專利名稱：月季雜交親和性快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生殖生物學(xué)領(lǐng)域，具體是一種月季雜交親和性的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
月季(Rosa hybrida)是世界第一大觀賞植物，迄今為止，全世界的月季品種已超過(guò)35000個(gè)。絕大多數(shù)月季品種都是通過(guò)長(zhǎng)期的遠(yuǎn)緣、近緣雜交培育出來(lái)的。隨著UPOV公約1991文本的實(shí)施，雜交育種將成為培育月季新品種的唯一手段。研究配組親本的雜交親和性對(duì)選育月季品種至關(guān)重要，尤其是育種核心種質(zhì)資源的應(yīng)用研究，利用遠(yuǎn)緣雜交篩選抗性品種。月季雜交親和性受遺傳親緣關(guān)系、遺傳基因、染色體倍性等方面控制或影響， 在分子育種手段研究育種資源遺傳親緣關(guān)系的基礎(chǔ)上，田間雜交結(jié)實(shí)率是雜交親和性最真實(shí)而直接的體現(xiàn)。月季的雜交不親和性有下列表現(xiàn)雜交授粉時(shí)，1)花粉粒在柱頭上不能萌發(fā)；2)花粉粒雖能在柱頭上萌發(fā)，但花粉管卻不能穿過(guò)柱頭或者不能穿過(guò)花柱到達(dá)胚囊； 3)花粉管雖能到達(dá)胚囊，但它釋放的精子不能和卵細(xì)胞融合形成合子，最終導(dǎo)致雜交不結(jié)實(shí)。在常規(guī)雜交育種過(guò)程中，只能通過(guò)觀察授粉后子房是否膨大來(lái)鑒定父母本是否親和，而這通常需要在授粉后15-20天左右才能觀察到，這樣不僅浪費(fèi)了大量的育種資源，而且還降低育種效率，不利于高品質(zhì)月季花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
對(duì)雜交不親和的品種，其在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)，胼胝質(zhì)是β -1，3 —葡聚糖，常分布于高等植物的篩管、新形成的細(xì)胞壁、花粉粒以及花粉管中，胼胝質(zhì)用苯胺藍(lán)染色后，在紫外光激發(fā)下，能夠發(fā)出黃至黃綠色的熒光。由此，可把授粉后的子房用苯胺藍(lán)染色后，放到熒光顯微鏡下觀察，即可觀察到花粉在柱頭上的萌發(fā)狀態(tài)、花粉管的生長(zhǎng)狀態(tài)，以及胼胝質(zhì)在柱頭表面的沉積狀況等，以此可判斷出該雜交組合是否親和。為了能在短時(shí)間內(nèi)，盡早鑒定配組親本的雜交親和性，確定配組雜交能否成功，減少育種資源浪費(fèi)，提高育種效率，本發(fā)明提供一種月季雜交親和性的快速鑒定方法。本發(fā)明提供的是這樣一種月季雜交親和性快速鑒定方法，其特征在于包括花粉的收集與保存步驟、去雄步驟、人工授粉步驟、待鑒定試樣的切取步驟，其特征在于還包括下列步驟
Α、將切取的待鑒定試樣固定于FAA固定液中，M小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶液中保存；其中，所述FAA固定液為下列配比
質(zhì)量濃度為37 40%的甲醛5 10 ml
質(zhì)量濃度為70 %的乙醇80 90 ml
冰醋酸5 10 ml ；
B、將步驟A固定過(guò)的試樣按常規(guī)用水沖洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55 60°C水浴15 20分鐘，取出，于20 下放置3 3. 5小時(shí)；
C、將步驟B的試樣用自來(lái)水浸泡至少1小時(shí)，其間更換自來(lái)水3 4次，除去大部分氫氧化鈉溶液，之后轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0. 1%的苯胺藍(lán)染液中染色2 3小時(shí)；
