) 行高溫滅菌或通過其它方法滅菌；或者，(2)先把配置好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌，待在分裝 冷卻的培養(yǎng)基的時候把用無菌水稀釋好的藥劑加入到培養(yǎng)基上；或者，(3)等把培養(yǎng)基到 入玻璃培養(yǎng)皿中，然后再把一定體積的稀釋好的藥劑溶液加入到培養(yǎng)瓶中，然后再在培養(yǎng) 瓶中定植外植體或組培過的幼苗；或者(4)還可以在植物組織培養(yǎng)任意過程中直接向培養(yǎng) 基上加入一定體積的藥劑或者經(jīng)過倍數(shù)稀釋的藥劑溶液來防止污染，例如在獲得無菌苗、 愈傷組織、分化培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)或生根培養(yǎng)過程中添加藥劑。通常，加入藥劑得濃度是上述藥劑的稀釋倍數(shù)后可以直接加在培養(yǎng)上，或者直接 藥劑稀釋后，用稀釋后的溶液配置培養(yǎng)基，然后再進(jìn)行滅菌。這里的培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng) 基，也可以是液體培養(yǎng)基。有益效果通過本發(fā)明的方法，可以有效預(yù)防植物組織培養(yǎng)中的真菌或細(xì)菌造成的污染，大 大提高生產(chǎn)效率，有利于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)；同時對組織培養(yǎng)的幼苗沒有傷害作用。試驗為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的效果，我們進(jìn)行了試驗。這些試驗僅僅是本發(fā)明的有限 實施方式的列舉，并不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求限制性的解釋。實驗1、11種細(xì)菌抑制劑對組培污染細(xì)菌的室內(nèi)抑制作用實驗方法和材料實驗材料 本發(fā)明所用到的藥劑均購自普通農(nóng)藥店。實驗1. 1試驗方法方法參照方中達(dá)的《植病研究方法》(作者方中達(dá)，農(nóng)業(yè)出版社，1982)，測定的細(xì)菌 從冰箱取出，經(jīng)過滅菌后的固體NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3g ；酵母提取物Ig ；胰化蛋白胨5g ； 蔗糖IOg ；瓊脂17g ；加無菌水定容至IOOOmL,調(diào)pH至7. 0)劃線活化培養(yǎng)后，挑取少量用液 體NA培養(yǎng)基在搖床上30°C進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，取Iml菌液加入融化到35°C左右的 固體NA培養(yǎng)基，混勻，倒在培養(yǎng)皿上約2-3mm厚。培養(yǎng)基凝固后在培養(yǎng)基表面上放入一個
4至多個不銹鋼環(huán)柱(內(nèi)徑為6. 0毫米，外徑7. 0毫米)，在每個環(huán)柱中加入200ul不同濃度 的藥劑(見表1)，這些稀釋好的藥劑未事先經(jīng)過高溫滅菌。于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h后測定 環(huán)柱的四周形成的抑菌圈直徑。實驗結(jié)果經(jīng)鏈· 土霉素、氨基寡糖素等11種藥劑，對污染頻率較高的污染細(xì)菌假單胞菌 屬(Pseudomonas spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)進(jìn)行室內(nèi)藥效進(jìn)行初步篩選，結(jié)果 表明11種藥劑中有6種對上述二種主要組培污染細(xì)菌有較強的抑制作用，其中80%乙蒜 素、90%鏈· 土霉素、0. 5%氨基寡糖素水劑、10% ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸 對上述二種主要污染細(xì)菌抑制作用較強。其中以三氯異氰尿酸、ClO2、過氧乙酸效果最好 (表1)，而農(nóng)用鏈霉素、細(xì)菌絕殺、細(xì)康、龍克菌等四種藥劑則2000倍對組培污染細(xì)菌則對 Bacillus spp.禾口 Pseudomonas spp.沒有抑制作用。表111種藥劑對組培污染細(xì)菌Bacillus spp.和Pseudomonas spp.的室內(nèi)抑制
作用
抑菌圈直徑(mm) *
藥劑 農(nóng)用鏈霉素
乙卿糸
鏈‘土霉素 細(xì)菌絕殺 細(xì)康 龍克菌 氨基寡糖素 二氧化氯 過氧乙酸 次氯酸鈉 三氯異氰,尿 酸 無菌水
劑型
72%WP 80% 90%WP 15WP 15WP 20%懸浮劑 0. 5%水劑 10% 15% 10%有效氯 42%
稀釋倍數(shù)
2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 1000 1000 1000 2000
Bacillus spp 045 0
23. 7 16. 3 _0 0 0
29.0 83. 0 46. 7
30.3 54.5
