專利名稱：用遺傳工程生物殺蟲劑控制昆蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及到用能表達(dá)外源蛋白的重組表達(dá)載體來控制昆蟲，具體來說，是利用昆蟲的病原體，優(yōu)選為重組體，結(jié)合使用合成的化學(xué)殺蟲劑以增強(qiáng)昆蟲的殺滅率。
本發(fā)明得到政府支持，資助號(hào)No.5-T32-ES07059，由國立衛(wèi)生研究院(NIH)拔款，政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
鱗翅目昆蟲中的夜蛾科(Noctuidae)包括一些在農(nóng)業(yè)上最具破壞性的害蟲，如棉鈴蟲屬(Heliothis)、Heliocoverpa屬、斜紋夜蛾屬(Spodoptera)和Trichoplusia屬。例如，在這一科中有煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)、棉葉波紋夜蛾(Alabama argillacea)、八字地老虎(Amathesc-nigrum)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、青銅地蠶(Nephelodesemmedonia)、草地貪夜蛾(Laphygma frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、豆雜色夜蛾(Peridroma saucia)。人們通常采用擬除蟲菊酯殺蟲劑來控制上述及其它的昆蟲。野生型的桿狀病毒在商業(yè)上的成功運(yùn)用仍十分有限。
擬除蟲菊酯殺蟲劑目前在殺蟲劑市場(chǎng)上占據(jù)著主導(dǎo)地位，銷量每年在幾十億美元。然而，其銷售已開始出現(xiàn)停滯的局面，部分原因是由于害蟲對(duì)這些化合物普遍出現(xiàn)抗性。單就棉花來說，抗擬除蟲菊酯(pyr-R)的棉鈴蟲(Heliothis spp.)已經(jīng)開始造成每年上百萬美元的損失。實(shí)際上，已有幾例擬除蟲菊酯殺蟲劑完全不能控制棉鈴蟲屬(Heliothis)幼蟲侵害棉花的災(zāi)害發(fā)生，結(jié)果導(dǎo)致作物的徹底被毀。因而，人們已進(jìn)行了大量努力以控制棉花中的抗擬除蟲菊酯的棉鈴蟲。
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者有時(shí)通過減少使用擬除蟲菊酯殺蟲劑，即等到生長后期才使用的方法來防止擬除蟲菊酯抗性出現(xiàn)。因此，他們只得轉(zhuǎn)向使用效果較差而價(jià)格更高的有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯殺蟲劑，而這些殺蟲劑也同樣受到抗性問題的困擾。因此，研制一種新型高效的殺蟲劑來控制抗擬除蟲菊酯的害蟲，在任何管理策略中都有著極其重要的意義。
農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)殺蟲劑的抗性也導(dǎo)致了環(huán)境和人類健康所面臨的危害，這些問題的出現(xiàn)是由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者對(duì)擬除蟲菊酯(及其它殺蟲劑)抗性的另一個(gè)反應(yīng)造成的。他們采用增加殺蟲劑的量、更多地使用非選擇性和有毒化合物的方法，以克服害蟲的抗性。而這產(chǎn)生了破壞性的惡性循環(huán)。
然而，合成化學(xué)藥劑的使用，以擬除蟲菊酯為例，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中一個(gè)組成部分，并且在維持我們目前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平方面可能是必要的。盡管其它的控制劑，如前面提到的重組的昆蟲病原體正被研究以用于害蟲的控制。
最近，對(duì)桿狀病毒科中的苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)通過遺傳修改的方法，使其表達(dá)昆蟲選擇性毒素，以加快殺滅昆蟲的速度。將昆蟲選擇性毒素導(dǎo)入昆蟲病原性病毒，能使該昆蟲宿主的致死時(shí)間縮短約30％。其描述見美國專利申請(qǐng)?zhí)?8/229,417(1994年4月15日申請(qǐng))，該專利是美國專利申請(qǐng)?zhí)?7/629,603(1990年12月19日申請(qǐng))的部分繼續(xù)申請(qǐng)，包含(部分)一般性轉(zhuǎn)讓。
