專利名稱：一種多年生黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領域，具體涉及一種用根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介導的黑麥草(Lolium L.)遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
黑麥草屬植物中，廣泛栽培的是多年生黑麥草(Lolium perenne L.)和一年生黑麥草(Lolium multiflorum L.)，在世界各地均有種植，在我國屬于引進栽培。多年生黑麥草是優(yōu)良的牧草和草坪草，因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進行遺傳改良，具有重要意義。黑麥草屬單子葉禾本科植物，對農(nóng)桿菌不敏感，遺傳轉(zhuǎn)化非常困難。由于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化具有不可替代的優(yōu)越性，為獲得轉(zhuǎn)基因黑麥草，依然需要不斷地優(yōu)化和改進農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法。在前期工作中，我們建立了一種根癌農(nóng)桿菌介導的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其關鍵在于預培養(yǎng)和共培養(yǎng)中添加了 50mL/L新鮮無菌煙草汁。用該方法， 獲得了 3個多年生黑麥草品種金牌美達麗、神槍手、多福的轉(zhuǎn)基因植株馬欣榮博士論文， 2006，四川大學；專利(馬欣榮，CN200510020540. 7ZL)。由于獲取50mL/L新鮮無菌煙草汁， 其操作過程繁瑣，所需要的煙草量大，并且受季節(jié)限制，因此我們探索用一種試劑替代煙草汁來改良轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。目前國內(nèi)外有關根癌農(nóng)桿菌介導的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化研究的報道較少。Bajaj等建立了一種效率較高的轉(zhuǎn)化方法，但是操作過程及其繁瑣，不適宜大規(guī)模的遺傳轉(zhuǎn)化Bajaj S等，2006。因此，探尋一種簡化、行之有效的轉(zhuǎn)化方法，非常必要。單子葉植物如小麥、黑麥草的愈傷組織，在經(jīng)過與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，常發(fā)生褐變壞死。這是農(nóng)桿菌介導的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸。硫辛酸(a-Lipoic Aid)是一種強抗氧化劑，可以通過清除自由基、螯合金屬離子、再生體內(nèi)其它抗氧化劑來發(fā)揮抗氧化作用張璣文等，2009。因此本發(fā)明中在切碎愈傷組織時、共培養(yǎng)、恢復培養(yǎng)中使用了硫辛酸，以增加愈傷組織抗氧化能力，減少褐化和死亡，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改良的基于根癌農(nóng)桿菌介導的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，為多年生黑麥草目的基因的轉(zhuǎn)移、新材料的創(chuàng)造和培育，以及基因功能研究打下基石出。本發(fā)明提供了一種多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的改良方法，包括如下幾個步驟愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)、愈傷組織切碎、根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、根癌農(nóng)桿菌侵染愈傷組織、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)、恢復除菌培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化再生培養(yǎng)、植株繼代選擇培養(yǎng)等步驟，其特征是愈傷組織誘導所用的材料是黑麥草的成熟種子胚；愈傷組織在切碎的過程中、根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織時的培養(yǎng)基、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)的培養(yǎng)基以及浸染后的恢復培養(yǎng)基中均添加硫辛酸，硫辛酸的濃度在20-150mg/L能有效降低愈傷組織的褐化率，最適濃度為50-100mg/L ；根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織過程，是在愈傷組織切碎后立即加入菌液混合均勻；根癌農(nóng)桿菌是攜含目的基因、選擇抗性基因和報告基因的植物表達載體質(zhì)粒。具體而言，在本發(fā)明的方法中可以使用的黑麥草包括，例如，多年生黑麥草品種5 個，多福、雅晴、頂峰、匹克、百舸，這些品種均可購自市場。