0
Pseudomonas spp 025 0
34. 6
32.0 0
0 0
33.3 31. 3 29. 3 18. 3 42. 7
0
Pseudomonas spp 029 0
36. 3 32. 0 0 0 0
30.739.032.520.145.5*三次試驗9次重復(fù)的平均值。WP 可濕性粉劑試驗1. 2試驗方法為了盡可能的減少對殺菌藥劑的使用，我們對上述試驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的藥劑濃 度的細(xì)化。除了稀釋倍數(shù)不同外，試驗方法和試驗1.1的方法相同。試驗結(jié)果由于ClO2、過氧乙酸使用過程中具有較強的刺激性氣味，不便于實際操作及工作 人員健康，因此選擇乙蒜素、鏈 土霉素、氨基寡糖素、三氯異氰尿酸這四種藥劑。分別稀釋 4000、5000、6000倍濃度測定對Bacillus spp. ^Pseudomonas spp.、未知紅色和黃色細(xì)菌的 抑制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈· 土霉素4000倍對四種不同細(xì)菌的抑制效果最好，而其6000倍的
5處理效果仍比其他三種藥劑4000倍的效果更好(表2)。表2四種藥劑對不同污染細(xì)菌的抑制情況(不滅菌) 試驗1. 3試驗方法除了稀釋的藥劑需要事先經(jīng)過滅菌外，試驗方法與試驗1. 1的方法相同。試驗結(jié)果但這四種藥劑按照下述表3的濃度加入培養(yǎng)基中后，再對培養(yǎng)基進(jìn)行121°C高溫 滅菌處理后，結(jié)果有所不同。鏈·土霉素2000倍滅菌后對細(xì)菌的抑制效果遠(yuǎn)低于其他藥劑 2000倍的效果，而滅菌處理后乙蒜素對四種細(xì)菌的抑制效果較其他藥劑更好(表3)。因此 在實際操作中乙蒜素可以方便的加入培養(yǎng)基中進(jìn)行滅菌處理，而不影響其對污染細(xì)菌的抑 制作用，而鏈· 土霉素的使用需要在培養(yǎng)基分裝時另外加入，才有很好的抑菌效果。表3藥劑滅菌后對不同污染細(xì)菌的抑制情況 實驗2、4種藥劑對組培污染真菌的室內(nèi)抑制作用實驗方法和材料準(zhǔn)備固體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g ；蔗糖20g ；瓊脂17g ；加水定容至IOOOmL)并 經(jīng)過高溫滅菌，接種真菌菌絲或孢子，在自然條件紫外光或其他條件下產(chǎn)孢，收集真菌孢子 至無菌水中，制成濃度達(dá)到IO7左右的孢子懸浮液。Iml左右的孢子懸浮液加入冷卻到35°C 左右滅過菌的固體PDA培養(yǎng)基中混勻。培養(yǎng)基凝固后在培養(yǎng)基表面上放入一個至多個不銹 鋼環(huán)柱(內(nèi)徑為6.0毫米，外徑7.0毫米)，在每個環(huán)柱中加入200ul不同濃度的藥劑(見 表4)。于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h后測定環(huán)柱的四周形成的抑菌圈直徑。實驗結(jié)果經(jīng)過對細(xì)菌抑制劑的篩選，我們由此確定真菌的藥劑篩選，我們于2009年度又對 乙蒜素、鏈 土霉素、氨基寡糖素和三氯異氰尿酸等4種藥劑進(jìn)行了對組培污染頻率較高的 污染真菌青霉和黑曲霉的室內(nèi)藥效測定，結(jié)果表明乙蒜素、鏈· 土霉素和氨基寡糖素對組 培污染頻率較高的污染真菌青霉和黑曲霉均有較好的抑制效果，乙蒜素、鏈 土霉素和氨基 寡糖素1000倍液對青霉的抑菌圈直徑分別達(dá)40. 71mm、74. 43mm和31. 43mm，對黑曲霉的抑 菌圈直徑分別達(dá)24.71mm、24. 57mm、19. 43mm。結(jié)合藥劑的用量、熱穩(wěn)定性、使用的方便性、抑 菌效果等等綜合因素乙蒜素是較好的組培污染真菌的抑制劑(表4)。表4四種藥劑對不同污染真菌的抑制情況 實驗3、消毒劑對組培器皿的消毒效果實驗方法將氧乙酸、二氧化氯、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸等四種消毒劑分別稀釋100X， 200 X，500 X，然后定量裝入噴壺，對組培器皿進(jìn)行噴灑處理。處理后24h、48h、36h分別用 NA和PDA培養(yǎng)基測定組培器皿表面上細(xì)菌真菌的有無。實驗結(jié)果經(jīng)過氧乙酸、二氧化氯、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸等四種常用消毒劑對組培器皿采 用100倍液、200倍液、500倍液進(jìn)行消毒處理，表5消毒劑對組培器皿的消毒效果 *三次試驗9次重復(fù)的觀察結(jié)果。_ 無菌；+ 少量菌；++ 菌量較多；+++ 菌量很
^^ ο然后對組培器皿進(jìn)行無菌水清洗采樣，將采集的器皿的清洗液，進(jìn)行三次試驗9 次重復(fù)的培養(yǎng)觀察結(jié)果表明10%二氧化氯的100倍液、200倍液、500倍液，15%過氧乙酸 的100倍液、200倍液，10%次氯酸鈉100倍液，三氯異氰尿酸的100倍液、200倍液對組培 器皿的細(xì)菌與真菌均有很好的殺滅作用(表5)。實驗4、殺菌劑和消毒劑對組培貢菊的安全性試驗
