專利名稱：云南杜鵑高效再生體系的建立方法
云南杜鵑高效再生體系的建立方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于杜鵑花生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，可用于云南杜鵑基因工程和無(wú)性突變系篩選。
背景技術(shù)：
云南杜醇(Rhododendron為杜醇花科,杜醇屬灌木或小喬木,主要分布于云南(西、西北、北、東北部)、陜西南部、四川西部、貴州西北、西藏東南部，境外緬甸東北部也有分布。生于山坡雜木林、灌叢、松林、松-櫟林、云杉或冷杉林緣，海撥1600米一 4000 米。
本發(fā)明人于2008年開始從云南的中甸、大理、師宗、梁王山引種云南杜鵑至云南省農(nóng)科院花卉所資源圃(昆明)，發(fā)現(xiàn)云南杜鵑是杜鵑花基因工程育種理想的基因表達(dá)受體材料，因云南杜鵑植株移栽易于成活，次年即可開花，播種實(shí)生苗3年后也可開花，可見云南杜鵑抗逆性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和比較廣的適應(yīng)范圍。
植物遺傳轉(zhuǎn)化即轉(zhuǎn)基因技術(shù)是近四十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物技術(shù)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在保持木本植物原有較好遺傳背景的前提下定向改變某些性狀，同時(shí)還能大大縮短育種時(shí)間，這為克服木本植物傳統(tǒng)育種局限性，加速木本植物遺傳育種進(jìn)展提供了便利。 目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為木本植物遺傳育種的主要研究領(lǐng)域。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)極大的依賴于體外培養(yǎng)物能夠高效穩(wěn)定再生成完整植株的技術(shù)，建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因育種的基礎(chǔ)。而木本植物組織培養(yǎng)和植株再生的難度較大。如缺乏合適的轉(zhuǎn)化受體材料，難以建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。其次是基因型依賴性較強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率不高。因此， 系統(tǒng)深入研究影響云南杜鵑植株再生因子、誘導(dǎo)植株再生的方法并獲得再生植株，建立專門針對(duì)云南杜鵑的高效穩(wěn)定的再生體系，具有重要意義，可為云南杜鵑轉(zhuǎn)基因育種工作提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)將有效推進(jìn)杜鵑花生物技術(shù)育種進(jìn)程。云南杜鵑的再生體系研究至今未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種專門針對(duì)云南杜鵑的高效再生體系的建立方法。
本發(fā)明所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，包括以下步驟(1)無(wú)菌苗的獲得取側(cè)芽飽滿的云南杜鵑半木質(zhì)化莖段，剪成帶有I 2個(gè)側(cè)芽的莖段，用洗衣粉水清洗，之后清水漂洗干凈，在無(wú)菌條件下依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 12%的升汞溶液浸泡15min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，無(wú)菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，待不定芽長(zhǎng)至2 3cm時(shí)切下不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值為5. 4 ;所述的增殖培養(yǎng)基為WPM + ZT 2 mg/L, pH值為5. 4 ；(2)再生體系的建立①葉片直接再生不定芽將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無(wú)菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于葉盤分化培養(yǎng)基A中或葉盤分化培養(yǎng)基B 中，葉盤分化培養(yǎng)基A為WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4，葉盤分化培養(yǎng)基B為WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4 ；或②葉片間接再生不定芽A.將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無(wú)菌苗的中上部葉片，切成約O.5cm2 O. 8cm2 的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+ 蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ；B.將步驟(2)②A中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基為WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4 ；(3)壯苗培養(yǎng)將步驟(2)①葉片直接再生不定芽培養(yǎng)出的不定芽或?qū)?2)②葉片間接再生不定芽培養(yǎng)出的不定芽分棵切開或切成3-5棵為一叢放入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 25天，所述的壯苗培養(yǎng)基為=WPM+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ;(4)生根培養(yǎng)將經(jīng)步驟(3)壯苗培養(yǎng)的苗分棵切開，接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4 ；以上各步驟培養(yǎng)條件均為溫度為23°C士 2°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為I 2 h · cT1，各培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂含量的百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
步驟(2)①優(yōu)選的葉盤分化培養(yǎng)基B為WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂 O. 6%，pH 值為 5.4。
步驟(2)②A優(yōu)選的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+TDZ O. 5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
步驟(4)優(yōu)選的生根培養(yǎng)為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4。
本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明首次針對(duì)云南杜鵑葉片誘導(dǎo)植株再生進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，采用葉片直接誘導(dǎo)或間接誘導(dǎo)植株再生兩條途徑，以及特定的培養(yǎng)基，使葉片直接誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率可達(dá)62 73%，每個(gè)葉盤上的平均芽數(shù)可達(dá)6. 93個(gè)，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)62 100%， 愈傷組織疏松、體積大，質(zhì)量好，愈傷組織分化成不定芽的分化率在70%以上，葉片直接誘導(dǎo)或間接誘導(dǎo)的不定芽的生根率均達(dá)69 89%，圖I-圖9也表明，本發(fā)明方法所建立的云南杜鵑高效再生體系能使云南杜鵑葉片在葉片直接再生不定芽或葉片間接再生不定芽，不定芽的壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)均生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，培養(yǎng)的植株健壯、根系發(fā)達(dá)，表明本發(fā)明方法建立了能高頻率產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，并能高頻率生根獲得完整植株的云南杜鵑再生體系。表明本發(fā)明方法建立云南杜鵑高效再生體系是切實(shí)可行和有效的。
