專利名稱：一種創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，屬于遺傳育種學(xué)領(lǐng)域，建 立了簡(jiǎn)捷、快速創(chuàng)制梨自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的技術(shù)體系，在果樹(shù)自花結(jié)實(shí)性品種(株系)的選育 中有著重要的推廣價(jià)值。
背景技術(shù)：
梨是我國(guó)乃至世界主要水果之一，我國(guó)現(xiàn)有栽培面積125. 84萬(wàn)公頃，是我國(guó)的第 三大水果。梨是典型的配子體型自交不親和性果樹(shù)，也就是說(shuō)梨絕大多數(shù)品種自花授粉不 結(jié)實(shí)性，在生產(chǎn)中必須合理配置授粉樹(shù)或進(jìn)行人工輔助授粉，才有可能獲得應(yīng)有的產(chǎn)量，也 常常因授粉樹(shù)配置不當(dāng)、花期不良?xì)庀髼l件影響昆蟲(chóng)傳粉或人工授粉不及時(shí)等原因造成減 產(chǎn)，尤其是近年來(lái)地球氣候變化激烈，春季倒春寒以及花期低溫陰雨天氣影響昆蟲(chóng)的傳粉 活動(dòng)，使得許多梨樹(shù)授粉受精不良，坐果率低下，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。如果所栽培的梨品種自花 授粉能結(jié)實(shí)的話，就能避免或減少因傳粉媒介昆蟲(chóng)的不活動(dòng)而造成授粉受精不良、坐果率 低下、產(chǎn)量受損的問(wèn)題，尤其是對(duì)于保護(hù)地栽培的果樹(shù)來(lái)說(shuō)更為重要。因此，創(chuàng)新梨自花結(jié) 實(shí)性種質(zhì)，選育出梨自花結(jié)實(shí)性(自交親和性)品種是個(gè)亟待解決的問(wèn)題，也是今后梨、蘋(píng) 果等自花授粉不結(jié)實(shí)性果樹(shù)新品種選育的目標(biāo)之一。鑒于此，各國(guó)的梨育種學(xué)家已經(jīng)把培 育自花結(jié)實(shí)性品種作為育種目標(biāo)，但是進(jìn)展比較緩慢?！畩W嗄二十世紀(jì)’為自花結(jié) 實(shí)性梨品種，其雌蕊S/"-—M基因發(fā)生變異，導(dǎo)致雌蕊自交不親和性功能喪失，花粉自交 不親和性功能正常，因而是培育自花結(jié)實(shí)性后代的理想材料。日本已經(jīng)利用‘奧嗄二十世 紀(jì)’作親本，培育出自花結(jié)實(shí)性優(yōu)良品種‘秋榮’(> /"&)。早期以‘奧嗄二十世紀(jì)’ '、S2S4sm) 和‘秋榮’為親本培育自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)，雜交后代中既有自花結(jié)實(shí)性株系，又有自 花不結(jié)實(shí)性株系，需經(jīng)過(guò)篩選，只有攜帶S/"基因的株系(5^/w，a興4)才表現(xiàn)為自花結(jié) 實(shí)。正是由于自花結(jié)實(shí)性品種在栽培上有著良好的應(yīng)用前景，所以尋找一種快速、準(zhǔn) 確創(chuàng)制梨自花結(jié)實(shí)性后代株系(品種等)的方法顯得尤為重要。本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制 梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，利用‘奧嗄二十世紀(jì)’自交后代純合體株系‘54S-135’
作父本，另一個(gè)品種(SaSb，a、b興4)為母本進(jìn)行雜交授粉，根據(jù)基因的分離規(guī)律， 在其雜交后代中均攜帶自花結(jié)實(shí)性基因SZ^RTVtwe，故無(wú)需篩選，只要能得到后代株系即 為自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)。本技術(shù)體系簡(jiǎn)便快捷，為自花結(jié)實(shí)性優(yōu)良梨品種的選育節(jié)約了育種成 本，縮短了育種進(jìn)程。該理論體系還可借鑒應(yīng)用于其他作物自花結(jié)實(shí)種質(zhì)的創(chuàng)制，因此有著 廣返的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供了一種創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法。利用‘奧嗄 二十世紀(jì)，自交后代純合體株系‘54S-135，(SZm1STm)作父本，另一個(gè)品種(SaSb，a、b興4)
3為母本，進(jìn)行雜交授粉，得到后代株系即為自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)。技術(shù)方案創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，其特征在于1)田間授粉實(shí)驗(yàn)以基因型為S2S4smW ‘奧嗄二十世紀(jì)’自交后代S基因純合體 株系‘54S-135’為父本，春季采集其大蕾期花苞的花藥，室內(nèi)25°C干燥條件下散出