取出這些黑麥草的成熟胚，在誘導培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織。將誘導出的愈傷組織與根癌農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，進行愈傷組織的轉(zhuǎn)化?？梢允褂眯迈r誘導出的愈傷組織，也可以使用繼代的愈傷組織。如果使用繼代的愈傷組織，該愈傷組織是繼代時間不超過3個月的愈傷組織。所述根癌農(nóng)桿菌對黑麥草愈傷組織的轉(zhuǎn)化是在愈傷組織切碎后立即加入菌液混合均勻，切碎過程是在添加了 50-100mg/L的硫辛酸的液體共培養(yǎng)基上完成的。然后在無菌的含有50-100mg/L的硫辛酸、30g/L的麥芽糖、10/L的葡萄糖、100mg/L的維生素C、200 μ mol/L的乙酰丁香酮、3mg/L的2，4-D的MS培養(yǎng)基中，將所述根癌農(nóng)桿菌和多年生黑麥草的愈傷組織于25°C黑暗下共同培養(yǎng)3天完成的。在轉(zhuǎn)化步驟完成后，本發(fā)明的方法進一步包括對轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行恢復除菌培養(yǎng)7天的步驟?；謴团囵B(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加50-100mg/L的硫辛酸。硫辛酸的濃度在20-150mg/L能有效降低愈傷組織的褐化率。硫辛酸最適濃度為 50-100mg/L,能使農(nóng)桿菌浸染后愈傷組織存活率達到40-60%。在恢復除菌培養(yǎng)步驟之后，本發(fā)明的方法還包括在一定的選擇壓力下進行繼代選擇培養(yǎng)的步驟。當所述根癌農(nóng)桿菌所攜帶的質(zhì)粒含有的選擇抗性基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)的情況下，所述的選擇壓力使用氨基糖苷類抗生素，可以選自巴龍霉素、 G418、新霉素，其濃度為10-50mg/L培養(yǎng)基。本發(fā)明優(yōu)選采用10_50mg/L的巴龍霉素作為選擇壓力。所使用的選擇培養(yǎng)基中用瓊脂粉作為凝固劑。在繼代選擇培養(yǎng)步驟之后，本發(fā)明的方法還包括挑選出抗性愈傷組織，在再生選擇培養(yǎng)基上使其分化和再生的步驟。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述再生選擇培養(yǎng)基為含有30g/L的蔗糖、0. 5mg/L的6-芐氨基嘌呤(6-BA)、0. lmg/L的2，4_D、100mg/L的特美汀和10-50mg/L的巴龍霉素的MS培養(yǎng)基。其中特美汀和巴龍霉素是在其它組分配好高壓滅菌后，冷卻至45-55°C時添加進去的。結(jié)果，本發(fā)明采用從多年生黑麥草成熟胚誘導出來的愈傷組織，經(jīng)帶有植物表達載體的農(nóng)桿菌侵染、抗生素篩選，獲得了抗性植株。經(jīng)PCR、GUS組織染色驗證，表明獲得了穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因黑麥草植株。單子葉植物如小麥、黑麥草的愈傷組織，在經(jīng)過與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，常發(fā)生褐變壞死。這是農(nóng)桿菌介導的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸。硫辛酸(a-Lipoic Aid)是一種強抗氧化劑。轉(zhuǎn)化過程中，在培養(yǎng)基中添加50_100mg/L硫辛酸能有效地降低愈傷組織的褐化，顯著提高愈傷組織的成活率。在沒有添加硫辛酸的培養(yǎng)基中，愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，90% 以上發(fā)生褐化壞死；而在添加了 50-100mg/L硫辛酸中，只有40-60%的愈傷組織發(fā)生褐化壞死，并且在恢復培養(yǎng)的過程中能較快使愈傷組織恢復正常生長，顯著提高了農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織的存活率，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，為定向進行分子設計改良黑麥草品種，打下基礎。本發(fā)明方法的優(yōu)點能在一定程度上有效抑制共培養(yǎng)后愈傷組織的褐化。操作簡單易行，能獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。


圖1是雙元載體質(zhì)粒p23_iHCp表達盒示意圖。該質(zhì)粒攜選擇基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt II)、報告基因葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和一個來自黑麥草花葉病毒的基因片段，這三個基因分別受花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35Sp)驅(qū)動。圖2是多年生黑麥草愈傷組織照片。圖3是從抗性愈傷中分化再生出的抗性植株的照片。圖4是轉(zhuǎn)基因材料GUS組織染色的照片。深藍色為轉(zhuǎn)基因組織，黃色為非轉(zhuǎn)基因或假陽性組織。IA野生型愈傷組織，部分愈傷組織呈淺蘭色，IB為轉(zhuǎn)基因愈傷組織；2A野生型植株根，2B為轉(zhuǎn)基因植株根；3A野生型植株葉，3B為轉(zhuǎn)基因植株葉。圖5是PCR擴增轉(zhuǎn)基因植株中選擇基因npt II ；M Marker DL 2000 ；1陽性；2陰性；3-7轉(zhuǎn)基因植株。圖6是PCR擴增轉(zhuǎn)基因植株中目的基因HCp ；M Marker DL 2000 ；1陽性；2陰性； 3-9轉(zhuǎn)基因植株。圖7是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植株的照片。