D、取步驟C的染色試樣，按常規(guī)用熒光顯微鏡觀察柱頭胼胝質(zhì)沉積狀況，花粉萌發(fā)狀態(tài)，花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)，從而鑒定月季雜交親和性。所述步驟A的冰醋酸為市購(gòu)的分析純產(chǎn)品。所述花粉的收集與保存步驟是選擇生長(zhǎng)健壯的植株，挑選待開(kāi)放花朵，并掛牌標(biāo)記，母本去雄，套袋，將從父本花朵上摘下的花藥置于20 25°C通風(fēng)處陰干，得散粉，4°C保存，待用。所述去雄步驟是選擇母本植株上次日要開(kāi)放的花朵進(jìn)行去雄，之后套袋。這時(shí)雄蕊尚未完全發(fā)育成熟，去雄時(shí)不會(huì)散落花粉。操作時(shí)間以下午15:00 17:00為好。所述人工授粉步驟是于上午9:00-10:00，先取下母本株上的套袋，用毛筆蘸取適量散開(kāi)的花粉，涂抹授粉在母本柱頭上，再套袋，保持30 48小時(shí)。所述待鑒定試樣的切取步驟是取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱連同子房。本發(fā)明步驟B中，用NaOH處理花柱的目的在于去除花柱組織細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)，使花粉管不受周圍花柱組織細(xì)胞遮擋，易于被染色并觀察，因此，該步驟B是觀察花粉管萌發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，直接影響到觀察的效果。當(dāng)觀察到試樣有以下特征之一時(shí)，則鑒定為雜交不親和 (1)未見(jiàn)有花粉粒萌發(fā)。(2)即便有少量花粉萌發(fā)，但生長(zhǎng)到花柱中上部即停止生長(zhǎng)，花粉管末端膨大，或彎曲，或變形，柱頭及花粉管有大量胼胝質(zhì)沉積。當(dāng)觀察到試樣有花粉粒萌發(fā)并且有少量花粉管進(jìn)入子房時(shí)，則鑒定為雜交有親和性。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案，可在較短時(shí)間內(nèi)，即30 48小時(shí)， 鑒定出月季組合的雜交親和性，從根本上解決常規(guī)雜交育種中，需要通過(guò)觀察授粉后子房是否膨大，才能鑒定出父母本是否親和，而這種觀察需要等授粉后15-20天左右才能觀察， 本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，可以盡早的鑒定配組親本的雜交親和性，確定配組雜交能否成功，有效減少育種資源浪費(fèi)，提高育種效率。


圖1為雜交親和的花粉在柱頭上的萌發(fā)； 圖2為雜交親和的花粉在柱頭上的萌發(fā)；
圖3為花柱中部的花粉管；
圖4為雜交親和的花粉管進(jìn)入子房；
圖5為圖3的局部放大；
圖6為雜交親和的花粉管進(jìn)入子房；
圖7為雜交不親和的柱頭上沒(méi)有花粉粒；
圖8為雜交不親和的柱頭上有大量胼胝質(zhì)沉積。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
本實(shí)施例1中的月季指薔薇科薔薇屬OfeM Linnaeus)中的栽培品種(cultivar)，經(jīng)過(guò)下列步驟
1)花粉的收集與保存選擇生長(zhǎng)健壯的植株，挑選待開(kāi)放花朵，并掛牌標(biāo)記，將從父本花朵上摘下的花藥置于20°C通風(fēng)處陰干，得散開(kāi)的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午15:00，選擇母本植株上次日要開(kāi)放的花朵進(jìn)行去雄，之后套袋，因這時(shí)雄蕊尚未完全發(fā)育成熟，去雄時(shí)不會(huì)散落花粉；
3)人工授粉于上午9 00，先取下母本株上的套袋，用毛筆蘸取適量散開(kāi)的花粉，涂抹授粉在母本柱頭上，再套袋，保持30小時(shí)，并在牌上寫(xiě)明組合名稱或代號(hào)、雜交日期、操作人姓名等信息；
4)待鑒定試樣的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱連同子房；
5)將步驟4)切取的待鑒定試樣固定于FAA固定液中，24小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為 70%的乙醇溶液中保存；其中該FAA固定液為下列配比
質(zhì)量濃度為37%的甲醛IOml
質(zhì)量濃度為70%的乙醇80 ml
分析純冰醋酸10 ml
6)將步驟5)固定過(guò)的試樣按常規(guī)用水沖洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55°C水浴 15分鐘，取出，于20°C下放置3. 5小時(shí)；
7)將步驟6)的試樣用自來(lái)水浸泡至少1小時(shí)，其間更換自來(lái)水3次，除去大部分氫氧化鈉溶液，之后轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0. 1%的苯胺藍(lán)染液中染色2小時(shí)；
