專利名稱：一種生物飼料添加劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于飼料添加劑領域，特別涉及含有多種活菌制劑的高效生物飼料添加劑產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法和應用。
背景技術：
目前我國奶牛存欄數(shù)約1000多萬頭，奶產(chǎn)量900多萬噸，奶牛養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展也促進和推動了我國飼料及添加劑行業(yè)的發(fā)展；但我國奶牛飼料仍停留在三大料(即玉米、麩皮、餅柏)的簡單混合上，造成配方中蛋白質(zhì)飼料單一、氨基酸搭配不當，奶的產(chǎn)量和質(zhì)量與歐美國家相比都有很大差距。研究開發(fā)高效生物活性飼料添加劑，對于提高我國奶牛生產(chǎn)的水平，改善牛奶的質(zhì)量，減少奶牛胃腸疾病和乳房炎的發(fā)病率，降低糞尿的不良氣味和糞尿氮的排除量，減少環(huán)境污染和充分提高飼料資源的有效利用(即提高廉價粗飼料的利用率，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率等)具有重要的實際應用價值。目前市場上流行的活菌制劑大多都是單一菌，而且主要應用在單胃動物飼料中，用于反芻動物(如奶牛)的產(chǎn)品目前只有美國和法國的2-3家的單一菌種制劑在我國宣傳和做養(yǎng)殖推廣實驗。枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌都是可以應用于飼料添加劑行業(yè)的益生菌，益生菌代謝產(chǎn)生的各種酶制劑及其有益代謝成分在促進消化、穩(wěn)定腸道菌群環(huán)境、提高飼料利用率方面具 有較好的效果；泡盛曲霉可以代謝產(chǎn)生包括葡聚糖酶在內(nèi)的多種酶制劑，其培養(yǎng)物作為飼料添加劑可以有效提高飼料的消化吸收效果。研制開發(fā)具有科學配比，且效果明顯的的含有多種有益微生物且酶活力強的復合飼料添加劑對于促進養(yǎng)殖業(yè)，特別是奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術問題是提供一種高效生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，本發(fā)明解決的另一技術問題是提供高效生物活性飼料添加劑產(chǎn)品生產(chǎn)方法及其應用。生物飼料添加劑組成為黑曲霉孢子濃度I. O 9. OX IO8個/克、地衣芽孢桿菌為I. O 9. OX IO8個/克、釀酒酵母I. O 8. 5X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌I. 3 8. 5X IO8
個/克。本發(fā)明產(chǎn)品的具體生產(chǎn)方法步驟如下I.微生物菌劑的培養(yǎng)制備分別擴培并干燥得到黑曲霉孢子、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和鼠李糖乳桿菌。(I)黑曲霉孢子制備斜面孢子懸浮液液接種到10° Brix麥芽汁固態(tài)培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2天半至長滿孢子，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。(2)地衣芽孢桿菌的制備斜面菌株經(jīng)活化后，接入液體種子培養(yǎng)基，在37°C、180rpm的搖床培養(yǎng)24h后接種至發(fā)酵罐中，在37°C、通風比I I (v/v)，400rpm培養(yǎng)2天至對數(shù)后期。發(fā)酵結束后，加入助濾劑輕質(zhì)碳酸鈣，經(jīng)板框過濾，流化床干燥。(3)釀酒酵母的制備斜面菌種接入三角瓶，培養(yǎng)至對數(shù)期后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，控制溫度為28°C，通風比為I : I. 5 (v/v)，培養(yǎng)20小時左右至對數(shù)期。發(fā)酵結束后，加入助濾劑輕質(zhì)碳酸鈣，經(jīng)板框過濾，流化床干燥。(4)鼠李糖乳桿菌的制備斜面菌種接入三角瓶，培養(yǎng)至對數(shù)期后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，控制溫度為45°C，通風比為I : O. I (v/v)，培養(yǎng)18小時左右至對數(shù)期。發(fā)酵完畢經(jīng)板框過濾分離獲得濕菌體，加入組成為10%脫脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保護劑，通過冷凍干燥獲得菌劑，水分含量低于10%。2、菌劑復配將上述各種菌按照比例進行復配，菌劑復配比例如下黑曲霉25-50份、地衣芽孢桿菌10-25份、釀酒酵母15-25份、鼠李糖乳桿菌25-40份。本發(fā)明采用的菌種如下黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC No. 3. 5269、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis) CGMCC No. I. 813、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCCNo>4429>鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC No. 4429 特點如下在顯微鏡下觀 察，該菌株的細胞為卵形，一端芽殖，大小約為I X 5 μ m ;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊且中等偏大。與原始菌相比，該誘變菌株在形態(tài)上明顯小于出發(fā)菌株。出發(fā)菌株釀酒酵母CICC31481購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明酵母菌株采用下述流程進行選育原始出發(fā)菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DES)誘變一聞滲平板篩選一亞硝基狐(NTG)誘變篩選一聞滲平板初篩一搖瓶復篩一傳代穩(wěn)定性試驗一7L發(fā)酵罐試驗。CGMCCNo. 4429葡萄糖耐受濃度可以達到300g/L。本發(fā)明使用菌種見專利申請名稱為一株耐高滲酵母菌的應用中保藏菌種，專利申請?zhí)?01110105966，
