一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物生物技術(shù)和遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法，即將染色體加倍處理后的三倍體紫錐菊的根外植體誘導(dǎo)不定芽再生，不定芽長(zhǎng)至連葉高2cm后誘導(dǎo)生根，選擇從不定芽誘導(dǎo)開始后第150～210天長(zhǎng)出2cm根的不定芽進(jìn)行倍性鑒定，高成功率的獲得由三倍體成功加倍成六倍體的紫錐菊，由本發(fā)明所述方法篩選獲得的六倍體的成功率高達(dá)53.33%，為多倍體紫錐菊篩選提供了可靠的技術(shù)手段，為多倍體紫錐菊的育種提供了重要的技術(shù)支撐，應(yīng)用前景廣闊，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【專利說(shuō)明】一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物生物技術(shù)和遺傳育種領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高效獲得六倍體 紫錐菊的篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫錐菊)為菊科多年生草本植物，是原產(chǎn)于美洲的一種野生 花卉，因其具有良好的免疫調(diào)劑作用已廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和保健食品。由于紫錐菊的 有效成分主要存在于根部，為提高根部產(chǎn)量，進(jìn)一步改善品質(zhì)，提高有效成分含量，增強(qiáng)其 抗病性，圍繞其展開的倍性育種研究發(fā)展迅猛，現(xiàn)有技術(shù)中已有利用紫錐菊葉柄外植體成 功培育出四倍體、八倍體的研究，但其誘導(dǎo)成功率較低；現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)成功加倍的多倍體紫 錐菊篩選效率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中獲得成功加倍的六倍體紫錐菊的 篩選效率低的缺陷，提高一種一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法。
[0004] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 一種一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法，即將染色體加倍處理后的三倍體紫錐菊 的根外植體誘導(dǎo)不定芽再生，不定芽長(zhǎng)至連葉高2 cm后誘導(dǎo)生根，選擇從不定芽誘導(dǎo)開始 后第150?210天長(zhǎng)出2cm根的不定芽進(jìn)行倍性鑒定，高成功率的獲得由三倍體成功加倍 成六倍體的紫錐菊。
[0005] 秋水仙素是一種生物堿，它能夠抑制有絲分裂，秋水仙素處理后的細(xì)胞，其染色體 雖然縱裂，但細(xì)胞并不分裂，不能形成兩個(gè)細(xì)胞，因此可以使細(xì)胞染色體加倍，秋水仙素經(jīng) 常被用來(lái)作為植物多倍體誘導(dǎo)的物質(zhì)，但因植物種類不同，針對(duì)不同的植物，其用秋水仙素 處理的條件顯著不同，需要研究者進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)和分析。
[0006] 申請(qǐng)人:已在前期的研究中實(shí)現(xiàn)了利用秋水仙素誘導(dǎo)紫錐菊葉柄外植體獲得四倍 體和八倍體，但其不僅成功誘導(dǎo)率較低，而且篩選效率也低，本發(fā)明首先是將紫錐菊的根作 為外植體進(jìn)行加倍，獲得了成功率高的六倍體。
[0007] 經(jīng)秋水仙素處理的根外植體在轉(zhuǎn)接到含BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生后，記 錄該轉(zhuǎn)接日期a ;當(dāng)再生芽長(zhǎng)至連葉高2 cm時(shí)轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生，當(dāng)不 定根長(zhǎng)至2 cm時(shí)記錄該日期b。從誘導(dǎo)不定芽再生到根尖染色體檢查的時(shí)間跨度即培養(yǎng)時(shí) 間，記為b-a天。
[0008] 本發(fā)明研究結(jié)果顯示生長(zhǎng)時(shí)間與六倍體獲得率有顯著關(guān)系，秋水仙素處理后進(jìn)行 不定芽誘導(dǎo)的時(shí)候，越早達(dá)到生根高度、長(zhǎng)出2 cm不定根的芽株，越有可能是沒(méi)有加倍的三 倍體，越晚長(zhǎng)成的芽，其為六倍體的幾率越高，在第150?210 d才獲得2cm根的不定芽，其 為六倍體的幾率很高。
[0009] 優(yōu)選地，所述根外植體誘導(dǎo)不定芽再生的培養(yǎng)基為含BA的MS培養(yǎng)基；更優(yōu)選地， 所述BA的濃度為0. 5 mg/L。
