專(zhuān)利名稱：一種增強(qiáng)嫁接植物病毒抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用，特別是一種使番茄接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
植物病毒是導(dǎo)致果樹(shù)、蔬菜、花卉等園藝植物產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣的重要原因， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類(lèi)病害，由于防治困難，素有“植物癌癥” 之稱。目前植物病毒常用的防治措施有消滅病毒源和傳統(tǒng)媒介、應(yīng)用脫毒技術(shù)、藥劑防治與選育抗病品種等，其中選育抗病品種是防治病毒病害最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)的植物抗病技術(shù)因其高效性、特異性等特點(diǎn)，在植物抗病毒育種上展現(xiàn)了可觀的前旦-5^ O
基因沉默或稱RNA干擾(RNA interference ；RNAi)是指由于轉(zhuǎn)基因序列或外侵病毒與被沉默的內(nèi)源或外源基因序列具有高度的同源性，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)結(jié)構(gòu)，從而特異性地降解同源祀基因mRNA,使之發(fā)生沉默(Fire A. , Xu S. , Montgomery Μ. Κ. , et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 1998，391(6669) :806-811)。由于其干擾作用是發(fā)生在靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平，因此，也成轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物RNAi 具有特異性、高效性、系統(tǒng)性以及可遺傳性等特點(diǎn)。可利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因功能研究；或直接利用RNAi 創(chuàng)造的特殊性狀變異體進(jìn)行植物改良。其中RNAi技術(shù)在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸( 如病毒)入侵的防御機(jī)制，同時(shí)現(xiàn)有研究進(jìn)一步表明病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)是由于誘導(dǎo)病毒(弱株系)所產(chǎn)生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒(強(qiáng)株系)的結(jié)果(Frank G. R. , Stuart A. M. and David C. B. Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J]. Plant Cell, 1999，11: 1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是選擇一段植物病毒基因的序列，以反向重復(fù)序列的方式構(gòu)建成轉(zhuǎn)錄后含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA(hairpin RNA,hpRNA) 或含內(nèi)含子的ihpRNA (intron-hairpin RNA)表達(dá)載體,通過(guò)基因槍、病毒載體轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化整合到植物基因上，體內(nèi)表達(dá)dsRNA，直接或間接誘導(dǎo)RNAi的產(chǎn)生，起到抵抗病毒的目的。而在發(fā)夾結(jié)構(gòu)研究中，認(rèn)為ihpRNA表達(dá)載體比hpRNA表達(dá)載體沉默效率高(Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants [J]. Methods, 2003, 30 (4) :289-295)。
園藝植物種類(lèi)與品種繁多，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)繁殖途徑繁衍的園藝植物后代普遍經(jīng)受著病毒的威脅。目前生產(chǎn)中栽培的眾多蔬菜，水果和花卉均有幾十到上百個(gè)品種，幾乎每個(gè)品種都有數(shù)種到數(shù)十種病毒病害，病毒病抑制了植物的生長(zhǎng)、結(jié)果，降低了果品的產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至引起死樹(shù)，植物一旦被病毒侵染，將終生帶毒持久受害。利用基因工程技術(shù)針對(duì)每一個(gè)品種進(jìn)行改良，提高其抗病毒的能力，雖可行但需花費(fèi)大量的人力與財(cái)力。嫁接是許多園藝植物繁殖的方法之一，絕大多數(shù)的果樹(shù)和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品種的優(yōu)良性狀，又能利用砧木的有利特性。在應(yīng)用嫁接繁殖時(shí)，一般同一種類(lèi)中的不同品種采用同一砧木，甚至有些同屬中的不同種類(lèi)也采用同一砧木。這樣一砧多用的情況，使得改良砧木品種比單獨(dú)改良接穗品種要高效的多。