公開日為 2011. 09. 14。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特點如下在顯微鏡下觀察，該菌株為桿狀，寬度小于I μ m，2到3個桿菌易于連成連接在一起；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊。與原始菌相比，該誘變菌株在形態(tài)上明顯小于出發(fā)菌株。出發(fā)菌株鼠李糖乳桿菌CGMCC No. I. 2134購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明鼠李糖乳桿菌采用下述流程進行選育原始出發(fā)菌種一試管活化一高溫馴化一硫酸二乙酯(DES)誘變一高糖平板篩選一亞硝基胍(NTG)誘變篩選一高溫菌篩選一搖瓶復篩一傳代穩(wěn)定性試驗一5L發(fā)酵罐試驗。將目的菌株CGMCCNo. 4430做5L乳酸發(fā)酵罐實驗，結果表明與出發(fā)菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受濃度可以達到270g/L，與原始菌相比提高了 95% ;發(fā)酵結束后，乳酸含量為60g/L，與原始菌相比提高了 158%。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 4429、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年12月8日。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC No. 3. 5269、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No. I. 813購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明中黑曲霉孢子采用血球板計數(shù)法，其它菌種采用微生物平板計數(shù)方法檢測活菌數(shù)。本發(fā)明中菌劑復配的較優(yōu)比例為黑曲霉25-40份、地衣芽孢桿菌10-20份、釀酒酵母15-20份、鼠李糖乳桿菌25-35份。發(fā)明產(chǎn)品采用科學研究的菌劑復配比例技術有效確保產(chǎn)品中各種微生物菌劑的合理組成和比例，使得產(chǎn)品中微生物產(chǎn)生的酶在奶牛飼喂中可以有效促進飼料的消化吸收；復配技術使得產(chǎn)品在奶牛飼料的消化吸收率大幅提高，單位用量飼料的產(chǎn)出比例比對照有了顯著提高，奶牛的產(chǎn)量和質(zhì)量得以提高和保障。發(fā)明產(chǎn)品的性能穩(wěn)定，使用安全，與其它飼料添加劑均無配合禁忌。本發(fā)明產(chǎn)品在質(zhì)量穩(wěn)定可控，無環(huán)境污染，而且可以提高免疫力能夠提高養(yǎng)殖效益。產(chǎn)品完全符合綠色飼料添加劑的要求。有明顯提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率效果。本發(fā)明產(chǎn)品中鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母對動物胃腸道的消化有輔助作用，釀酒酵母在瘤胃中為瘤胃微生物的生長繁殖提供了有益的氨基酸、B族維生素和其它微量元素，增加瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成量。鼠李糖乳桿菌在奶牛的小腸釋放，可以消耗動物腸道內(nèi)的氧氣，使腸道內(nèi)有害的致病菌如好氧菌(主要是大腸桿菌、沙門氏菌等)受到抑制，還能抑制氨和胺的合成，益增強免疫力，達到改善奶牛胃腸道微生物生態(tài)平衡，有利于健康和提高生產(chǎn)性能的目的；地衣芽孢桿菌在腸道代謝產(chǎn)生的酶類和 黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)物中含有的有效劑量的纖維素酶、葡聚糖酶、木質(zhì)素分解酶和淀粉酶有利于奶牛等反芻動物飼料中纖維類飼料的消化吸收，改善反芻動物腸道的微生態(tài)平衡，提高飼料利用率，提高奶牛產(chǎn)奶量，提高牛奶的品質(zhì)，提高奶牛肌體免疫力，減少腸道疾病，凈化飼養(yǎng)環(huán)境。該飼料添加劑可應用于奶牛養(yǎng)殖業(yè)，可以顯著提高牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量。本發(fā)明產(chǎn)品能夠提高奶牛肌體免疫力，減少隱性乳房炎、腸道疾病的發(fā)病率。目前，我國奶牛群中隱性乳房炎發(fā)病率是比較高的，奶牛一旦患有乳房炎就必須注射抗生素治療，注射了抗生素的奶牛7天之內(nèi)所產(chǎn)出的牛奶都不能出售(牛奶中會殘留抗生素對人體有危害)。使用本發(fā)明產(chǎn)品可以降低奶牛隱性乳房炎發(fā)病率，飼喂試驗表明本發(fā)明產(chǎn)品降低乳房炎發(fā)病率70% (與對照組比較)，明顯減少奶牛乳房炎的發(fā)生，減少抗生素的使用和含抗生素奶的產(chǎn)出，間接提高了養(yǎng)殖者的效益。本發(fā)明產(chǎn)品對提高我國奶牛生產(chǎn)的水平，充分提高飼料資源的有效利用(即提高廉價粗飼料的利用率，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率等)等方面都具有很高的價值。