本發(fā)明涉及植物離體培養(yǎng)，具體涉及到一種快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、梨屬(pyrus)植物在我國種質(zhì)資源十分豐富，為滿足消費(fèi)者需求，育種工作者通過雜交、芽變選種、實(shí)生選種、誘變等多種育種方式選育出了大量各具特色的優(yōu)質(zhì)梨品種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在1984-2015年期間，我國育成梨新品種126個(gè)。組織培養(yǎng)技術(shù)是近幾十年來發(fā)展起來的一項(xiàng)無性繁殖新技術(shù)，又叫離體培養(yǎng)，是指從植物體分理出符合需要的組織、器官或細(xì)胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在無菌條件下接種于含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的方法。采用組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅可以對(duì)不同品種及種質(zhì)的優(yōu)良性狀進(jìn)行室內(nèi)保存，而且還能夠消除季節(jié)因素的限制，提高繁殖系數(shù)，為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的快速繁殖及脫毒苗的獲得提供前提，此外，離體植株還為室內(nèi)基礎(chǔ)研究及遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供材料，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、但是，離體培養(yǎng)中外植體消毒大多使用升汞或次氯酸鈉為主要消毒劑，升汞的殺菌效果極好，但是毒性較大，無法保證安全使用。次氯酸鈉雖然毒性較小但殺菌效果一般，且梨屬于多糖多酚類植物，極易褐化，次氯酸鈉的使用在滿足殺菌效果的同時(shí)會(huì)造成較高的褐化率，不易獲得成活的健壯離體植株。因此，采用已有的消毒手段，以梨幼嫩新梢莖段為外植體，采用升汞或次氯酸鈉消毒獲得的離體培養(yǎng)試管苗的方法效率不高。對(duì)此，專利號(hào)為cn?115843689a的現(xiàn)有技術(shù)采用75％的乙醇對(duì)一年生梨樹枝條浸泡消毒，該方法避免了使用毒性較大的升汞或易導(dǎo)致褐化的次氯酸鈉消毒，但是需先在培養(yǎng)液中培養(yǎng)3至5周才可萌發(fā)獲得離體植株，之后再進(jìn)行消毒培養(yǎng)，整體周期較長。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供一種快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，該方法將外植體腋芽的萌發(fā)周期大幅縮短至6～7天，且在無需采用殺菌效果較好的升汞的條件下即能獲得較高的成活率和較低的褐化率，顯著提高組培效率。

2、為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：采集當(dāng)年生新稍，去除葉片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射殺菌，得預(yù)處理新稍；將所述預(yù)處理新稍截成帶有腋芽的莖段，依次于75％酒精和0.05％～0.1％的次氯酸鈉中浸泡消毒，再經(jīng)無菌水沖洗并接種至ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3、本發(fā)明采用當(dāng)年生新稍作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，為了避免消毒過程中造成的外植體褐化死亡，本發(fā)明在浸泡消毒之前通過額外的清水沖洗、酒精擦拭以及紫外光照射的方式對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理，將存在于枝梢表面的大部分真菌及細(xì)菌預(yù)先去除。在預(yù)處理之后，再依次采用75％酒精和較低濃度的次氯酸鈉溶液進(jìn)行浸泡消毒，避免了使用毒性較大的升汞。

4、結(jié)合第一方面，在采集新稍時(shí)，可以在5月份從樹勢(shì)健壯的梨樹采集當(dāng)年生新稍。本發(fā)明利用當(dāng)年生的新稍作為外植體，與現(xiàn)有的采用一年生的休眠后的枝條相比，具有所需培養(yǎng)周期更短的優(yōu)勢(shì)。

5、結(jié)合第一方面，在將新稍的葉片去除后，先用清水沖洗，之后用75％酒精擦拭表面3～5遍。

6、結(jié)合第一方面，在用75％酒精擦拭表面后，于紫外光下照射殺菌，所述紫外光的強(qiáng)度為40～60μw/cm2，該范圍的紫外光強(qiáng)度可有效殺滅外植體表面的細(xì)菌、病毒及真菌孢子等微生物，且不會(huì)對(duì)外植體本身造成不利影響。