所謂植物系統(tǒng)性基因沉默是指dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信號(hào)既可以通過(guò)胞間連絲進(jìn)行的短距離傳遞，也可以通過(guò)植物中的維管系統(tǒng)長(zhǎng)距離傳遞(BiOsnan C. A. , Mitter N. , Christie M. , et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(37):14741-14746)，(Kalantidis K. , Schumacher H. T. , Alexiadis T., et al. RNA silencing movement in plants[J]. Biol Cell, 2008, 100 (I):13-26), 并誘導(dǎo)整個(gè)植物產(chǎn)生系統(tǒng)沉默。Daniel H.等(Daniel H. C，F(xiàn)abio T. S. , Miya D. Η, et al. Pattern formation via small RNA mobility [J]. Genes & Dev, 2009, 23: 549-554)研究表明小分子RNA可以作為一種移動(dòng)的信號(hào)分子參與植物發(fā)育的調(diào)控。關(guān)于沉默信號(hào)在植物中的傳遞方向存在著不同的報(bào)道。Palauqui等(Palauqui J. C.，Elmayan T. , Pollien J.M. , et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J], EMBO J, 1997，16 (15) :4738-4745.)以煙草為試材，發(fā)現(xiàn) PTGS的傳導(dǎo)是單方向的，即只能從沉默的站木傳向非沉默的接穗；而Sonoda等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21(1) :1-8)研究表明，PTGS的傳導(dǎo)是雙方向的，從砧木到接穗或從接穗到砧木都可傳導(dǎo)， 但是PTGS從接穗到砧木的傳導(dǎo)效率明顯低于從砧木到接穗的傳導(dǎo)。李明等(李 明，姜世玲，王幼群，等.轉(zhuǎn)錄后沉默信號(hào)可以在擬南芥嫁接體內(nèi)快速雙向傳遞[J].科學(xué)通報(bào)，2006，51 (2) : 142-147)的結(jié)果表明，無(wú)論用RNAi型植株作為砧木或接穗，基因沉默信號(hào)均能導(dǎo)致相應(yīng)野生型接穗或砧木中靶基因mRNA的減少，說(shuō)明基因轉(zhuǎn)錄后沉默信號(hào)可以通過(guò)嫁接面在擬南芥體內(nèi)雙向傳遞。但miRNA(micro RNA)或amiRNA (artificial mi RNA) 還未發(fā)現(xiàn)能在嫁接體間傳遞，據(jù)此，本發(fā)明人推測(cè)系統(tǒng)性基因沉默方向可能與物種或檢測(cè)水平或方法有關(guān)，但可以肯定以轉(zhuǎn)基因方式獲得超表達(dá)的siRNA相關(guān)的沉默信號(hào)能從砧木向上傳遞給接穗。
植物中，關(guān)于系統(tǒng)性基因沉默的最初線索來(lái)自煙草嫁接試驗(yàn)。1997年P(guān)alauqui 等(Palauqui J. C., Elmayan T. , Pollien J.M., et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J]. EMBO J, 1997, 16(15) :4738-4745)把一個(gè)芽嫁接到另一植株上時(shí)，先將該植株的硝酸鹽還原酶基因沉默，嫁接的幼芽上該基因也沉默。在幼芽中被沉默的基因與砧木中被沉默的基因相同，具有序列特異性。Sonoda 等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21 (I) : 1-8)的研究也得出了相似的的結(jié)論,并同時(shí)證明經(jīng)嫁接后，接穗所獲得的PTGS即使在沉默的砧木不存在時(shí)也能保持。
近年來(lái)，圍繞轉(zhuǎn)基因生物育種，我國(guó)在轉(zhuǎn)基因生物安全管理和安全性評(píng)價(jià)研究方面實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際接軌，并取得了令人矚目的進(jìn)展。但有關(guān)基因工程中所涉及的抗性選擇性標(biāo)記基因?qū)κ称钒踩缘挠绊?，部分人一直存有疑慮，而本項(xiàng)目研究巧妙的避開(kāi)了這一議題，因?yàn)榻铀胨@得的系統(tǒng)性抗性，來(lái)源于砧木中的小分子RNA的沉默效應(yīng)，因此理論上， 嫁接轉(zhuǎn)基因沉默植株接穗品種中將不含抗性標(biāo)記。為了提高接穗品種抗目標(biāo)病毒的能力， 若只需通過(guò)改良砧木，嫁接后達(dá)到增強(qiáng)接穗品種抗該目標(biāo)病毒的目的，這將為園藝嫁接植物的品種改良開(kāi)辟一條嶄新的途徑。但到目前為止，通過(guò)嫁接方式使接穗品種獲得基因沉默效應(yīng)的研究中，靶標(biāo)基因都為植物自身的一些基因，未見(jiàn)到以致病菌或病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的研究報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白及需求，提供一種使番茄植株獲得抵御病毒能力的方法，以及該方法涉及到RNA干擾載體，改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因方法等，該方法獲得的抗病毒植株能夠有效規(guī)避轉(zhuǎn)基因食品的安全隱患，且能夠大大提高了獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因品種的效率。
一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法，其步驟如下(1)制備抗病毒的轉(zhuǎn)基因砧木；(2)使接穗嫁接到所述轉(zhuǎn)基因砧木上生長(zhǎng)發(fā)育； 其特征在于所述抗病毒的轉(zhuǎn)基因砧木為轉(zhuǎn)入RNA干擾載體而獲得，所述RNA干擾載體的靶標(biāo)序列為目標(biāo)病毒基因組內(nèi)的基因片段。