2、葉盤和愈傷組織兩種材料是進(jìn)行目的基因浸染的常用材料，本發(fā)明能高效地誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織，為云南杜鵑后續(xù)的轉(zhuǎn)基因育種工作，實(shí)現(xiàn)高頻轉(zhuǎn)化提供了良好的再生體系及其建立的方法。


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圖I是云南杜鵑葉盤直接誘導(dǎo)不定芽過程中誘導(dǎo)出的不定芽點(diǎn)。2是云南杜鵑葉盤直接誘導(dǎo)不定芽過程中不定芽點(diǎn)長(zhǎng)成不定芽。3是云南杜鵑葉盤間接誘導(dǎo)不定芽過程中誘導(dǎo)出愈傷組織。4是云南杜鵑葉盤間接誘導(dǎo)不定芽過程中愈傷組織增殖。5是云南杜鵑葉盤間接誘導(dǎo)不定芽過程中愈傷組織分化不定芽。6是云南杜鵑葉盤間接誘導(dǎo)不定芽過程中愈傷組織分化的不定芽長(zhǎng)大。 7是云南杜鵑壯苗培養(yǎng)的生長(zhǎng)表現(xiàn)。8是云南杜鵑生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)表現(xiàn)。9是云南杜鵑生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)表現(xiàn)。
具體實(shí)施方式
以下各實(shí)施例所用的材料及試劑均為市售，各實(shí)施例無(wú)特殊說明均為常規(guī)方法。
本發(fā)明提供的一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，具體實(shí)施步驟如下I、無(wú)菌苗的獲得取側(cè)芽飽滿的云南杜鵑半木質(zhì)化莖段，剪成帶I 2個(gè)側(cè)芽的小段，洗衣粉水振蕩清洗之后用清水漂洗干凈，無(wú)菌條件下消毒，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 12%的升汞溶液浸泡15min， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，其間不斷搖晃，之后無(wú)菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于MS + 6-BA (6-芐基腺嘌呤)lmg/L+ NAA (萘乙酸)0·1 1^/1^!1值為5.4 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，20d后待不定芽長(zhǎng)至2 3cm時(shí)切下不定芽轉(zhuǎn)入WPM + ZT 2 mg/L, pH值為5. 4的增殖培養(yǎng)基上獲得無(wú)菌苗，用于再生體系建立的材料為28 32天苗齡的無(wú)菌苗的中上部葉片。
2、再生體系的建立(I)葉片直接再生不定芽將步驟I中30天苗齡的無(wú)菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤葉背面劃“井”字傷口，葉盤背面朝下接種于表I所列的激素組合的各葉盤分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于包括以下步驟 (1)無(wú)菌苗的獲得 取側(cè)芽飽滿的云南杜鵑半木質(zhì)化莖段，剪成帶有I 2個(gè)側(cè)芽的莖段，用洗衣粉水清洗之后，清水漂洗干凈，在無(wú)菌條件下依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 12%的升汞溶液浸泡15min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，無(wú)菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，待不定芽長(zhǎng)至2 3cm時(shí)切下不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值為5. 4 ;所述的增殖培養(yǎng)基為WPM + ZT 2 mg/L，pH 值為 5. 4 ； (2)再生體系的建立 ①葉片直接再生不定芽 將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無(wú)菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于葉盤分化培養(yǎng)基A中或葉盤分化培養(yǎng)基B中，葉盤分化培養(yǎng)基A為WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5. 4，葉盤分化培養(yǎng)基B為WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5.4 ； 或②葉片間接再生不定芽 A.將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無(wú)菌苗的中上部葉片，切成約O.5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ； B.將步驟(2)②A中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基為WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5.4 ； (3)壯苗培養(yǎng) 將步驟(2)①葉片直接再生不定芽培養(yǎng)出的不定芽或?qū)?2)②葉片間接再生不定芽培養(yǎng)出的不定芽分棵切開或切成3-5棵為一叢放入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 25天，所述的壯苗培養(yǎng)基為=WPM+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ; (4)生根培養(yǎng) 將經(jīng)步驟(3)壯苗培養(yǎng)的苗分棵切開，接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的生根培養(yǎng)基為:1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4 ； 以上各步驟培養(yǎng)條件均為溫度為23 °C 士 2 °C，光照強(qiáng)度為2000 lx，光照時(shí)間12h · cT1，各培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂含量的百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(2)①所述的葉盤分化培養(yǎng)基B為WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(2)②A所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+TDZ 0.5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養(yǎng)為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養(yǎng)為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
全文摘要
本發(fā)明為一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，屬于植物生物技術(shù)育種領(lǐng)域。該方法以云南杜鵑無(wú)菌苗的中上部葉片為材料，在WPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，主要配有激素TDZ、ZT、2,4-D、NAA、IAA、水解酪蛋白中一種或幾種及適宜的濃度，通過葉片直接再生和間接再生兩條途徑獲得完整植株。本發(fā)明首次對(duì)云南杜鵑建立了高效再生體系，為云南杜鵑的基因工程育種工作提供了良好的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)將有效推動(dòng)杜鵑花生物技術(shù)育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102919125SQ20121045010
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者彭綠春, 解瑋佳, 張藝萍, 瞿素萍, 李世峰, 蘇艷, 宋杰 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所