7、優(yōu)選地，所述紫外光的強(qiáng)度為50μw/cm2。

8、結(jié)合第一方面，所述照射殺菌的時(shí)長為18～22min，優(yōu)選為20min。

9、真菌及細(xì)菌污染大多存在于枝梢表面，在對(duì)采集的外植體浸泡消毒之前，先依次進(jìn)行水洗、酒精擦拭至少3遍和紫外燈照射的操作步驟，除掉枝梢表面大部分的菌類污染，有效降低外植體污染率。

10、結(jié)合第一方面，所述帶有腋芽的莖段的長度為1.5～2.5cm，莖段的長度過長易導(dǎo)致內(nèi)生細(xì)菌污染的增加，過短可能導(dǎo)致殺菌劑對(duì)腋芽基部產(chǎn)生額外傷害。

11、優(yōu)選地，所述帶有腋芽的莖段的長度為2cm。

12、結(jié)合第一方面，將帶有腋芽的莖段于75％酒精中浸泡消毒55～65s。

13、結(jié)合第一方面，將帶有腋芽的莖段于75％酒精中浸泡消毒后，再于0.05％的次氯酸鈉中浸泡消毒3.5～4.5min。

14、本發(fā)明依次采用75％酒精和0.05％的次氯酸鈉對(duì)莖段消毒，既避免了使用毒性較大的升汞，又可保證較高的成活率和較低的褐化率。

15、結(jié)合第一方面，所述培養(yǎng)為于24～26℃下光照培養(yǎng)16h/d。

16、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)為于25℃下光照培養(yǎng)。

17、結(jié)合第一方面，所述ms培養(yǎng)基中含有pvp-k30，向普通ms培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的pvp-k30可以降低組培苗的褐化率。

18、結(jié)合第一方面，所述ms培養(yǎng)基中pvp-k30的濃度為3.5～4.5g/l，優(yōu)選為4g/l。

19、結(jié)合第一方面，所述梨選自黃冠梨、西子綠梨、豐水梨或康弗倫斯梨。

20、本發(fā)明獲得的有益效果：本發(fā)明提供的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，采用當(dāng)年生新稍作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，在培養(yǎng)第6～7天即萌發(fā)生長出無菌離體植株，顯著縮短了培養(yǎng)周期。此外，本發(fā)明采用“75％酒精+低濃度次氯酸鈉”的消毒方式，使得該方法在縮短培養(yǎng)周期的同時(shí)、還可保證外植體的高成活率(最高達(dá)96％以上)和低褐化率(最低為0)，污染率也均低于5％，顯著提高了育苗效率；并且，該方法避免了劇毒試劑升汞的使用，大大提高了培養(yǎng)過程的安全性。

技術(shù)特征：

1.一種快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：采集當(dāng)年生新稍，去除葉片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射殺菌，得預(yù)處理新稍；

2.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，在5月份從樹勢(shì)健壯的梨樹采集當(dāng)年生新稍。

3.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述紫外光的強(qiáng)度為40～60μw/cm2。

4.如權(quán)利要求1或3所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述照射殺菌的時(shí)長為18～22min。

5.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述帶有腋芽的莖段的長度為1.5～2.5cm。

6.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，于75％酒精中浸泡消毒55～65s。

7.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，于0.05％的次氯酸鈉中浸泡消毒3.5～4.5min。

8.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)為于24～26℃下光照培養(yǎng)16h/d。

9.如權(quán)利要求1所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述ms培養(yǎng)基中含有pvp-k30。

10.如權(quán)利要求9所述的快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述ms培養(yǎng)基中pvp-k30的濃度為3.5～4.5g/l。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及植物離體培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種快速獲得梨無菌離體植株的組織培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法包括：采集當(dāng)年生新稍，去除葉片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射殺菌得預(yù)處理新稍；將所述預(yù)處理新稍截成帶有腋芽的莖段，依次于75％酒精和0.05％～0.1％的次氯酸鈉中浸泡消毒，再經(jīng)無菌水沖洗并接種至MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法采用當(dāng)年生新稍作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，在培養(yǎng)第6～7天即萌發(fā)生長出無菌離體植株，顯著縮短了培養(yǎng)周期。采用“75％酒精+低濃度次氯酸鈉”的消毒方式，使得該方法在縮短培養(yǎng)周期的同時(shí)、還可保證外植體的高成活率和低褐化率，且無需使用升汞，大大提高培養(yǎng)過程的安全性。

技術(shù)研發(fā)人員：楊岳昆,王晉,王紅寶,王永博,王亞茹,安碩,李勇,李曉,王迎濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19