一種促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法
【專利摘要】促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄為材料，播種轉(zhuǎn)基因番茄種子，出苗兩個月后的幼苗移栽于栽培溫室中，將轉(zhuǎn)基因番茄幼苗分別用尼龍網(wǎng)遮陰處理，用量子照度計(jì)測定光強(qiáng)分別為遮光75％，50％，30％及全光照四個光照梯度進(jìn)行處理，分別于花期和果期進(jìn)行光合作用測定，并于果實(shí)成熟時分三次采收，測定果中蝦青素含量；種植期間，日常規(guī)律澆水，保證水分狀態(tài)良好，并使用風(fēng)機(jī)及濕簾進(jìn)行降溫處理，定期除蟲防病。本發(fā)明以蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄為細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)蝦青素的材料，在光照強(qiáng)度為日照30％條件下，轉(zhuǎn)基因番茄光合能力及果實(shí)蝦青素含量最佳，為進(jìn)一步建立富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因番茄人工高效種植技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累 的栽培方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 光合生物參與光合作用的類胡蘿卜素（如β -胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃素）為 非酮式類胡蘿卜素，是人體合成維生素 Α的唯一來源。一些單細(xì)胞綠藻在逆境下還能合成 和積累酮式類胡蘿卜素（ketocarotenoid),如奸青素（astaxanthin)。奸青素獨(dú)特的分 子結(jié)構(gòu)和極強(qiáng)的抗氧化活性賦予它高效的抗輻射，抗衰老，抗腫瘤和預(yù)防心血管等疾病的 功能。這使蝦青素成為保健和美容等行業(yè)的新寵。然而天然蝦青素的來源非常有限，人類 一般通過食用海鮮（如蝦、蟹和三文魚）獲得蝦青素。微藻來源的蝦青素生產(chǎn)成本高且難 以突破其產(chǎn)量瓶頸而致其價格非常昂貴，發(fā)掘新的天然蝦青素資源具有重大的意義。中國 科學(xué)院昆明植物研究所黃俊潮研究組與香港大學(xué)/北京大學(xué)的陳峰教授合作，經(jīng)過十余年 的努力，首次實(shí)現(xiàn)了以番茄為細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)蝦青素的目標(biāo)（1，2, 3)，使利用經(jīng)濟(jì)作物 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)高價值天然蝦青素成為可能。番茄是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜之一，為茄科 (Solanaceae)番茄屬一年生草本植物，其產(chǎn)量多與栽培條件密切相關(guān)，只有保持適當(dāng)?shù)脑?培條件，才能獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。光合作用是番茄生育和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，而番茄光合作用除受 植株本身內(nèi)在因素的制約外，還與各種環(huán)境因素密切相關(guān)。因此，在設(shè)施栽培條件下，有必 要根據(jù)番爺光合特性與環(huán)境之間的關(guān)系，來確定提高番爺光合作用能力的栽培和環(huán)境管理 措施。其中，如何選擇適宜的光照強(qiáng)度成為限制番茄生長及生產(chǎn)的關(guān)鍵問題（4, 5, 6, 7)。目 前，如何通過調(diào)節(jié)設(shè)施栽培環(huán)境條件從而促進(jìn)蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄植株的生長及果實(shí)蝦青素 含量積累的方法仍屬空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于以蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄為材料，研究不同光照強(qiáng)度下對轉(zhuǎn)基因番 茄生長發(fā)育、生理特性及果實(shí)蝦青素含量的影響，旨在為蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄高效栽培和果 實(shí)蝦青素含量積累提供技術(shù)，為栽培過程中的光照管理提供方法。最終實(shí)現(xiàn)提供通過調(diào)節(jié) 設(shè)施栽培環(huán)境條件從而促進(jìn)蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄植株的生長及果實(shí)蝦青素含量積累的方法。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0005] 促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄為材料，播 種轉(zhuǎn)基因番茄種子，出苗兩個月后的幼苗移栽于栽培溫室中，將轉(zhuǎn)基因番茄幼苗分別用尼 龍網(wǎng)遮陰，用量子照度計(jì)測定光強(qiáng)分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進(jìn)行 處理，分別于花期和果期進(jìn)行光合作用測定，并于果實(shí)成熟時分三次采收，測定其中蝦青素 含量；種植期間，日常規(guī)律澆水，保證水分狀態(tài)良好，并使用風(fēng)機(jī)及濕簾進(jìn)行降溫處理，定期 除蟲防病。
