專(zhuān)利名稱(chēng)：東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)試管保存及遷地保護(hù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是瀕危珍稀植物東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法和遷地繁育保護(hù)方法。
背景技術(shù)：
東亞對(duì)開(kāi)蕨iPhyllitis japonica Kom.)也稱(chēng)東北對(duì)開(kāi)蕨、日本對(duì)開(kāi)蕨、對(duì)開(kāi)蕨。既具有觀(guān)賞價(jià)值，又有藥用價(jià)值。屬鐵蕨科，多年生常綠草本植物。根狀莖短，橫臥或斜生，根細(xì)長(zhǎng)，多橫走。世界稀有物種，我國(guó)僅一屬一種，國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物。產(chǎn)于長(zhǎng)白山南麓和西側(cè)局部地區(qū)，主要分布于吉林省長(zhǎng)白朝鮮族自治縣、臨江、集安、撫松等的一些狹窄區(qū)域，并且分布星散。對(duì)開(kāi)蕨喜空氣濕度大、避風(fēng)陰濕、腐殖土豐厚且多有坡度的森林土壤環(huán)境，東亞對(duì)開(kāi)蕨自然貯量極少。這些地區(qū)現(xiàn)沒(méi)有劃入長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)保護(hù)范圍，目前尚無(wú)明確的保護(hù)措施。有研究表明對(duì)開(kāi)蕨在長(zhǎng)白山區(qū)為衰退種，近年來(lái)隨著森林生態(tài)環(huán)境逐年惡化，其長(zhǎng)勢(shì)日益不良，數(shù)量逐減，有的分布區(qū)域已絕跡。因此，為保護(hù)這一珍稀瀕危植物資源，防止自然和人為因素對(duì)其造成毀滅性破壞，迫切需要人工對(duì)其繁殖和保護(hù)。人工繁殖需要大量的種質(zhì)，而東亞對(duì)開(kāi)蕨自然貯量稀少，大量采集野生種質(zhì)，這種行為的本身就會(huì)給本來(lái)就脆弱生態(tài)環(huán)境造成傷害，以至于傷害大于保護(hù)的后果。人工長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)也會(huì)造成品種退化，不適合野生環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了保護(hù)瀕危珍稀植物東亞對(duì)開(kāi)蕨，擴(kuò)大野生種群的面積，而提供一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法和遷地保護(hù)方法。一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，它包括將原葉體接種于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度200-3001x ;光照5_7h/d，溫度為14-16°C ；
所述的培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30/L ；
所述溫度為15°C ；
所述的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，每12個(gè)月更換一次。東亞對(duì)開(kāi)蕨遷地保護(hù)方法，它包括
1)采集東亞對(duì)開(kāi)蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，將剝出的孢子囊放在經(jīng)滅菌后的濾紙上，小心壓碎孢子囊，散出其內(nèi)的孢子，連同濾紙片一同接種于MS+蔗糖20g/L、培養(yǎng)基中；100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，孢子萌發(fā)為原葉體團(tuán)；
2)將原葉體團(tuán)切成小塊接種于1/2MS -MS (全)+蔗糖培養(yǎng)基中繼代與增殖；
3)將部分原葉體按上述的東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭為基質(zhì) 的花盆中，溫室培養(yǎng)30天，噴施O. 1% KH2PO4孢子體誘導(dǎo)，當(dāng)幼苗成長(zhǎng)至4片葉以上，每年六月下旬遷地移栽；