在這些建議使用的、控制昆蟲的特異性毒素中，有來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的毒素，蝎類的中Buthus eupeus的毒素和Androctonusaustralis的毒素，和螨類的虱狀蒲螨(Pyemotes tritici)毒素。更進(jìn)一步，Hammock等(“自然”(Nature)，344，pp.458-461，1990)描述了用JHE控制昆蟲，見美國專利申請(qǐng)?zhí)朜o.07/927,851(1992年8月10日申請(qǐng))和美國專利5,098,706，1992年3月24日公布，兩者均為一般性轉(zhuǎn)讓。
一種新的能控制帶抗性的以及易感性的有害昆蟲群體的方法將是很有必要的。
本發(fā)明的其中一個(gè)方面提供了一種控制害蟲的方法。適合于本發(fā)明控制的害蟲例如有群聚昆蟲、蜱螨類和線蟲。對(duì)這些害蟲(或它們的活動(dòng)場(chǎng)所)采用將重組病毒和有機(jī)殺蟲劑協(xié)同作用的方法進(jìn)行處理。重組病毒優(yōu)選為重組的桿狀病毒，它在感染后的害蟲細(xì)胞中能表達(dá)一種外源蛋白或其功能性衍生物。
本發(fā)明的處理方式可以是同時(shí)進(jìn)行的(如將重組病毒和有機(jī)殺蟲劑預(yù)混合后使用)。也可以先用病毒處理害蟲或其活動(dòng)場(chǎng)所，然后在約24小時(shí)內(nèi)再用有機(jī)殺蟲劑處理。


圖1說明了蕃茄植株在受昆蟲幼蟲侵襲前后的變化情況，以闡述結(jié)合運(yùn)用重組桿狀病毒進(jìn)行昆蟲控制的特性。
本發(fā)明是利用遺傳工程的昆蟲病毒，結(jié)合使用合成的化學(xué)殺蟲劑的方法來治理害蟲，如昆蟲。雖然是用桿狀病毒作為例子貫穿全文來說明，但這一發(fā)明可采用不同的昆蟲病毒來實(shí)施，包括DNA病毒和RNA病毒。通過將桿狀病毒作為昆蟲病毒的一個(gè)例子，我們發(fā)現(xiàn)重組病毒和化學(xué)殺蟲劑相結(jié)合有一相互作用，其效果強(qiáng)于僅用單一方法的效果。我們首先來描述適合于實(shí)施本發(fā)明的重組桿狀病毒。
用“桿狀病毒”殺蟲劑，指的是桿狀病毒科中的任何桿狀病毒，如核型多角體病毒(NPV)。桿狀病毒是進(jìn)化上相關(guān)的一大類病毒，只感染節(jié)肢動(dòng)物(anthropods)。的確，有些桿狀病毒只感染一些侵害有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)林作物的害蟲，而其它一些桿狀病毒已知能專一性地感染別的昆蟲類害蟲。由于桿狀病毒只感染節(jié)肢動(dòng)物，因此，對(duì)人或環(huán)境危害很小或沒有危害。
在適合的DNA病毒中，除了桿狀病毒科的病毒外，還有昆蟲痘病毒(EPV)。例如Melolontha melonotha EPV、桑燈蛾(Amsacta moorei)EPV、亞洲飛蝗(Locusta migratoria)EPV、血黑蝗(Melanplus sangumipes)EPV、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)EPV、埃及伊蚊(Aedes aogypti)EPV和Chironomusluridus EPV。其它適合的DNA病毒為顆粒體病毒(GV)。合適的RNA病毒包括披膜病毒、黃病毒、小RNA病毒、質(zhì)型多角體病毒(CPV)等等。雙鏈DNA的Eubaculovirinae亞科包括兩類核型多角體病毒(NPVs)和顆粒體病毒(GVs)。由于它們?cè)谏钍分挟a(chǎn)生包涵體，因而在生物控制方面特別有用。顆粒體病毒(GVs)的例子包括蘋蠹蛾(Cydia pomonella)GV、大菜粉蝶(Pierisbrassicae)GV、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)GV、菜粉蝶(Artogeia rapae)GV和印度谷螟(Plodia interppunctella)GV。
