專利名稱：用于枯萎病的生物防治劑及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于果蔬病害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于枯萎病的生物防治劑及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物枯萎病(Cucurbits Fusarium Wilt)又稱蔓割病,萎蔫病,是作物類的一種重要土傳病害，分布廣泛，植株幼苗期與成株期均可發(fā)病，主要危害黃瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜等葫蘆科作物，以及番茄、茄子、馬鈴薯等茄科作物。枯萎病是由半知鐮刀菌屬真菌侵染所致。經(jīng)鑒定，我國(guó)有兩個(gè)種尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysorum Schlecht.)和瓜類鐮刀菌(Fusarium bulbigenum Cke. et Mass. var. niveum(E. F. Sm) Wr.)。病菌的生活力極強(qiáng)， 在土壤中可存活5 6年?？菸∈且活愇：?yán)重的土傳病害。以黃瓜為例，每年發(fā)病率一般為12 30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80 90%，其中大棚栽培瓜類枯萎病的發(fā)病率較高，對(duì)生產(chǎn)造成的損失嚴(yán)重。對(duì)枯萎病的防治目前主要通過選種抗病品種、結(jié)合栽培管理、化學(xué)藥劑防治等綜合措施?；瘜W(xué)藥劑防治，主要采用藥劑種子消毒和土壤藥劑處理的方法?；瘜W(xué)藥劑的長(zhǎng)期頻繁使用，會(huì)引起病原菌抗藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致防治效果不理想，且農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)和有害生物的猖獗，還造成環(huán)境污染，生態(tài)失衡等嚴(yán)重社會(huì)問題。生物防治是一種有效的作物病害防治途徑，目前作物枯萎病的生物防治菌劑以細(xì)菌為主，防治穩(wěn)定性差，加之枯萎病菌變異性強(qiáng)，容易產(chǎn)生抗病性，導(dǎo)致生物防治的實(shí)際應(yīng)用受到較大限制。經(jīng)檢索，該領(lǐng)域的相關(guān)專利有1)中國(guó)專利申請(qǐng)(200710156836. O)公開了一種防治蔬菜真菌病害的微生物農(nóng)藥的制備方法。該方法利用土樣中分離篩選出的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，將其代謝產(chǎn)物與農(nóng)藥配合進(jìn)行黃瓜枯萎病和番茄灰霉病防治，其使用方法沒有完全脫離化學(xué)農(nóng)藥。2)中國(guó)專利申請(qǐng)(200810224678. 2)公開了一種防治植物真菌病害的菌劑，該菌劑主要由兩種木霉組成。3)中國(guó)專利申請(qǐng)(200810011342)公開了采用一種海洋枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑防治黃瓜枯萎病。以上兩個(gè)專利中所采用的菌種都比較單一，難以滿足復(fù)雜的土壤環(huán)境要求，制劑的環(huán)境適應(yīng)性和防效穩(wěn)定性受到限制，對(duì)病害的防治作用有限。4)中國(guó)專利申請(qǐng)(201010277116. I) 一種防黃瓜枯萎病的微生物復(fù)合菌劑及其制備方法，其應(yīng)用沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌、植物乳桿菌和釀酒酵母組成的微生物復(fù)合菌劑防治黃瓜枯萎病。該專利公開的復(fù)合菌劑的制備方法采用多菌種混合發(fā)酵，由于每種菌的培養(yǎng)條件存在較大差異，致使終產(chǎn)品中每種菌的有效活菌數(shù)無法明確，就不能使每種菌的功效得到發(fā)揮，產(chǎn)品的使用效果就會(huì)受限制；另外該復(fù)合菌劑僅針對(duì)黃瓜枯萎病的防治，使用范圍有限。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提出一種用于枯萎病的生物防治劑及其制備和使用方法，所制備的生物防治劑不僅能提高枯萎病的防治效果和防治穩(wěn)定性，增加土壤營(yíng)養(yǎng)素含量，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高作物生長(zhǎng)抗病性，重要的是其施用不添加化學(xué)農(nóng)藥，不會(huì)造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，是綠色環(huán)保的防治方法。