具體實施例方式下面實施例用于本發(fā)明的進一步說明，但是這些具體實驗是示例性的，不能將它們視為對本發(fā)明的限制。一、硫辛酸對共培養(yǎng)后多年生黑麥草愈傷組織的影響1.材料選用多年生黑麥草品種多福(Tove)，購自市場。根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，具抗生素利福平(Rif)抗性，攜雙元載體質(zhì)粒p23_iHCp， 其中的表達盒示意圖見圖1。如圖1所示，該質(zhì)粒攜選擇基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt II)、報告基因葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和一個來自黑麥草花葉病毒(RgMV)的基因片段HCp。gusA中含有2個過氧化氫酶內(nèi)含子，使其不能在農(nóng)桿菌中表達。其中g(shù)usA基因含有內(nèi)含子，只有在其整合到真核生物基因組中后，才能表達。它的表達，可以確定外源基因是否整合到了植物基因組中。這3個基因均受花椰菜花葉病毒35S啟動子啟動，能在植物細胞中復制和表達，可直接導入農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)化植物。2.方法2. 1黑麥草愈傷組織的誘導、培養(yǎng)愈傷組織誘導、繼代培養(yǎng)的方法基本與我們已經(jīng)獲得的專利“多年生黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化方法(CN200510020540. 7ZL) ”相同，但是將培養(yǎng)基的凝固劑將6mg/L瓊脂粉替換成 2. 4g/L結(jié)冷膠。具體操作如下愈傷組織由成熟種子胚誘導(1個月)、繼代培養(yǎng)O次，1次/2周)后，選取生長致密、淺黃色愈傷組織用于轉(zhuǎn)化。成熟胚誘導愈傷組織及其繼代培養(yǎng)，方法如下①將黑麥草的成熟種子用70% (V/V)乙醇漂洗lmin，然后浸泡于活性氯含量 2-4%的次氯酸鈉溶液中，振蕩15min，之后用無菌水洗滌4_5次；②無菌水中室溫浸泡44hr ；
③超凈臺上剝?nèi)〕墒炫撸臃N于誘導培養(yǎng)基上，23°C _25°C暗培養(yǎng)；④1個月后，將生長良好的愈傷組織置于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，23°C _25°C暗培養(yǎng)； 繼代2次，1次/2周。2. 2農(nóng)桿菌浸染愈傷組織①農(nóng)桿菌的培養(yǎng)取液氮中甘油保存的菌液接種到含20 μ g/mL利福平，50mg/L卡那霉素的5ml LB (50ml三角瓶)中J8°C、200rpm培養(yǎng)過夜；取ImL培養(yǎng)過夜的菌液，轉(zhuǎn)入20mL新配制的不加抗生素的浸染培養(yǎng)基于^°C、200rpm培養(yǎng)3_5hr至0. D值約0. 6，即可用于轉(zhuǎn)化。②愈傷組織切碎、浸染及共培養(yǎng)愈傷組織在培養(yǎng)皿中加入液體共培養(yǎng)基切碎成直徑l_3mm的小塊，立即加入適量上述農(nóng)桿菌菌液混合均勻5min，取出愈傷組織置于無菌濾紙上吸去附著的菌液，立即置于共培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)3天。在這個過程中，分別在培養(yǎng)基中添加0、20、50、75、100、150mg/ L硫辛酸。不同濃度的處理，愈傷組織數(shù)均為100個。③恢復除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌濾紙吸干，置于恢復培養(yǎng)基上，無選擇培養(yǎng)7天；培養(yǎng)基中分別添加相應濃度的硫辛酸。2. 3愈傷組織存活數(shù)統(tǒng)計恢復培養(yǎng)后，統(tǒng)計褐化及存活的愈傷組織數(shù)，比較不同濃度的硫辛酸對農(nóng)桿菌浸染后愈傷組織的影響。結(jié)果表明，在不添加硫辛酸的對照組中，90 %以上發(fā)生褐化壞死，存活率僅為5-10% ；而在分別添加了 20、50、75、100、15011^/1硫辛酸中，愈傷組織褐化率降低，存活率增加，存活率分別為沈％、49 %、47 %、52 %、22 %。并且在恢復培養(yǎng)的過程中能較快使愈傷組織恢復正常生長，顯著提高了農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織的存活率。表1.不同濃度硫辛酸(mg/L)對農(nóng)桿菌浸染后愈傷組織的影響
權(quán)利要求