所述目標(biāo)病毒指黃瓜花葉病毒CMV，所述接穗品種和轉(zhuǎn)基因砧木都為番茄品種， 所述RNA干擾載體的靶標(biāo)序列如Seq ID No.1, 2，3,4, 5或6所示。
所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、 PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
所述制備抗病毒的轉(zhuǎn)基因砧木，轉(zhuǎn)基因包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預(yù)培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于所述番茄的種子播種前經(jīng)無(wú)菌水浸潤(rùn)51小時(shí)；20%次氯酸鈉滅菌10 min,無(wú)菌水洗5 次，每次5min ； 30°C培養(yǎng)箱催芽?jī)商?；所述切子葉預(yù)培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根癌農(nóng)桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉(zhuǎn)接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點(diǎn)；將帶芽點(diǎn)的外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Cl中pH 6. O,Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美汀中培養(yǎng)l(Tl4d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C3中pH 6. O，Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L 特美??；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。
一種以黃瓜花葉病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的的RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體的革巴標(biāo)序列如Seq ID No.1, 2，3，4，5或6所示。
所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、 PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
轉(zhuǎn)化有上述RNA干擾載體的菌株或植物細(xì)胞。
所述菌株指根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。
所述植物細(xì)胞指轉(zhuǎn)基因番茄砧木的外植體前體細(xì)胞。
一種制備轉(zhuǎn)基因番茄砧木的方法，包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預(yù)培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于所述番茄的種子播種前經(jīng)無(wú)菌水浸潤(rùn)51小時(shí)；20%次氯酸鈉滅菌10 min,無(wú)菌水洗5 次，每次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽 兩天；所述切子葉預(yù)培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根癌農(nóng)桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉(zhuǎn)接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點(diǎn)；將帶芽點(diǎn)的外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Cl中pH 6. O,Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美汀中培養(yǎng) l(Tl4d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C3中pH 6. 0，Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L 特美?。凰錾囵B(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。
本發(fā)明目的在于，通過(guò)系統(tǒng)性基因沉默與嫁接技術(shù)的結(jié)合，先使砧木獲得對(duì)入侵病毒的抗性，然后砧木將其病毒抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)至接穗中使嫁接于該砧木上的接穗品種獲得病毒抗性。本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的思路是構(gòu)建的用于轉(zhuǎn)化砧木的RNA干擾載體的基因沉默對(duì)象是入侵病毒的基因，而非植物本身的基因。
本發(fā)明中以番茄為砧木和接穗試材，以寄主較為廣泛的黃瓜花葉病毒CMV為靶標(biāo)病毒進(jìn)行具體試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，接穗番茄獲得了良好的CMV病毒抗性?；诒景l(fā)明的構(gòu)思，說(shuō)明書(shū)中記載的實(shí)驗(yàn)方法的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明的方法應(yīng)用到很多種易于受病毒侵染的并且可以嫁接的植物中，這種應(yīng)用都在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍內(nèi)。即，本發(fā)明的方法不限于應(yīng)用到具體實(shí)施例中記載的番茄上。