本發(fā)明所提出的用于枯萎病的生物防治劑，是以生化黃腐酸液為基液，內(nèi)含有產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌(Trichoderma viride) > I X 107cfu/mL ;黑曲霉菌(Aspergillusniger) > 0. 5X 107cfu/mL ;枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) > 0. 8X 109cfu/mL ;膠質(zhì)芽抱桿菌(Bacillus mucilaginosus) ^ 0. 8X 109cfu/mLo本發(fā)明生物防治劑的特點(diǎn)還在于，是以生化黃腐酸液為基液，按體積比加入其余組分產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液10% 20% ;黑曲霉菌菌懸液5% 10% ;枯草芽孢 桿菌菌懸液8% 15% ;膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液8% 12% ;其中，產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液中活菌數(shù)> 108cfu/mL，黑曲霉菌菌懸液中活菌數(shù)> 108cfu/mL，枯草芽孢桿菌菌懸液中活菌數(shù)彡101Qcfu/mL，膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液中活菌數(shù)彡101QCfu/mL。上述生物防治劑的制備方法，是將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌按常規(guī)方法分別擴(kuò)大培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液按10% 15%的體積量接種入發(fā)酵罐分別進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 35°C,培養(yǎng)時(shí)間24 72h,分別獲得四種菌懸液；生化黃腐酸液可以按照中國(guó)專利申請(qǐng)(200610162041.6)中的方法制備，或是采用其他方法獲得(如市購)；再將所述四種菌懸液按上述配比混合于生化黃腐酸液，攪拌均勻即可。本發(fā)明用于枯萎病的生物防治劑的使用方法包括三種方式種植前浸種將所述的生物防治劑加水稀釋100 200倍，浸泡種子5 10小時(shí)；種植時(shí)灌根將所述的生物防治劑加水稀釋100 300倍，按每畝4 5升生物防治劑的用量，澆灌于植株根部；植株噴灑在結(jié)果和果實(shí)膨大期，將所述的生物防治劑按每畝I 2升的用量，過濾后加水稀釋20 60倍，噴灑于葉面、葉背、果實(shí)及幼莖；以上三種方式在種植過程中允許單一使用，或視病情組合使用。本發(fā)明的生物防治劑采用細(xì)菌與真菌的復(fù)合微生物進(jìn)行枯萎病的生物防治，一方面利用綠色木霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的拮抗作用，提高防病能力；另一方面利用有益微生物和生化黃腐酸具有活化土壤營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)、誘導(dǎo)提高抗病性的作用，從而提高作物枯萎病的防治效果。本發(fā)明的生物防治劑適用于黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆瓜、絲瓜等葫蘆科作物枯萎病的防治，也適于番茄、茄子等茄科作物枯萎病的防治。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I、所選用的微生物菌種具有較強(qiáng)的土壤與環(huán)境適應(yīng)能力，施用后，菌株可迅速在葉面、莖桿及土壤中定殖，有效改善土壤微生物菌群數(shù)量；2、所選用的微生物菌種之間具有良好的協(xié)同促生作用，能保證復(fù)合微生物菌劑的活菌數(shù)和穩(wěn)定性，提高抗病防效能力；3、所選用的微生物菌種均對(duì)枯萎病原菌(半知菌鐮孢霉真菌)具有高效拮抗作用，可有效防治枯萎病，使發(fā)病率低于10% ；4、所選用的生化黃腐酸(BFA)具有分子量小、活性基團(tuán)高的特點(diǎn)，能模擬自然界腐植酸形成的環(huán)境，將多種微生物接種到作物生長(zhǎng)環(huán)境，具有改良土壤、提高地溫、促使根系發(fā)達(dá)、有效調(diào)節(jié)土壤酸堿度、解決土壤板結(jié)等方面的功效；在氣候干燥情況下，有縮小作物氣孔開張度的作用；5.本發(fā)明生物防治劑可以完全替代化學(xué)藥劑，使用時(shí)無污染、無殘留、無生態(tài)毒性，使作物增產(chǎn)15%以上。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案及使用效果作進(jìn)一步說明。