實驗方法和材料實驗材料由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病毒與生物技術(shù)研究所提供的組培貢菊，貢菊已處于生 根培養(yǎng)階段。實驗方法將試驗篩選出的80%乙蒜素、90%鏈.土霉素、0.5%氨基寡糖素水劑、10% CL02、 次氯酸鈉、三氯異氰尿酸等7種組培污染防止藥劑稀釋1000X，2000X，4000X等倍數(shù)，然 后各吸取Iml加入貢菊組培瓶(培養(yǎng)基厚為5-6cm，培養(yǎng)瓶的直徑為7. 0厘米)設(shè)置5個重 復(fù)。然后把貢菊組培瓶放入25°C的光照培養(yǎng)箱，14h光照/IOh黑暗培養(yǎng)。觀察貢菊生長情 況。實驗結(jié)果經(jīng)過對上述試驗篩選出的80%乙蒜素、90%鏈.土霉素、0.5%氨基寡糖素水劑、 10% CLO2、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸等7種可有效防止組培污染的殺菌劑和消毒劑進(jìn)行組培 苗安全性測定，結(jié)果表明80%乙蒜素、90%鏈.土霉素、0.5%氨基寡糖素水劑、過氧乙酸、 次氯酸鈉等7種藥劑在不同的稀釋倍數(shù)下經(jīng)48小時觀察對貢菊組培苗是安全的，另外，我 們還對其它植物如絲蘭、惠蘭等進(jìn)行了藥害實驗，獲得了相同的結(jié)果。表6組培防污染殺菌劑的安全性試驗
注一無影響<
權(quán)利要求
一種植物組織培養(yǎng)中防止細(xì)菌或真菌污染的方法，其特征在于，包括如下步驟，(1)準(zhǔn)備植物組培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基；(2)向培養(yǎng)基中加入下列藥劑中的一種或幾種80％乙蒜素、90％鏈·土霉素、0.5％氨基寡糖素水劑、10％ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉或三氯異氰尿酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在步驟(2)中加入的藥劑為乙蒜素、鏈·土霉 素、氨基寡糖素或三氯異氰尿酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，在步驟(2)中，把所述的藥劑稀釋1000-6000倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述藥劑的稀釋倍數(shù)為2000倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，方法還包括，在步驟(2)之后對培養(yǎng)基進(jìn)行高 溫消毒滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌為假單胞菌屬或芽孢桿菌 jM ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的真菌為青霉或黑曲霉的時候，在步驟 (2)中使用的藥劑為乙蒜素、鏈· 土霉素、氨基寡糖素或三氯異氰尿酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述的真菌為青霉，使用藥劑乙蒜素、鏈 土霉 素或氨基寡糖素的稀釋倍數(shù)為1000倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5或7-8之一所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中的藥劑為80% 乙標(biāo)素ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5或7-8之一所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中的藥劑為 80%乙蒜素，稀釋的倍數(shù)為2000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)中防止細(xì)菌或真菌污染的方法，包括如下步驟，(1)準(zhǔn)備植物組培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基；(2)培養(yǎng)基中加入下列藥劑中的一種或幾種80％乙蒜素、90％鏈·土霉素、0.5％氨基寡糖素水劑、10％ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉或三氯異氰尿酸。該方法可以有效防止植物組織培養(yǎng)中的真菌或細(xì)菌污染，而且對外植體不會產(chǎn)生不利的影響，可以大大提高工廠化生產(chǎn)的產(chǎn)率。
文檔編號A01H4/00GK101884301SQ20101014288
公開日2010年11月17日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者任海英, 方麗, 王漢榮, 茹水江 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院