[0010] 申請(qǐng)人:在研究中還發(fā)現(xiàn)，只要是同時(shí)生根，且選取的各條根本身狀態(tài)相互接近，不 論是接近根尖部分的根段作為外植體，還是遠(yuǎn)離根尖部分的根段作為外植體，還是根的中 段作為外植體，經(jīng)秋水仙素加倍處理以后，在含有〇. 5 mg/L BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生不 定芽的效果差異不顯著。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明提供了一種一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法，即將染色體加倍處理后 的三倍體紫錐菊的根外植體誘導(dǎo)不定芽再生，不定芽長(zhǎng)至連葉高2 cm后誘導(dǎo)生根，選擇從 不定芽誘導(dǎo)開始后第150?210天長(zhǎng)出2cm根的不定芽進(jìn)行倍性鑒定，高成功率的獲得由 三倍體成功加倍成六倍體的紫錐菊，由本發(fā)明所述方法篩選獲得的六倍體的成功率高達(dá) 53. 33%，為多倍體紫錐菊篩選提供了可靠的技術(shù)手段，為多倍體紫錐菊的育種提供了重要 的技術(shù)支撐，應(yīng)用前景廣闊，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 Mo

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步具體描述。本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想或同類物質(zhì)的簡(jiǎn) 單替代屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無(wú)特殊說(shuō)明，均為本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn) 有常規(guī)的方法，所使用的配料或材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為通過(guò)商業(yè)途徑可得到的配料或材 料。
[0013] 本發(fā)明所米用染色體加倍的方法參考Nilanthi (2009)，基本流程為：取材一預(yù)培 養(yǎng)一不同類型外植體(葉、葉柄、根)進(jìn)行加倍處理一MS培養(yǎng)基中添加 BA進(jìn)行誘導(dǎo)不定芽再 生一培養(yǎng)不同天數(shù)（?210天）一誘導(dǎo)不定根一倍性鑒定，倍性鑒定方法為根尖染色體壓片 后鏡檢(卡寶品紅染色)。
[0014] 本發(fā)明所述含有秋水仙素的培養(yǎng)基為秋水仙素120 mg/L、BA 0. 4 mg/L、NAA 0. 01 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的MS培養(yǎng)基。
[0015] 數(shù)據(jù)格式與處理：數(shù)據(jù)的分析采用美國(guó)IBM公司的SPSS (Statistical Product and Service Solutions)19.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)處理各項(xiàng)平均數(shù)后列出的誤差項(xiàng)為各平均數(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)誤差。各處理的平均數(shù)間差異顯著性分析：使用鄧肯式多重范圍比較（Duncan's New Multiple Range Test)進(jìn)行三組或以上數(shù)據(jù)的差異顯著性分析；用T檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)的 差異顯著性分析。
[0016] 實(shí)施例1秋水仙素對(duì)不同類型外植體存活狀態(tài)的影響 本發(fā)明所用的紫錐菊的二倍體種子購(gòu)自美國(guó)馬薩諸塞州諾頓的Plantation Products 園藝公司；四倍體通過(guò) 申請(qǐng)人:已有的方法對(duì)二倍體紫錐菊進(jìn)行秋水仙素處理使其染色體加 倍獲得（Nilanthi，2009);三倍體通過(guò)將二倍體和四倍體進(jìn)行雜交并栽培種子獲得。
[0017] 對(duì)獲得的三倍體紫錐菊分別取葉片、葉柄和根外植體使用120 mg/L秋水仙素處 理 18 d 后，轉(zhuǎn)移到含有 BA 0· 4 mg/L，NAA 0· 01 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 4. 5 g/L 的 MS 再 生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，22 d后統(tǒng)計(jì)外植體存活率。從表1可知，不同類型三倍體外植體對(duì)于120 mg/L秋水仙素處理后的培養(yǎng)反應(yīng)差異顯著，其中葉柄和根外植體均100%存活，但葉片外植 體只有77. 0%存活，其余的葉片外植體黃化死亡。

【權(quán)利要求】
1. 一種高效獲得六倍體紫錐菊的篩選方法，其特征在于，將染色體加倍處理后的三倍 體紫錐菊的根外植體誘導(dǎo)不定芽再生，不定芽長(zhǎng)至連葉高2 cm后誘導(dǎo)生根，選擇從不定芽 誘導(dǎo)開始后第150?210天長(zhǎng)出2cm根的不定芽進(jìn)行倍性鑒定，高成功率的獲得由三倍體 成功加倍成六倍體的紫錐菊。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的根外植體取材于近根尖段、 中段或遠(yuǎn)離根尖段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述根外植體誘導(dǎo)不定芽再生的培 養(yǎng)基為含BA的MS培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述BA的濃度為0. 5 mg/L。
【文檔編號(hào)】A01H1/08GK104365475SQ201410639090
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】楊躍生, 陳曉鷺, 吳鴻, 李棟梁, 劉穎 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)