本發(fā)明以番爺為試材，以黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus; CMV)為祀標(biāo)對(duì)象，驗(yàn)證本發(fā)明的構(gòu)思。即通過(guò)分別選擇CMV 5個(gè)基因OPF片段以及I個(gè)融合了 5個(gè)基因片段的共6個(gè)ihpRNA植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄，使轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生siRNA，接種CMV篩選出高抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。之后以抗性植株的TO或Tl代為砧木，嫁接未轉(zhuǎn)基因的番茄，砧木中的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗中，以增強(qiáng)接穗對(duì)CMV的抗性。目前，在栽培番茄品種中還未發(fā)現(xiàn)有對(duì)CMV病毒的抗性基因，且栽培番茄品種也僅存在耐病性品種，利用常規(guī)雜交方法難以獲得CMV抗性番茄品種。因此通過(guò)RNA干擾轉(zhuǎn)基因的方法，是快速獲得CMV 抗性材料的有效途徑。近年來(lái)，圍繞轉(zhuǎn)基因生物育種，我國(guó)在轉(zhuǎn)基因生物安全管理和安全性評(píng)價(jià)研究方面實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際接軌，并取得了令人矚目的進(jìn)展。但有關(guān)基因工程中所涉及的抗性選擇性標(biāo)記基因?qū)κ称钒踩缘挠绊懀糠秩艘恢贝嬗幸蓱]。而本發(fā)明巧妙的避開(kāi)了這一議題，因?yàn)榻铀胨@得的系統(tǒng)性抗性，來(lái)源于砧木中的小分子RNA的沉默效應(yīng)。因此理論上，嫁接轉(zhuǎn)基因沉默植株接穗品種基因組以及所產(chǎn)生的雌/雄配子中將不含抗性標(biāo)記基因，防止了抗生素抗性基因的漂移。
本發(fā)明包括以下步驟a.針對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV)5個(gè)基因，通過(guò)比對(duì)番茄EST數(shù)據(jù)庫(kù)，選取CMV5個(gè)基因ORF 區(qū)間的片段，通過(guò)PCR和重疊PCR構(gòu)建5個(gè)含CMV特異基因片段和I個(gè)融合了 5個(gè)基因片段的ihpRNA植物沉默表達(dá)載體；b.利用改良后的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄植株，檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，扦插繁殖轉(zhuǎn)基因植株(T0代)；c.通過(guò)接種CMV病毒，比較不同載體轉(zhuǎn)基因株系的CMV抗性，篩選出高抗病毒的轉(zhuǎn)基因株系；d.利用抗性扦插苗(T0代)或Tl代植株為砧木，嫁接野生型植株(未轉(zhuǎn)基因植株)，接種 CMV病毒，檢測(cè)獲得病毒抗性的嫁接植株；e.提取砧木與接穗總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，RT-PCR檢測(cè)抗生素抗性基因的表達(dá)。


圖1 :黃瓜花葉病毒(CMV)基因組結(jié)構(gòu)特征圖2 :本發(fā)明采用的載體構(gòu)建方案圖3 :5個(gè)含CMV基因特異片段載體的構(gòu)建 M2K/15K=Marker 2K/15K ；A.:用Pstl/Sall酶切驗(yàn)證克隆載體pUCCRNA1-lA CP，所切出小片段為構(gòu)建入克隆載體的反向重復(fù)序列；B.將從pUCCRNA1-lA CP酶切后的反向重復(fù)序列，構(gòu)建入表達(dá)載體得到 PCAMBIA2300-1A CP 載體；C.Γ3 PstI/SalI酶切驗(yàn)證表達(dá)載體pCAMBIA2300_lA CP，所切出小片段為構(gòu)建入克隆載體的反向重復(fù)序列。
圖4 :含5個(gè)CMV基因片段融合載體的構(gòu)建A.1 =Marker為2K，分別利用R1AF/R1AR和R2AF/R2AR引物擴(kuò)增片段IAF和2AF ；A.2 :利用RlAF/ R2AR引物，以IAF和2AF混合物為模板，擴(kuò)增融合片段1A+2A ；B.1 :分別利用R2BF/R RCPF/R引物擴(kuò)增片段2BF、3AF和CPF ；B.2 :利用R2BF/RCPR引物，以2BF、3AF和CPF混合物為模板，擴(kuò)增融合片段2B+3A+CP ；C.:CMV5為利用RlA F/ RCP R引物，以1A+2A和2B+3A+CP混合物為模板，擴(kuò)增融合片段CMV5 ；D.PstI, Pstl/Sall 酶切檢測(cè) pCAMBIA2300-CMV5 載體。