實(shí)例中所采用的菌種分別購自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)和廣東微生物菌種保藏管理中心(GM)，菌種編號(hào)為產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌(ACCC-30169)，黑曲霉菌(ACCC-30132)，枯草芽孢桿菌(ACCC-04269)，膠質(zhì)芽孢桿菌(GM-16)。各菌種懸液按常規(guī)制備方法獲得，使產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液中活菌數(shù)> 108cfu/mL，黑曲霉菌菌懸液中活菌數(shù)> IO8Cfu/mL，枯草芽孢桿菌菌懸液中活菌數(shù)彡101(lCfu/mL，膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液中活菌數(shù)彡IO10Cfu/mL。生化黃腐酸液為鄭州市潤(rùn)達(dá)化工有限公司生產(chǎn)。
實(shí)施例I、按體積比，將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液10%、黑曲霉菌菌懸液10%、枯草芽孢桿菌菌懸液8 %、膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液10 %，生化黃腐酸液62 %，混合均勻，得到生物防治劑。以西瓜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行浸種和灌根試驗(yàn)將該生物防治劑加水稀釋100倍，將西瓜種子用生防制劑稀釋液浸泡5小時(shí)，種植。將該生物防治劑按每畝5升的用量，加水稀釋100倍，在西瓜生長(zhǎng)的抽蔓期和果實(shí)生長(zhǎng)旺盛期，分兩次澆灌于植株根部。效果采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組的西瓜枯萎病發(fā)病率為5%，化學(xué)防治組的發(fā)病率為10%，未防治對(duì)照組的發(fā)病率為20% ;實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的西瓜增產(chǎn)21%。實(shí)施例2、按體積比，將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液15 %、黑曲霉菌菌懸液8 %、枯草芽孢桿菌菌懸液10%、膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液12%，生化黃腐酸液55%，混合均勻，得到生物防治劑。以番茄為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行浸種和噴灑試驗(yàn)將該生物防治劑加水稀釋200倍，浸泡番茄種子8小時(shí)，種植。在番茄生長(zhǎng)膨大期，將該生物防治劑按每畝I升的用量，加水稀釋20倍，噴灑于葉面、葉背、果實(shí)及幼莖；噴灑2次，間隔I周。效果采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組的番茄枯萎病發(fā)病率為8 %，化學(xué)防治組的發(fā)病率為15%，未防治對(duì)照組的發(fā)病率為22% ;實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的番茄增產(chǎn)16%。實(shí)施例3、 按體積比，將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液20 %、黑曲霉菌菌懸液5 %、枯草芽孢桿菌菌懸液15%、膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液8%，生化黃腐酸液52%，混合均勻，得到生物防治劑。以黃瓜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行浸種、灌根和噴灑試驗(yàn)將該生物防治劑加水稀釋150倍，浸泡黃瓜種子10小時(shí)，種植。在黃瓜生長(zhǎng)定殖期，將該生物防治劑按每畝2升的用量，加水稀釋200倍，澆灌于植株根部；在黃瓜生長(zhǎng)蹲苗期，將該生物防治劑按每畝3升的用量，加水稀釋200倍，澆灌于植株根部。在黃瓜結(jié)果盛瓜期，將該生物防治劑按每畝2升的用量，加水稀釋40倍，噴灑于葉面、葉背、果實(shí)及幼莖；共噴灑3次，每次間隔I周。
效果采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組的黃瓜枯萎病發(fā)病率為5 %，化學(xué)防治組的發(fā)病率為14%，未防治對(duì)照組的發(fā)病率為35% ;實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的黃瓜增產(chǎn)28%。實(shí)施例4、按體積比，將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液18 %、黑曲霉菌菌懸液I %、枯草芽孢桿菌菌懸液12%、膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液10%，生化黃腐酸液53%，混合均勻，得到生物防治劑。以甜瓜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行浸種、灌根和噴灑試驗(yàn)將該生物防治劑加水稀釋150倍，浸泡甜瓜種子8小時(shí)，種植。將該生物防治劑按每畝5升的用量，加水稀釋200倍，在甜瓜生長(zhǎng)的幼苗期和生蔓期，分兩次澆灌于植株根部。在甜瓜結(jié)果膨大期，將該生物防治劑按每畝I. 5升的用量，加水稀釋60倍，分別在結(jié)果前期和中期間隔I周各噴灑I次，噴灑于葉面、葉背、果實(shí)及幼莖。