本發(fā)明也適合其他反芻動物如肉牛、羊的飼喂。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例I :高效活性飼料添加劑產(chǎn)品產(chǎn)品組成如下黑曲霉孢子濃度I. O 3. OX IO8個/克、地衣芽孢桿菌為I. O 3. O X IO8個/克、釀酒酵母I. O 3. 5 X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌I. 3 4. 5 X IO8個/克。菌劑復配各種菌劑復配比例，黑曲霉30份、地衣芽孢桿菌20份、釀酒酵母20份、鼠李糖乳桿菌30份，復配菌劑包裝。實施例2 :高效活性飼料添加劑產(chǎn)品產(chǎn)品組成如下黑曲霉孢子濃度5X108個/克、地衣芽孢桿菌為5X108個/克、釀酒酵母6 X IO8個/克、鼠李糖乳桿菌6 X IO8個/克。菌劑復配各種菌劑復配比例，黑曲霉40份、地衣芽孢桿菌15份、釀酒酵母16份、鼠李糖乳桿菌29份，復配菌劑包裝。
實施例3 :例I和2中所述高效活性飼料添加劑產(chǎn)品生產(chǎn)方法產(chǎn)品生產(chǎn)方法主要包括微生物菌劑的生產(chǎn)和復配工藝。微生物菌劑的生產(chǎn)黑曲霉孢子的制備方法I)斜面培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)基IOmL加入試管，121°C，20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。2) K式培養(yǎng)瓶孢子
取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養(yǎng)瓶，121°C，20min滅菌后，鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養(yǎng)基表面；側放入恒溫箱，30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。3)固態(tài)放大培養(yǎng)將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于I. OX IO8個/mL。取200kg固態(tài)培養(yǎng)基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌I小時。待放涼后，接入孢子懸浮液，攪拌均勻。培養(yǎng)溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時間3天；待培養(yǎng)料長滿孢子即可結束培養(yǎng)干燥粉碎發(fā)酵結束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在100目以上。地衣芽孢桿菌的制備方法培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖60，酵母提取物20，磷酸氫二鉀O. 5，七水硫酸鎂O. 5，ρΗ6· 8ο(I) 一級種子培養(yǎng)500mL搖瓶裝液量為IOOmL,滅菌后接入一環(huán)地衣芽孢桿菌，在搖床上，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間24小時至對數(shù)期；(2) 二級種子培養(yǎng)將一級種子按照10% (v/v)的接種量接入30L的種子罐中，裝液量21L，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，通風量(V/V) I O. 5，罐壓O. 05Mpa，培養(yǎng)時間24小時至對數(shù)期。(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子罐中的種子以10% (v/v)接種量接入300L發(fā)酵罐，裝液量210L，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，通風量(V/V) I O. 5，罐壓O. 05Mpa,培養(yǎng)時間24小時，培養(yǎng)結束菌濃度在5. OX IO9個/mL。(4)離心分離采用板框過濾分離獲得菌體。(7)真空冷凍干燥添加保護劑后采用噴霧干燥工藝處理獲得干粉菌劑；保護劑組成為脫脂奶10%、乳糖5%、甘油5%。釀酒酵母菌的制備方法從斜面轉(zhuǎn)接釀酒酵母菌到液體搖瓶，液體搖瓶經(jīng)三級擴培后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢低溫濃縮、與載體混合，流化床干燥工藝獲得活性釀酒酵母菌劑。釀酒酵母細胞的培養(yǎng)采用斜面菌種逐級擴培獲得釀酒酵母細胞；(I) 一級種子培養(yǎng)將釀酒酵母斜面菌種接入500mL搖瓶中，培養(yǎng)基裝量IOOmLJ^轉(zhuǎn)式搖床120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間18小時；(2) 二級種子培養(yǎng)將一級種子按照10%的接種量接入500mL 二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；(3)三級種子培養(yǎng)將二級種子以10%接種量接入5000mL三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量IOOOmL,旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間18小時；(4) 一級種子罐培養(yǎng)將三級種子以5%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風量(V/V)l 0.5，罐壓O. 05Mpa，培養(yǎng)時間16小時；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)將一級種子罐菌種以5%接種量(v/v)接入總容積為3噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，前期通風量(V/V) I : O. 5，罐壓O. 05Mpa，前期培養(yǎng)時間12小時；后期罐壓O. 05Mpa，攪拌速度50轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時間8小時，培養(yǎng)末期的釀酒酵母濃度達到3. OX IO9個/mL。