[0006] 根據(jù)所述的栽培方法，其中所述蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄是保藏號為CGMCC No 9223號 的轉(zhuǎn)基因番茄。
[0007] 根據(jù)所述的栽培方法，其中光強(qiáng)采用遮光30%的光照。
[0008] 根據(jù)所述的栽培方法，其中栽培溫室位于Alt. 1942m;北緯25° 8 z 14"，東經(jīng) 102° 44 13"。
[0009] 根據(jù)所述的栽培方法，其中光強(qiáng)采用全光照和30%遮陰條件時，轉(zhuǎn)基因番茄植株 的光合速率高，光合能力強(qiáng)，植株生理活性強(qiáng)，生長和結(jié)實(shí)好。
[0010] 蝦青素是具有極高價值的酮式類胡蘿卜素，然而來源非常有限。本發(fā)明以蝦青素 轉(zhuǎn)基因番茄為細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)蝦青素為材料，利用不同的光照強(qiáng)度梯度栽培蝦青素轉(zhuǎn)基 因番茄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在光照強(qiáng)度為日照30%條件下，轉(zhuǎn)基因番茄光合能力及果實(shí)蝦青素 含量最佳，是蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄生長的適宜光強(qiáng)，為進(jìn)一步研究富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因番茄 人工高效種植技術(shù)體系的建立奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面用本發(fā)明實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā) 明。
[0012] 實(shí)施例1 :
[0013] 1.材料和方法：
[0014] 1.1研究材料：
[0015] 2013年6月播種蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄（黃俊潮等（Huang JC等，2013)通過基因工程 方法將綠藻中篩選和分離到能催化植物細(xì)胞中β-胡蘿卜素和玉米黃素成蝦青素的酮化 酶和羥化酶基因轉(zhuǎn)入野生型番茄植株（cv. UC82B)中，得到的轉(zhuǎn)基因番茄（已于2014年5月 14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：CGMCC No 9223 號，分類命名：蝦紅1號轉(zhuǎn)基因番茄。）種子苗120株，出苗后兩個月移栽于昆明植物研究 所栽培溫室中（Alt. 1942m ;北緯 25° 8 z 14"，東經(jīng) 102° 44 z 33")。
[0016] 1.2研究方法：
[0017] 1.2. 1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將轉(zhuǎn)基因番茄幼苗分別用尼龍網(wǎng)遮陰處理，用量子照度計(jì)測定 光強(qiáng)分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進(jìn)行處理，每個處理30株，分別于 花期和果期進(jìn)行光合作用測定。并于果實(shí)成熟時分三次采收，測定其中蝦青素含量。種植 期間，日常規(guī)律澆水，保證水分狀態(tài)良好，并使用風(fēng)機(jī)及濕簾進(jìn)行降溫處理，定期除蟲防病。
[0018] 1. 2. 2光響應(yīng)曲線測定：利用便攜式氣體交換系統(tǒng)（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)測定不同光強(qiáng)度下的光合作用速率獲得光響應(yīng)曲線。光響應(yīng)曲線在0? 180(^111〇11^28 -1的范圍內(nèi)設(shè)置12個光梯度（1800，1600，1200、1000、800、600、400、300、200、 100、50、20和0 μ molnT2s_1)。測定時，葉室內(nèi)葉溫分別維持在25°C，C02濃度為400 μ mol πιοΓ1，相對濕度60%左右，平衡2-3min左右記錄讀數(shù)，每個處理重復(fù)三次。利用光合助手 軟件（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)擬合光合響應(yīng)曲線。
[0019] 1. 2. 3二氧化碳響應(yīng)曲線測定：利用便攜式氣體交換系統(tǒng)（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)測定不同二氧化碳強(qiáng)度下的光合作用速率獲得二氧化碳響應(yīng)曲線。維持光 強(qiáng)在1200 mol m2s \ (1)2濃度由0 mol mol 1逐漸升至1800 mol mol、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 使用光合助手軟件（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)擬合光響應(yīng)曲線 及二氧化碳響應(yīng)曲線。