的花粉，于開(kāi)花前1天選用另一個(gè)基因型為SaSb，a、b Φ 4品種為母本，對(duì)擬授粉的花蕾去雄 后，人工授予‘ 54S-135，花粉，每個(gè)組合授粉200朵左右的花序，再套上硫酸紙袋，授粉后25 天調(diào)查花序和花朵坐果率，每花序留1 2個(gè)果，種子成熟后采果并取出種子，沙藏育苗；2) SZ^jRiVaM基因的鑒證用梨自花結(jié)實(shí)性S/^Atoe基因特異正反向引物S4smF 5' -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3 ‘S4smR 5 ‘ -GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3 ‘?dāng)U增雜交后代各株系的基因組DNA，若能擴(kuò)增出一條666bp的片段，則標(biāo)記著該植 株中含有SZw-ZWo^基因的存在，由于后代中各植株中均攜帶自花結(jié)實(shí)性基因S廣-RNase， 故所得后代均為自花結(jié)實(shí)性株系。有益效果本發(fā)明所提供的一種創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便、快捷。該方法所得到的雜交后代的自花結(jié)實(shí)性無(wú)需通過(guò)其 它方法的輔助鑒定和篩選，由于各株系中均攜帶自花結(jié)實(shí)性基因S廣-RNase，只要能從雜交 種中繁育出株系即可得到自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)。整個(gè)技術(shù)體系只涉及簡(jiǎn)單的人工雜交授粉和育 苗工作，操作流程簡(jiǎn)便易行，為選育工作節(jié)約了成本，縮短了進(jìn)程。(2)本發(fā)明的準(zhǔn)確度高。自花結(jié)實(shí)S4sm-RNaSe基因與控制花粉自花不結(jié)實(shí)基因的 遺傳距離為0，它在后代中沒(méi)有發(fā)生遺傳重組，各株系中均檢測(cè)出S4sm-RNaSe基因，證實(shí)了 該育種方法的準(zhǔn)確率為100%。(3)該發(fā)明還可借鑒應(yīng)用于其他作物的自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的創(chuàng)制。只要能得到作物 某一自花結(jié)實(shí)基因純合體株系，運(yùn)用該技術(shù)體系進(jìn)行雜交育種即可在短時(shí)間內(nèi)大量繁育出 自花結(jié)實(shí)性株系，因此有著廣返的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
四

圖1創(chuàng)制梨100%自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)方法的技術(shù)路線圖2 新高 QS3S9) X54S-135 (S4smSfm) 31 株雜交后代A 梨S基因保守區(qū)序列引物擴(kuò)增，B 梨SZm-WM^特異引物擴(kuò)增
五具體實(shí)施例方式(一)實(shí)驗(yàn)方法本研究以新高(S3S9)為母本試材，‘奧嗄二十世紀(jì)，(AS/")自交后代S基因純合 體株系‘54S-135’ (S4smS43"1)為父本進(jìn)行雜交創(chuàng)制梨自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)，具體技術(shù)流程如下1、田間授粉實(shí)驗(yàn)在‘奧嗄二十世紀(jì)，自交后代中，選擇S基因型為S4smS4sm品系定名‘54S-135’。春 季采集‘54S-135’大蕾期花苞的花藥，室內(nèi)25°C條件下使其散粉，收集花粉以備作授粉使
4用。于開(kāi)花前1天為‘新高’(該品種的S基因型為S3S9，現(xiàn)為我國(guó)主要栽培的砂梨品種之 一，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院興城果樹(shù)研究所梨種質(zhì)資源圃)去雄，授以‘54S-135’花粉200朵 左右的花序，再套上硫酸紙袋。授粉后25d調(diào)查花序和花朵坐果率，每花序留1 2個(gè)果， 種子成熟后采果并取出種子，沙藏育苗。2、雜交后代各株系S基因型的鑒定(I)CTAB法(張妤艷，黃紹西，張紹鈴，等.京白梨等品種S基因型鑒定及新基因 S28、S3(I的核苷酸序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33 (3) 496-500)提取各后代株系幼葉的基 因組DNA。(2)引物合成合成梨S基因保守區(qū)序列引物 PF(5' -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3‘ ) ^P PR(5' -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3‘)以及 梨自花結(jié)實(shí)性基因特異正反向引物57mF (5’ -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’ ) 和S4smR (5’-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’(引物序列參照本課題組張紹鈴，吳華清，齊永杰 等.快速鑒定梨自花結(jié)實(shí)性植株的分子標(biāo)記法[Z].CN101565748:，2009)(3)用梨S基因保守區(qū)序列引物PF、PR和^/"-及徹從特異引物^/"F、S4smR分 別對(duì)各后代株系基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積均為25 μ L 10 X PCR Buffer 2. 5 μ L 3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP, 各引物 0. 1 μ M，20-50ng 模板，Taq 酶 1. OU ；S基因保守區(qū)序列引物PCR擴(kuò)增所用程序?yàn)?4 V預(yù)變性2min，94 V 15s, 48°C 30s, 72°C 3min，10 個(gè)循環(huán)后，94°C變性 15S，48°C退火 30S，72°C 3. 