1.一種多年生黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)、愈傷組織切碎、 根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、根癌農(nóng)桿菌侵染愈傷組織、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)、恢復除菌培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化再生培養(yǎng)、植株繼代選擇培養(yǎng)步驟，其特征是愈傷組織誘導所用的材料是黑麥草的成熟種子胚；根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織時的培養(yǎng)基、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)的培養(yǎng)基以及浸染后的恢復培養(yǎng)基中均添加硫辛酸；根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織過程， 是在愈傷組織切碎后立即加入菌液混合均勻；根癌農(nóng)桿菌是攜含目的基因、選擇抗性基因和報告基因的植物表達載體質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分為MS基本培養(yǎng)基+麥芽糖30g/L+葡萄糖 10g/L+2,4- 二氯苯氧乙酸Q，4-D)3mg/L+結(jié)冷膠2. 4g/L+維生素C 100mg/L+乙酰丁香酮 200 μ mol/L+ 硫辛酸 20-150mg/L ；pH 5. 2 ；恢復培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+麥芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-D 3mg/L+結(jié)冷膠 2. 4g/L+維生素C 100mg/L+乙酰丁香酮200 μ mol/L+硫辛酸20_150mg/L+抗生素特美汀 (Timentin)200mg/L ；pH 5. 8 ；維生素C、乙酰丁香酮、硫辛酸和特美汀的添加時間為培養(yǎng)基在15磅、15分鐘蒸汽高壓滅菌后，冷卻至45-55°C時添加。
3.根據(jù)權(quán)力要求1所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于培養(yǎng)基中添加 20-150mg/L 硫辛酸。
4.根據(jù)權(quán)力要求3所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于培養(yǎng)基中添加硫辛酸的濃度為50-100mg/L。
5.根據(jù)權(quán)力要求1所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于共培養(yǎng)前，將愈傷組織切成直徑l_3mm的組織塊。
6.根據(jù)權(quán)力要求5所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在添加了硫辛酸、 不加凝固劑的液體共培養(yǎng)基中進行切碎愈傷組織。
7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織過程，是在愈傷組織切碎后立即加入菌液混合均勻。
全文摘要
本發(fā)屬于植物基因工程技術(shù)領域，具體涉及一種用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的黑麥草(Lolium L.)遺傳轉(zhuǎn)化方法。包括愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)、愈傷組織切碎、根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、根癌農(nóng)桿菌侵染愈傷組織、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)、恢復除菌培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化再生培養(yǎng)、植株繼代選擇培養(yǎng)，愈傷組織誘導所用的材料是黑麥草的成熟種子胚；根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織時的培養(yǎng)基、根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)的培養(yǎng)基以及浸染后的恢復培養(yǎng)基中均添加硫辛酸；根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織過程，是在愈傷組織切碎后立即加入菌液混合均勻；根癌農(nóng)桿菌是攜含目的基因、選擇抗性基因和報告基因的植物表達載體質(zhì)粒。本發(fā)明方法能有效抑制共培養(yǎng)后愈傷組織的褐化，操作簡單易行，能獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號A01H4/00GK102268450SQ20101019351
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者喬定君, 楊宏, 毛萍, 馬欣榮 申請人:中國科學院成都生物研究所