圖5 :本發(fā)明采用的改進(jìn)后的番茄轉(zhuǎn)基因步驟圖6 :轉(zhuǎn)基因番茄的PCR檢測(cè)(部分株系分批檢測(cè))M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒 pCAMBIA2300_lA 為模板；CK :未轉(zhuǎn)基因番茄 MoneyMaker 為模 IA CMV5-1、表示以ActinlPF/IntornR為引物，不同靶標(biāo)載體對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系為模板擴(kuò)增的條帶圖7 :轉(zhuǎn)基因番爺部分株系的Southern雜交檢測(cè)M =Marker 15K ;+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板(未酶切完全);CK :未轉(zhuǎn)基因番茄 MoneyMaker為模板；T01A CMV5. Γ2 :表示不同靶標(biāo)載體對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系Southern雜交條帶圖8 :轉(zhuǎn)基因番茄植株的RT-PCR檢測(cè)M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板；CK :未轉(zhuǎn)基因番茄MoneyMaker為模板； TOlA CMV5. Γ2 :表示分別以IAF CPF和RlAF (T0CMV5)為上游引物，IntronR為下游引物， 擴(kuò)增不同靶標(biāo)載體對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系的條帶圖9 :轉(zhuǎn)基因番茄的扦插繁殖與CMV攻毒篩選抗病毒TO代株系 CK :為未轉(zhuǎn)基因番茄植株MoneyMaker ；TOIA^CP. Γ2和T0CMV5. Γ5 :表示不同轉(zhuǎn)基因株系扦插苗，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性，圖中株系為篩選出的部分高抗株系圖10 :轉(zhuǎn)基因番茄Tl代的繁 殖與CMV攻毒篩選抗病毒Tl代株系 CK :為未轉(zhuǎn)基因番茄植株MoneyMaker ；T11A. 1 CMV5.1 :表示不同轉(zhuǎn)基因株系Tl代，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性圖11 :本發(fā)明采用的嫁接技術(shù)圖12 :嫁接后抗生素抗性基因NptII的RT-PCR檢測(cè)M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板；CK :未轉(zhuǎn)基因番茄MoneyMaker為模板； TOlA CMV5. Γ2 :表示以NptIIF/R為引物不同靶標(biāo)載體對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系為模板擴(kuò)增的PCR 條帶上圖表明接穗中無(wú)NptII基因的表達(dá)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.針對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV)基因，通過(guò)比對(duì)番茄EST數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建6個(gè) ihpRNA植物沉默表達(dá)載體；黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirs)成員。CMV為單鏈正義RNA病毒?；蚪M分為RNA1、RNA2和 RNA3，基因組大小分別為3389nt、3035nt和2197nt，分別包被于三顆病毒粒體之中，其中 RNA3含亞基因組RNA4，全長(zhǎng)1000 nt。RNAl編碼核酸復(fù)制酶；RNA2編碼兩個(gè)蛋白R(shí)NA依賴的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)和 2b 蛋白，RdRP 與病毒的侵染有關(guān)，2b蛋白類(lèi)似一種病毒運(yùn)動(dòng)蛋白，有實(shí)驗(yàn)證明2b蛋白能夠減弱RNA介導(dǎo)的病毒基因的沉默；RNA3編碼一種運(yùn)動(dòng)蛋白3A蛋白，其具體功能不詳?shù)c病毒細(xì)胞間的傳遞有關(guān)；RNA4 編碼病毒外殼蛋白CP蛋白。CMV基因組的具體特征如圖1。
本發(fā)明針對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV) 5個(gè)基因，通過(guò)比對(duì)番茄EST數(shù)據(jù)庫(kù)，選取CMV 5 個(gè)基因ORF區(qū)間的片段如(Seq ID No. 1、2、3、4、5所示)，通過(guò)PCR和重疊PCR構(gòu)建5個(gè)含 CMV特異基因片段和I個(gè)融合了 5個(gè)基因片段的ihpRNA植物沉默表達(dá)載體，具體步驟如下擴(kuò)增5個(gè)片段分別用到的引物，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)IAF :5’-ATTGTCGACTGGATGCGTCCTGTGC-3’IAR :5’-ATCGGATCCTTGGGCGGACTTCTTG-3’ ；2AF :5’- AATGTCGACTGTCCAACGCCAACC-3’2AR :5’-AGGGGATCCTTCGTTGTACCTACTC-3’2BF :5’-ATTGTCGACTGGCTCGTATGGTGGA-3’2BR :5’-GAGGGATCCGCGAACCAATCTGTAT-3’ ；3AF :5’-ATAGTCGACAGCCCTGAAGCCATTA-3，3AR :5，-AGAGGATCCAAAGACCCTTCAGCAT-3，；CPF :5’- ATTGTCGACCTTTGTAGGGAGTGA -3’ CPR :5’- ATCGGATCCTTTACGGACTGTCA-3’ ；擴(kuò)增融合片段用到的重疊PCR引物RlA F :5’-TATGTCGACTGTGCCCGAGGGTATTG-3’RlA R :5’-TCAGTAGCACGGTTTAAATTTACAGATCACGCATTCAC-3’R2A F :5’-GTGAATGCGTGATCTGTAAATTTAAACCGTGCTACTGA-3’R2A R :5’-TTCTTCGCCTCCACCATACGCTTGATGAAAAGAGTCGTCGT-3’R2B F :5’-ACGACGACTCTTTTCATCAAGCGTATGGTGGAGGCGAAGAA-3’R2B R :5’-TCCACTGATGCTGAAGGGTCTGATAGAACGGTAGGAAGCG-3’R3A F :5’-CGCTTCCTACCGTTCTATCAGACCCTTCAGCATCAGTGGA-3’R3A R :5’-CGAGTTAATCCTTTGCCGAACACGGTCGTATTGCTTCCTT-3’RCP F :5’-AAGGAAGCAATACGACCGTGTTCGGCAAAGGATTAACTCG-3，RCP R :5’-ATCGGATCCATCTATTACCCTAAAGCCAC-3’克隆載體檢測(cè)引物Ml3+ :5’- AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’Ml3- :5’- GTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3’表達(dá)載體檢測(cè)引物ActinlPF :5’-CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT-3’IntronR :5’-TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC-3’克隆載體pUCCRNAi，記載在(Luo, A. , Qian, Q. , Yin, H. et al. (2006) EUII, encoding a putative cytochrome P450 monooxygenase, regulates internode elongation by modulating gibberellin responses in rice. Plant Cell Physiol. 47， 181 - 191.)中，本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。
植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Actinl_ocs，記載在(Fang，J.，ChaijC·，Qianj Q.，Li，C.，Tang, J.，Sun，L，Huang, Z.，Guoj X.，Sun, C. and Liuj M. 2008.Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice. The Plant Journal. 2， 177-189)，本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。
本發(fā)明中利用pUCCRNAi中兩組同尾酶切位點(diǎn)Xhol/Sall和Bglll/BamHI，將選取并經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的CMV 5個(gè)基因ORF區(qū)間的片段如Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的片段的正、反向序列分別構(gòu)建到pUCCRNAi的兩組酶切位點(diǎn)中，即每個(gè)片段的正反向序列分別構(gòu)建到兩組酶切位點(diǎn)中得到具有反向重復(fù)序列的RNAi克隆載體pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP ;通過(guò)重疊PCR將Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的5個(gè)片段內(nèi)的部分片段連在一起得到Seq ID No. 6所示的片段，將Seq ID No. 6所示的片段的正、反向序列構(gòu)建到pUCCRNAi的兩組酶切位點(diǎn)中得到RNAi克隆載體pUCCRNA1-CMV5，引物為上面的重疊PCR引物。
將克隆載體pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5的反向重復(fù)區(qū)，用內(nèi)切酶Sall/PstI 酶切后連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-ACtinl-OCS中，載體構(gòu)建方案如圖2所示，得到具有ihpRNA的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5酶切，酶切驗(yàn)證如圖3，4 所示。測(cè)序結(jié)果也顯示所選的正反向序列的構(gòu)建位置正確。
將構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到大 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。操作如下步驟1. pUCCRNAi載體片段酶切與回收提取大腸桿菌中pUCCRNAi質(zhì)粒(質(zhì)粒DNA的小量提取試劑盒)。取5ul質(zhì)粒，利用XhoI 和BagII內(nèi)切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切過(guò)夜，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長(zhǎng)度的質(zhì)粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度?；厥掌螛?biāo)記為 XhoI/Bagll-pUCCRNAi。
步驟2. CMV基因PCR片段酶切與回收利用引物1AF/ITCPF/R，以含CMV全基因組的侵染性克隆載體上，通過(guò)如下PCR方法，分別獲得5個(gè)CMV基因片段，分別記錄為1A、2A、2B、3A和CP ;測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性；引物的稀釋將合成的引物直接加去離子水配制成終濃度為10umol/L。
PCR管中依次加以下成分 |50ul體系|25ul體系 10XPCRBufferwithMg2+' 5ul2. 5ul模板 DNA~2ul0.4-1ulIOmMdNTP (混合)_4ul2ulIOuM 引物 F/引物 R~2ulIulTaq 酶Iul0.5ulddH20補(bǔ)至 50ul 補(bǔ)至 25ul(2)混勻后,稍離心至管底,將PCR管放入PCR儀,蓋上熱蓋。擴(kuò)增前先預(yù)熱熱蓋。