4)每12個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接時(shí)將一部分原葉體繼續(xù)保存培養(yǎng)，其余進(jìn)行增殖繼代、試管外以草炭為基質(zhì)誘導(dǎo)孢子體植株形成、遷地移栽。本發(fā)明提供了一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，將原葉體接種于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度200-3001x ;光照5_7h/d，溫度為14-16°C ；12個(gè)月后，幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)和增殖，狀態(tài)與起初培養(yǎng)時(shí)相似，將其轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)條件下后，仍能正常增殖與生長(zhǎng)；培養(yǎng)60天后，增值率為4. 5左右，孢子體也可以正常形成；已進(jìn)行了 5年的保存處理；本發(fā)明還提供了東亞對(duì)開(kāi)蕨遷地保護(hù)方法，將保存的原葉體每年繼代繁殖，試管外以草炭為基質(zhì)誘導(dǎo)孢子體植株形成、遷地移栽；在長(zhǎng)白山區(qū)選取了與對(duì)開(kāi)蕨原生境基本相似的3個(gè)地點(diǎn)作為遷地移栽供試區(qū)；每個(gè)地點(diǎn)栽植100株；經(jīng)生長(zhǎng)4年，長(zhǎng)
勢(shì)良好，真正達(dá)到對(duì)瀕危植物的保護(hù)。


圖1沒(méi)破碎的孢子葉孢子120d生長(zhǎng)狀態(tài)；
圖2破碎孢子囊后的孢子60d培養(yǎng)；
圖3液體培養(yǎng)40d原葉體生長(zhǎng)狀態(tài)；
圖4液體培養(yǎng)70d原葉體生長(zhǎng)狀態(tài)；
圖5固體培養(yǎng)孢子120d生長(zhǎng)狀況；
圖6接種時(shí)原葉體；
圖7 60d培養(yǎng)后的原葉體；
圖8栽植120d后的孢子體狀況；
圖9分株后的孢子體植株；
圖10對(duì)開(kāi)蕨組培苗溫室馴化；
圖11臨江市洋魚(yú)頭村生長(zhǎng)狀況；
圖12敦化市馬五店山區(qū)2年栽植生長(zhǎng)狀況；
圖13野外3年栽植生長(zhǎng)狀況。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 孢子萌發(fā)
材料來(lái)自吉林省白山市林區(qū)；取東亞對(duì)開(kāi)蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，實(shí)驗(yàn)室中將孢子葉切成Icm大?。粺o(wú)菌條件下O. l%HgCl2溶液滅菌5分鐘，無(wú)菌水沖洗6次，濾紙吸干后接種。接種方法接種分三種方式，一是孢子葉直接接種；二是在超凈工作臺(tái)解剖鏡下將孢子葉中的孢子囊剝離出后接種；三是解剖鏡下將剝出的孢子囊放在經(jīng)滅菌后2cmX2cm大小的濾紙上，用手術(shù)刀小心壓碎孢子囊，散出其內(nèi)的孢子，連同小濾紙片一同接種。孢子培養(yǎng)采用1/2MS+蔗糖20g的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種方法。培養(yǎng)條件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天溫度25_26°C，晚間20_22°C。孢子葉和孢子囊在固體培養(yǎng)基中大約IOOd左右的培養(yǎng)孢子開(kāi)始萌發(fā)，120d時(shí)達(dá)到肉眼可見(jiàn)的程度(見(jiàn)圖1，圖5 )，而破碎孢子囊后的孢子經(jīng)50-60d的培養(yǎng)即達(dá)肉眼可見(jiàn)狀態(tài)，而且萌發(fā)后的長(zhǎng)勢(shì)也明顯好于前兩種(見(jiàn)圖2);可見(jiàn)，東亞對(duì)開(kāi)蕨離體培養(yǎng)中去除孢子囊殼的孢子更利于其萌發(fā)。將孢子葉中的孢子囊剝離出后分別進(jìn)行液體和固體培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基中的孢子經(jīng)30d培養(yǎng)后開(kāi)始萌發(fā)，約40d出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的原葉體，其大小可達(dá)O. 3cm-0. 5cm(見(jiàn)圖3);原葉體再經(jīng)30d培養(yǎng)后，可形成大量的原葉體團(tuán)，大小達(dá)1. 5-2. Ocm左右(見(jiàn)圖4);而此時(shí)固體培養(yǎng)的孢子剛處于萌發(fā)狀態(tài)(圖5);液體培養(yǎng)中的孢子萌發(fā)和原葉體生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于固體培養(yǎng)；這說(shuō)明液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)更適合東亞對(duì)開(kāi)蕨孢子萌發(fā)和原葉體的生長(zhǎng)。實(shí)施例2原葉體繼代與增殖