5min，25 個(gè)循環(huán)后 72°C 延伸 7min ；從基因的特異引物PCR擴(kuò)增所用程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min，94°C，15s， 65°C，30s, 72°C 3min, 10 個(gè)循環(huán)后，94°C變性 15S, 65°C退火 30S, 72°C，3. 5min, 25 個(gè)循環(huán)后 72°C 延伸 7min ；應(yīng)用PTC-200擴(kuò)增儀(BIO-RAD)進(jìn)行擴(kuò)增；(4)反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μ 1，用1. 5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳 45分鐘，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。EB染色，在紫外燈下觀測(cè)，拍照。( 二 )結(jié)果與分析如圖2-Α所示，由于< /"單元型中S4-RNase基因發(fā)生了缺失，故用S基因保守區(qū) 序列引物PF和I3R不能擴(kuò)增出基因，只能從各株系的基因組DNA中擴(kuò)增出另 一個(gè)S基因，即大小為1347bp的S9-RNase基因，或大小為384bp的S3-RNase基因。通過(guò) SZw-AiV^e的特異引物S4smF和S4smR擴(kuò)增各株系的基因組DNA，若能擴(kuò)增出一條666bp的片 段，則標(biāo)記著該植株中含有基因的存在。如圖2-B所示，31株雜交株系中均能 擴(kuò)增出基因，故所得后代均為自花結(jié)實(shí)性株系。這與我們理論推測(cè)的結(jié)果保持 一致，證實(shí)了該育種方法的可行性和準(zhǔn)確性。最終確定了 31株雜交后代中S3S4sm S9S4sm = 16 15 1 1，符合基因分離規(guī)律。如果母本中存在S4的基因型，那么和S4smS4sm做父本雜交就會(huì)在后代中出現(xiàn)S4S/m 基因型的植株存在，雖然含有S/^RiVaM基因，但S4單元型花粉的自交不親和性功能正常， 其表型依然為自花授粉不結(jié)實(shí)。為了避免這種情況的發(fā)生，我們?cè)谶x擇母本時(shí)就針對(duì)性的 選擇SaSb，a、b Φ 4的基因型做母本，這樣就能很好的排除S4S廣基因型植株的存在，只要能得到后代株系，無(wú)需篩選，即為自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)，這大大節(jié)約了育種成本，縮短了育種進(jìn)程， 為自花結(jié)實(shí)性優(yōu)良梨品種的選育帶來(lái)了很大的方便。
權(quán)利要求
一種創(chuàng)制梨100％自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，其特征在于1)田間授粉實(shí)驗(yàn)以基因型為S2S4sm的‘奧嗄二十世紀(jì)’自交后代S基因純合體株系‘54S 135’為父本，春季采集其大蕾期花苞的花藥，室內(nèi)25℃干燥條件下散出的花粉，于開(kāi)花前1天選用另一個(gè)基因型為SaSb，a、b≠4品種為母本，對(duì)擬授粉的花蕾去雄后，人工授予‘54S 135’花粉，每個(gè)組合授粉200朵左右的花序，再套上硫酸紙袋，授粉后25天調(diào)查花序和花朵坐果率，每花序留1～2個(gè)果，種子成熟后采果并取出種子，沙藏育苗；2)基因的鑒證用梨自花結(jié)實(shí)性基因特異正反向引物S4smF5′ TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC 3′S4smR5′ GCCTTAAGGGTTCATTGGGC 3′擴(kuò)增雜交后代各株系的基因組DNA，若能擴(kuò)增出一條666bp的片段，則標(biāo)記著該植株中含有基因的存在，由于后代中各植株中均攜帶自花結(jié)實(shí)性基因S4sm RNase，故所得后代均為自花結(jié)實(shí)性株系。FSA00000233681400011.tif,FSA00000233681400012.tif,FSA00000233681400013.tif,FSA00000233681400014.tif
全文摘要
本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制梨100％自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的方法，屬于遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。利用“奧嗄二十世紀(jì)”自交后代純合體株系“54S-135”作父本，另外任何一個(gè)品種(SaSb，a、b≠4)為母本，進(jìn)行雜交授粉，其雜交后代的S基因型存在兩種可能，即或均攜帶自交親和性基因故所得后代無(wú)需篩選即為自花結(jié)實(shí)性株系。本技術(shù)流程簡(jiǎn)便快捷，只需通過(guò)簡(jiǎn)單的雜交授粉、留種育苗，即可獲得大量的自花結(jié)實(shí)性株系，縮短了選育自花結(jié)實(shí)性種質(zhì)的進(jìn)程，節(jié)約了選育自花結(jié)實(shí)性品種的成本。該技術(shù)體系還可借鑒應(yīng)用于其他作物自花結(jié)實(shí)種質(zhì)的創(chuàng)制，因此有著廣返的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
文檔編號(hào)A01H1/02GK101982063SQ20101025623
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 陶書(shū)田, 齊開(kāi)杰, 齊永杰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)