(3)以下擴(kuò)增條件940C 3 min 預(yù)變性，94°C 30sec 變性；50_68°C 30sec 退火；72°C Imin 延伸(目的片段大于500 bp用I分鐘，小于500 bp用40秒)，35個(gè)循環(huán)，72°C 10 min，4°C保存分別純化回收PCR產(chǎn)物得5個(gè)CMV基因片段。各取20ul回收片段，利用SalI和BamHI 內(nèi)切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切6h，回收酶切產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)Seq ID No. Γ5所示序列長(zhǎng)度的質(zhì)粒片段。取Iul回收片段，進(jìn)行凝膠電泳判斷回收質(zhì)量。CMV回收片段標(biāo)記為SalI/ BamH1-lA,SalI/BamHI_2A、SalI/BamHI_2B、SalI/BamHI_3A、Sall/BamH1-CP。
步驟3. pUCCRNA1-lA CPF的連接與轉(zhuǎn)化大腸桿菌取 4ul XhoI/Bagll-pUCCRNAi 和 8ul Sall/BamH1-lA、 SalI/BamHI_2A、 Sail/ BamH1-2B, SalI/BamHI_3A、Sall/BamH1-CP 分別進(jìn)行接連
權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因番茄砧木的方法，包括如下步驟(O番爺播種，番爺?shù)姆N子播種前經(jīng)無(wú)菌水浸潤(rùn)5、小時(shí)后于培養(yǎng)箱中催芽；(2)切子葉預(yù)培養(yǎng)，在真葉未出現(xiàn)前，子葉剛冒出種皮且未完全展開(kāi)時(shí)，將子葉兩端切除l_2mm，再?gòu)闹虚g橫切一刀，每個(gè)子葉切成兩塊，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；(3)將根癌農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)過(guò)的葉盤(pán)外植體，進(jìn)行共培養(yǎng)；其中根癌農(nóng)桿菌含有對(duì)卡那霉素抗性基因標(biāo)記的載體；(4)將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C中，葉背朝上光照培養(yǎng)，待愈傷上芽點(diǎn)出現(xiàn)，將帶芽點(diǎn)外植體轉(zhuǎn)入Cl培養(yǎng)l(Tl4d，分化出芽；其中，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素；培養(yǎng)基Cl中pH 6. O, Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美?。?5)促分化培養(yǎng)，待再生芽長(zhǎng)出后切去白化外植體部分將抗性芽轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C3中pH 6. O,Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素 + 200 mg/L特美汀；(6)生根培養(yǎng)，待抗性芽莖部長(zhǎng)至Icm后，剔除愈傷組織，切下置入培養(yǎng)基D中生根培養(yǎng) 15 30d，培養(yǎng)基 D 為pH 6. O, Medium Base +2mg/L 吲哚丁酸 + 200mg/L 特美?。?7)田間培養(yǎng)移栽至大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中，種子用無(wú)菌水浸潤(rùn)后于30°C 培養(yǎng)箱催芽，待種子露白，點(diǎn)播于1/2MS培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)入26 28°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；步驟(2)中，預(yù)培養(yǎng)為弱光預(yù)培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，共培養(yǎng)的溫度為26°C，且為暗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種增強(qiáng)嫁接植物病毒抗性的方法，該方法包括(1)番茄播種，播種前經(jīng)無(wú)菌水浸潤(rùn)5~8小時(shí)后于培養(yǎng)箱中催芽；(2)切子葉預(yù)培養(yǎng)；(3)將根癌農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)過(guò)的葉盤(pán)外植體，進(jìn)行共培養(yǎng)；(4)將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C中分化出芽；(5)促分化培養(yǎng)；(6)生根培養(yǎng)；(7)田間培養(yǎng)。本發(fā)明方法可縮短出芽1周左右，且出芽整齊，分化效率高，可有效防止假陽(yáng)性，能有效促進(jìn)正常芽的分化與生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102994546SQ20121048703
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者楊國(guó)順, 白描, 鐘曉紅, 熊興耀, 鄧子牛, 石雪暉, 陳文婷, 周敏 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)