[0020] 1. 2. 4果實(shí)蝦青素含量的測定：分三次隨機(jī)采收成熟果實(shí)，用噴霧干燥機(jī)進(jìn) 行干燥處理采收品，干樣送至昆明植物研究所分析測試中心委托測定。測定方法：將 冷凍干燥好的樣品粉碎、裝袋、密封，進(jìn)行蝦青素含量測定，測定采用高效液相色譜法 分離，其液相條件：色譜柱為WatersSpherisorb 0SD2 (5 μ m, 4. 6, 250mm)，液相型號為 Waters (Milford, MA，USA)，進(jìn)樣量為 20 μ 1 ;流動相 A 相為乙腈 / 甲醇/Tris -HCL (pH 8.0)， 體積比為84:2:14,B相為甲醇/乙酸乙酯，體積比為68:32 ;以1. 2mL/min的流速線性梯度 洗脫色素，從100% A相到100%的B相，每個梯度用時15分鐘，隨后用B相洗脫10分鐘， 通過比對各顏色組分和標(biāo)準(zhǔn)品的光譜吸收和相對保留時間來鑒定各組分，通過將峰面積的 積分值與標(biāo)準(zhǔn)品對比將其轉(zhuǎn)化為濃度值從而對各組分進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)品購買自sigma公司 和Wako公司。
[0021] 1.2. 5數(shù)據(jù)分析：所有數(shù)據(jù)都是使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16. 0 for Windows(SPSS Inc.，Chicag〇，USA)進(jìn)行分析，不同處理間（內(nèi)）的差異比較采用單因素方差分析（AVOVA) 和LSD檢驗(yàn)。
[0022] 2.結(jié)果與討論
[0023] 2. 1不同光照梯度下轉(zhuǎn)基因番茄的光合特性比較：
[0024] 番茄是喜強(qiáng)光的蔬菜作物，不同的光照強(qiáng)度對番茄光合作用有顯著影響。光系統(tǒng) Π 的最大光化學(xué)效率（FV/FM)通常用來表征植物光系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)及受損情況，在不同光照條件 下，轉(zhuǎn)基因番茄的光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率沒有顯著差異，并維持在0. 74以上水平，表 明其在四個光照梯度下光系統(tǒng)沒有顯著性受損情況，均能夠進(jìn)行正常的光合作用（表1)。 不同光照處理下轉(zhuǎn)基因工程番茄的光合能力有顯著性差異，轉(zhuǎn)基因番茄的飽和光合速率在 全光照條件下顯著高于30%遮陰，30%遮陰條件下的飽和光合速率顯著高于50%和75% 遮陰條件（表1)。轉(zhuǎn)基因番茄的光飽和點(diǎn)表現(xiàn)出全光照和30%遮陰條件下顯著高于50% 和75%遮陰條件，表明生長光強(qiáng)越強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因番茄利用光照的能力越強(qiáng)，同時表明轉(zhuǎn)基因番 茄對生長的光照強(qiáng)度有較好的可塑性。因此，光照強(qiáng)度越強(qiáng)（遮陰度越低），轉(zhuǎn)基因番茄的 飽和光合速率越高，光合能力越強(qiáng)。對轉(zhuǎn)基因工程番茄的生長和生產(chǎn)來說，遮陰會顯著影響 植株的光合能力從而影響植株的生長和結(jié)實(shí)。
[0025] 表1四個不同光照處理下蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄光合參數(shù)比較
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄為材料，播種 轉(zhuǎn)基因番茄種子，出苗兩個月后的幼苗移栽于栽培溫室中，將轉(zhuǎn)基因番茄幼苗分別用尼龍 網(wǎng)遮陰，用量子照度計(jì)測定光強(qiáng)分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進(jìn)行處 理，分別于花期和果期進(jìn)行光合作用測定，并于果實(shí)成熟時分三次采收，測定其中蝦青素含 量；種植期間，日常規(guī)律澆水，保證水分狀態(tài)良好，并使用風(fēng)機(jī)及濕簾進(jìn)行降溫處理，定期除 蟲防病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征在于所述蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄是保藏號為 CGMCC No 9223號的轉(zhuǎn)基因番茄。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征在于光強(qiáng)采用遮光30%的光照。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征在于栽培溫室位于Alt. 1942m;北緯 25。8 z 14"，東經(jīng) 102。44 z 33"。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征在于光強(qiáng)采用全光照和30%遮陰，轉(zhuǎn)基因 番爺植株光合速率高，光合能力強(qiáng)，植株生理活性強(qiáng)，生長和結(jié)實(shí)好。
【文檔編號】A01G1/00GK104145678SQ201410403560
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】?，|, 王 華, 胡虹, 嚴(yán)寧, 黃俊潮 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所