將孢子萌發(fā)后形成的原葉體團(tuán)分切成約O. 5cm大小的小塊，每小塊約含原葉體5 - 10片，分別接種到含有不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的固體MS培養(yǎng)基中(見(jiàn)表1)，每瓶接種8 -10塊。將孢子萌發(fā)后形成的原葉體團(tuán)分別接種到含有不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，與孢子萌發(fā)條件相同；60d后觀(guān)察原葉體增殖及生長(zhǎng)情況(見(jiàn)表1，圖6，圖7)。原葉體在供試的幾種培養(yǎng)基中均能以約5倍速率增殖。新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)表明，各培養(yǎng)基中的原葉體增殖率無(wú)顯著差異。但是，原葉體的生長(zhǎng)狀態(tài)卻明顯不同，在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和KT為O. 2mg/l以下的培養(yǎng)基中，原葉體總體狀態(tài)表現(xiàn)為生長(zhǎng)平展，較寬大。隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度增高，原葉體總體狀態(tài)表現(xiàn)為狹窄、葉片不展開(kāi)、密實(shí)，且生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，這一類(lèi)原葉體很難用于進(jìn)一步增殖和孢子體植株的誘導(dǎo)。由此可見(jiàn)，原葉體增殖應(yīng)以無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或少量KT的培養(yǎng)基為好。
權(quán)利要求
1.一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，它包括將原葉體接種于1/4 MS MS+蔗糖25-30g/L培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度200-3001x ；光照5_7h/d，溫度為 14-16°Co
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為 1/2MS+ 蔗糖 30/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，其特征在于所述溫度為 15。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，每12個(gè)月更換一次。
5.東亞對(duì)開(kāi)蕨遷地保護(hù)方法，它包括1)采集東亞對(duì)開(kāi)蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，將剝出的孢子囊放在經(jīng)滅菌后的濾紙上，小心壓碎孢子囊，散出其內(nèi)的孢子，連同濾紙片一同接種于MS+蔗糖20g/L的培養(yǎng)基中； 100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，孢子萌發(fā)為原葉體團(tuán)；2)將原葉體團(tuán)切成小塊接種于1/2MS MS+蔗糖培養(yǎng)基中繼代與增殖；3)將部分原葉體按權(quán)利要求1所述的東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭為基質(zhì)的花盆中，溫室培養(yǎng)30天，噴施O. 1% KH2PO4孢子體誘導(dǎo)，當(dāng)幼苗成長(zhǎng)至4片葉以上，每年六月下旬遷地移栽；4)每12個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接時(shí)將一部分原葉體繼續(xù)保存培養(yǎng)，其余進(jìn)行增殖繼代、試管外以草炭為基質(zhì)誘導(dǎo)孢子體植株形成、遷地移栽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種東亞對(duì)開(kāi)蕨種質(zhì)保存方法，將原葉體接種于1/4～MS(全)+蔗糖25-30g/L培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度200-300lx；光照5-7h/d，溫度為14-16℃；12個(gè)月后，幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)和增殖，狀態(tài)與起初培養(yǎng)時(shí)相似，將其轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)條件下后，仍能正常增殖與生長(zhǎng)；已進(jìn)行了5年的保存處理；本發(fā)明還提供了東亞對(duì)開(kāi)蕨遷地保護(hù)方法，將保存的原葉體每年繼代繁殖，試管外以草炭為基質(zhì)誘導(dǎo)孢子體植株形成、遷地移栽；在長(zhǎng)白山區(qū)選取了與對(duì)開(kāi)蕨原生境基本相似的3個(gè)地點(diǎn)作為遷地移栽供試區(qū)；每個(gè)地點(diǎn)栽植100株；經(jīng)生長(zhǎng)4年，長(zhǎng)勢(shì)良好，真正達(dá)到對(duì)瀕危植物的保護(hù)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103004606SQ20121058864
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者趙春莉, 趙和祥, 顧德峰, 李金英, 黃翔童, 陳麗飛, 董然, 劉曉嘉, 劉淑英, 姜立新 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)