8)用鑷子挑取一枚步驟7)的染色試樣，放在載玻片上，用濾紙吸出染液，滴上一滴甘油，蓋上蓋玻片，輕輕敲壓蓋玻片，使花柱展開(kāi)，然后把載玻片放到LEICA DM6000 B熒光顯微鏡下觀察，觀察到柱頭有花粉萌發(fā)，如圖1，并且18小時(shí)后再次取樣觀察時(shí)有少量花粉管進(jìn)入子房，如圖4，說(shuō)明該月季雜交有親和性。實(shí)施例2
本實(shí)施例2中的月季指薔薇科薔薇屬、Rosa Linnaeus)中的栽培品種(cultivar)，經(jīng)過(guò)下列步驟
1)花粉的收集與保存選擇生長(zhǎng)健壯的植株，挑選待開(kāi)放花朵，并掛牌標(biāo)記，將從父本花朵上摘下的花藥置于25°C通風(fēng)處陰干，得散開(kāi)的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午17:00，選擇母本植株上次日要開(kāi)放的花朵進(jìn)行去雄，之后套袋，因這時(shí)雄蕊尚未完全發(fā)育成熟，去雄時(shí)不會(huì)散落花粉；
3)人工授粉于上午10:00，先取下母本株上的套袋，用毛筆蘸取適量散開(kāi)的花粉，涂抹授粉在母本柱頭上，再套袋，保持48小時(shí)，并在牌上寫(xiě)明組合名稱或代號(hào)、雜交日期、操作人姓名等信息；
4)待鑒定試樣的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱連同子房；
5)將步驟4)切取的待鑒定試樣固定于FAA固定液中二4小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶液中保存；其中該FAA固定液為下列配比
質(zhì)量濃度為40%的甲醛質(zhì)量濃度為70%的乙醇分析純冰醋酸
5 ml 90 ml 5 ml ；
6)將步驟5)固定過(guò)的試樣按常規(guī)用水沖洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，60°C水浴 20分鐘，取出，于下放置3小時(shí)；
7)將步驟6)的試樣用自來(lái)水浸泡至少1小時(shí)，其間更換自來(lái)水4次，除去大部分氫氧化鈉溶液，之后轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0. 1%的苯胺藍(lán)染液中染色3小時(shí)；
8)用鑷子挑取一枚步驟7)的染色試樣，放在載玻片上，用濾紙吸出染液，滴上一滴甘油，蓋上蓋玻片，輕輕敲壓蓋玻片，使花柱展開(kāi)，然后把載玻片放到LEICA DM6000 B熒光顯微鏡下觀察，觀察到柱頭有花粉萌發(fā)，如圖2，且有少量花粉管進(jìn)入子房，如圖6，說(shuō)明該月季雜交有親和性。 實(shí)施例3
本實(shí)施例3中的月季指薔薇科薔薇屬、Rosa Linnaeus)中的栽培品種(cultivar)，經(jīng)過(guò)下列步驟
1)花粉的收集與保存選擇生長(zhǎng)健壯的植株，挑選待開(kāi)放花朵，并掛牌標(biāo)記，將從父本花朵上摘下的花藥置于22°C通風(fēng)處陰干，得散開(kāi)的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午15 30，選擇母本植株上次日要開(kāi)放的花朵進(jìn)行去雄，之后套袋，因這時(shí)雄蕊尚未完全發(fā)育成熟，去雄時(shí)不會(huì)散落花粉；
3)人工授粉于上午9 40，先取下母本株上的套袋，用毛筆蘸取適量散開(kāi)的花粉，涂抹授粉在母本柱頭上，再套袋，保持38小時(shí)，并在牌上寫(xiě)明組合名稱或代號(hào)、雜交日期、操作人姓名等信息；
4)待鑒定試樣的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱連同子房；
5)將步驟4)切取的待鑒定試樣固定于FAA固定液中，24小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為 70%的乙醇溶液中保存；其中該FAA固定液為下列配比
質(zhì)量濃度為38%的甲醛7 ml
質(zhì)量濃度為70%的乙醇85 ml
分析純冰醋酸8 ml ；
6)將步驟5)固定過(guò)的試樣按常規(guī)用水沖洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，58°C水浴 18分鐘，取出，于25 °C下放置3小時(shí)；
7)將步驟6)的試樣用自來(lái)水浸泡至少1小時(shí)，其間更換自來(lái)水3次，除去大部分氫氧化鈉溶液，之后轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0. 1%的苯胺藍(lán)染液中染色2小時(shí)；