(6)濃縮發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到釀酒酵母菌濃縮液。(7)添加載體向釀酒酵母菌濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為O. 5-0. 7 1，載體組成為=CaCO3 40份，糊精20份，玉米蛋白粉20份。 (8)干燥流化床干燥，干燥溫度50°C。培養(yǎng)基采用10%麥芽汁培養(yǎng)基或采用添加硫酸銨等無機鹽的糖蜜培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)生產(chǎn)工藝參見肖冬光《釀酒活性干酵母的生產(chǎn)與應用技術》。鼠李糖乳桿菌菌劑的制備斜面菌種接入三角瓶，培養(yǎng)至對數(shù)期后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，控制溫度為45°C，通風比為I : O. I (v/v)，培養(yǎng)18小時左右至對數(shù)期。發(fā)酵完畢經(jīng)板框過濾分離獲得濕菌體，加入組成為10%脫脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保護劑，通過冷凍干燥獲得菌劑，水分含量低于10%。產(chǎn)品效果實驗試驗牛的選擇與試驗設計試驗于2010年9月7日-10月7日在寧夏吳忠市金積牛場進行，本試驗采取隨機配對原則，將40頭牛隨機的分為試驗組和對照組，每組20頭牛，在日糧中按每頭每日添加產(chǎn)品40g，飼喂60天，結果表明實驗組日增重972. 7g，對照組日增重746. Sg，差異極顯著(P <0.01)。飼喂5天后，其糞便干物質(zhì)和飼喂前相比，減少30 %。使用高效生物活性飼料添加劑I個月后，發(fā)現(xiàn)牛奶產(chǎn)量比較穩(wěn)定，(不喂的組下降幅度較大，因為試驗牛已過了泌乳高峰期)，乳脂率也增加了，效果很好。從奶牛外表來看，喂高效生物活性飼料添加劑的奶牛的毛亮，食欲好，乳房炎發(fā)病率降低。
權利要求
1.一種生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，包括釀酒酵母，其特征在于每克產(chǎn)品中含有黑曲霉孢子I. O 9. O X IO8個、地衣芽孢桿菌I. O 9. O X IO8個、釀酒酵母I. O 8. 5 X IO8個、鼠李糖乳桿菌I. 3 8. 5 X IO8個。
2.根據(jù)權利要求I所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于所述黑曲霉、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉25-50份、地衣芽孢桿菌10-25份、釀酒酵母15-25份、鼠李糖乳桿菌25-40份。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于所述黑曲霉、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉25-40份、地衣芽孢桿菌10-20份、釀酒酵母15-20份、鼠李糖乳桿菌25-35份。
4.根據(jù)權利要求I或2或3所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于所述黑曲霉、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌復配比例為黑曲霉30份、地衣芽孢桿菌20份、釀酒酵母20份、鼠李糖乳桿菌30份，復配菌劑包裝。
5.根據(jù)權利要求I或2所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于所述微生物菌劑中黑曲霉為CGMCC No. 3. 5269、地衣芽孢桿菌為CGMCC No. I. 813、釀酒酵母為CGMCCNo. 4429、鼠李糖乳桿菌為 CGMCC No. 4430。
6.根據(jù)權利要求I所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于每克產(chǎn)品含有黑曲霉孢子I. O 3. OX IO8個、地衣芽孢桿菌I. O 3. OX IO8個、釀酒酵母I. O 3. 5X108個、鼠李糖乳桿菌I. 3 4. 5 X IO8個。
7.根據(jù)權利要求I或4所述的生物活性飼料添加劑產(chǎn)品，其特征在于每克產(chǎn)品含有黑曲霉孢子5 X IO8個、地衣芽孢桿菌為5 X IO8個、釀酒酵母6 X IO8個、鼠李糖乳桿菌6 X IO8個。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物飼料添加劑，屬于飼料添加劑領域，解決了含有多種活菌制劑的高效生物飼料添加劑產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法和應用的技術問題。涉及生物飼料添加劑組成為黑曲霉孢子濃度1.0～9.0×108個/克、地衣芽孢桿菌為1.0～9.0×108個/克、釀酒酵母1.0～8.5×108個/克、鼠李糖乳桿菌1.3～8.5×108個/克。本飼料含有多種有益微生物且酶活力強，經(jīng)實驗驗證本飼料對于奶牛產(chǎn)奶量及牛奶成分均有顯著提高作用。
文檔編號A23K1/16GK102835564SQ201110419570
公開日2012年12月26日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者李政, 張健飛, 王玉, 李績 申請人:天津工業(yè)大學