效果采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組的甜瓜枯萎病發(fā)病率為7%，化學(xué)防治組的發(fā)病率為12%，未防治對(duì)照組的發(fā)病率為22% ;實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的甜瓜增產(chǎn)18%。
權(quán)利要求
1.ー種用于枯萎病的生物防治劑，其特征在于，是以生化黃腐酸液為基液，內(nèi)含有產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌≤lX107cfu/mL ;黑曲霉菌彡O. 5X107cfu/mL ;枯草芽孢桿菌≤ O. 8X109cfu/mL ;膠質(zhì)芽孢桿菌≤ O. 8X 109cfu/mLo
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物防治劑，其特征在于，是以生化黃腐酸液為基液，按體積比加入其余組分產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液10% 20%;黑曲霉菌菌懸液5% 10%;枯草芽孢桿菌菌懸液8% 15% ;膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液8% 12% ;其中，產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌菌懸液的活菌數(shù)> 108cfu/mL，黑曲霉菌菌懸液的活菌數(shù)> 108cfu/mL，枯草芽孢桿菌菌懸液的活菌數(shù)≥101(lcfu/mL，膠質(zhì)芽孢桿菌菌懸液的活菌數(shù)≤101(lCfu/mL。
3.制備權(quán)利要求2所述用于枯萎病的生物防治劑的方法，其特征在于，是將產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌按常規(guī)方法分別擴(kuò)大培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液按10% 15%的體積量接種入發(fā)酵罐分別進(jìn)行液體培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 35°C,培養(yǎng)時(shí)間24 72h，分別獲得四種菌懸液；將得到的四種菌懸液按配比混合于生化黃腐酸液，攪拌均勻即可。
4.按照權(quán)利要求I所述的用于枯萎病生物防治劑的使用方法，包括三種方式 種植前浸種將所述的生物防治劑加水稀釋100 200倍，浸泡種子5 10小時(shí)；種植時(shí)灌根將所述的生物防治劑加水稀釋100 300倍，按每畝4 5升生物防治劑的用量，澆灌于植株根部；植株噴灑在結(jié)果和果實(shí)膨大期，將所述的生物防治劑按每畝I 2升的用量，過濾后加水稀釋20 60倍，噴灑于葉面、葉背、果實(shí)及幼莖； 以上三種方式在種植過程中允許單ー使用或是組合使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于枯萎病的生物防治劑及其制備和使用方法，其是以生化黃腐酸液為基液內(nèi)含有產(chǎn)纖維素酶綠色木霉菌≥1×107cfu/mL；黑曲霉菌≥0.5×107cfu/mL；枯草芽孢桿菌≥0.8×109cfu/mL；膠質(zhì)芽孢桿菌≥0.8×109cfu/mL；所制備的生物防治劑對(duì)病原菌有拮抗作用，能提高防病能力；其施用具有活化土壤營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)、誘導(dǎo)提高抗病性的作用，從而提高作物枯萎病的防治效果，使發(fā)病率低于10％。本發(fā)明生物防治劑可以完全替代化學(xué)藥劑，使用時(shí)無污染、無殘留、無生態(tài)毒性，使作物增產(chǎn)15％以上；適用于黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆瓜、絲瓜等葫蘆科作物，以及番茄、茄子等茄科作物的枯萎病防治。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102726454SQ20121024575
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者任平, 張強(qiáng), 徐升運(yùn), 秦濤, 趙文娟, 陳五嶺, 馬齊 申請(qǐng)人:陜西省科學(xué)院酶工程研究所