8)用鑷子挑取一枚步驟7)的染色試樣，放在載玻片上，用濾紙吸出染液，滴上一滴甘油，蓋上蓋玻片，輕輕敲壓蓋玻片，使花柱展開(kāi)，然后把載玻片放到LEICA DM6000 B熒光顯微鏡下觀察，觀察到柱頭上沒(méi)有花粉粒，如圖7，且柱頭上有大量胼胝質(zhì)沉積，如圖8，說(shuō)明該月季雜交無(wú)親和性。
權(quán)利要求
1. 一種月季雜交親和性快速鑒定方法，其特征在于包括花粉的收集與保存步驟、去雄步驟、人工授粉步驟、待鑒定試樣的切取步驟，其特征在于還包括下列步驟A、將切取的待鑒定試樣固定于FAA固定液中，M小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶液中保存；其中，所述FAA固定液為下列配比B、將步驟A固定過(guò)的試樣按常規(guī)用水沖洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55 60°C 水浴15 20分鐘，取出，于20 下放置3 3. 5小時(shí)；C、將步驟B的試樣用自來(lái)水浸泡至少1小時(shí)，其間更換自來(lái)水3 4次，除去大部分氫氧化鈉溶液，之后轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0. 1%的苯胺藍(lán)染液中染色2 3小時(shí)；D、取步驟C的染色試樣，按常規(guī)用熒光顯微鏡觀察柱頭胼胝質(zhì)沉積狀況，花粉萌發(fā)狀態(tài)，花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)，從而鑒定月季雜交親和性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A的冰醋酸為市購(gòu)的分析純產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述花粉的收集與保存步驟是選擇生長(zhǎng)健壯的植株，挑選待開(kāi)放花朵，并掛牌標(biāo)記，母本去雄，套袋，將從父本花朵上摘下的花藥置于 20 25°C通風(fēng)處陰干，得散粉，4°C保存，待用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述去雄步驟是選擇母本植株上次日要開(kāi)放的花朵進(jìn)行去雄，之后套袋，這時(shí)雄蕊尚未完全發(fā)育成熟，去雄時(shí)不會(huì)散落花粉，操作時(shí)間以下午15:00 17:00為好。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述人工授粉步驟是于上午9:00-10:00，先取下母本株上的套袋，用毛筆蘸取適量散開(kāi)的花粉，涂抹授粉在母本柱頭上，再套袋，保持 30 48小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述待鑒定試樣的切取步驟是取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱連同子房。質(zhì)量濃度為37 40%的甲醛質(zhì)量濃度為70%的乙醇冰醋酸.5 10 ml 80 90 ml 5 10 ml ；
全文摘要
本發(fā)明提供一種月季雜交親和性快速鑒定方法，其特征在于包括花粉的收集與保存、去雄、人工授粉、待鑒定試樣的切取等步驟，之后將切取的試樣固定于FAA固定液中，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入70%的乙醇溶液中；取出水洗，置于8mol/L的NaOH溶液中，55～60℃水浴15～20分鐘，于20～28℃下放置3～3.5小時(shí)；用水浸泡至少1小時(shí)，轉(zhuǎn)移到0.1%的苯胺藍(lán)染液中染色2～3小時(shí)；用熒光顯微鏡觀察柱頭胼胝質(zhì)沉積、花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)，以鑒定月季雜交親和性?？稍?0～48小時(shí)內(nèi)，鑒定出月季組合的雜交親和性，簡(jiǎn)單且操作性強(qiáng)，能有效減少育種資源浪費(fèi)，提高育種效率。
文檔編號(hào)A01H1/02GK102550396SQ201210040899
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者劉紅明, 唐開(kāi)學(xué), 張顥, 王其剛 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所