適宜于實(shí)施本發(fā)明的桿狀病毒可以是有包涵體病毒，也可以沒有。核型多角體病毒(NPV)是桿狀病毒中的一個(gè)帶包膜的亞群。即核型多角體病毒群的一個(gè)顯著特征是許多病毒顆粒包埋在晶狀的蛋白質(zhì)基質(zhì)中，這種基質(zhì)稱為“包涵體”。核型多角體病毒的例子有卷葉蛾(Lymantria dispar)核型多角體病毒(gyPsy moth NPV)，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(MNPV)、芹菜夜蛾(Anagrapha ralcifera)核型多角體病毒(celery looper NPV)、Spodoptera litturalis NPV，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)NPV、棉鈴蟲(Heliothis armigera)NPV、Mamestra brassicae NPV、云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)NPV、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)NPV、美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)NPV和Rachiplusia ou NPV。在田間使用中，以帶包膜的病毒為優(yōu)選，這是由于病毒的多角體包膜為其內(nèi)部具傳染性的核殼提供了保護(hù)，因而使它更為穩(wěn)定。
能說明實(shí)施本發(fā)明有效的桿狀病毒為芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、油桐尺蠖(Buzura suppressuria)、蘋蠹蛾(Cydia pomonella)、美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、Manestia brassicae、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera littoralis和Spodoptera litura桿狀病毒。實(shí)施本發(fā)明一個(gè)特別有用的“NPV”桿狀病毒是AcNPV，它是來自苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)的核型多角體病毒，該病毒引起人們特別感興趣的原因是斜紋夜蛾屬(Spodoptera)、Trichoplusia屬和棉鈴蟲屬(Heliothis)中的主要害蟲易感染上該病毒。
這些桿狀病毒可以通過遺傳工程手段，構(gòu)建成具有更強(qiáng)殺蟲效果的病毒，即可以將編碼一種外源蛋白(例如昆蟲毒素)的基因，克隆到桿狀病毒的基因組上。用于說明的毒素來自蝎類的Buthus eupeus、Androctonus anstralis和螨類的虱狀蒲螨(Pyemotes tritici)。
表達(dá)的外源蛋白(可以是糖蛋白)，優(yōu)選為殺蟲毒素，特別是節(jié)肢動(dòng)物或其它無脊椎動(dòng)物的毒素，如蝎毒素、黃蜂毒素、蝸牛毒素或蜘蛛毒素。有用的蝎子毒素如來源于Androctonus australis的毒素。有用的蝸牛毒液為來自蝸牛的芋螺毒素(錐殼蝸牛毒素)，它是由蝸?？卺尫诺模渲杏行┒舅仫@出對(duì)包括昆蟲在內(nèi)的節(jié)肢動(dòng)物有選擇性。如參閱Olivera等的“Conus屬的神經(jīng)肽的多樣性”(Diversity of Conus Neuropeptides)(“科學(xué)”(Science)，249257-263(1990)。
來自Androctonus australis的興奮性毒素(AaIT)的氨基酸序列已被確定，并發(fā)表在1982年Darbon，AaIT毒素對(duì)昆蟲有毒性，而對(duì)等足類(isopods)和哺乳動(dòng)物無毒。
其它的不同種類的蝎毒素，如Buthoid scorpion的毒素也可以應(yīng)用。例如LqqIT2毒素，這是從Leiurus quinquestriatus quinquestriatus獲得的一種抑制性毒素。獲取這種神經(jīng)毒素的純化方法已由Zlotkin等發(fā)表在“生物化學(xué)和生物物理學(xué)文獻(xiàn)”(Archives of Biochem.Biophys.)240877-887(1985)上。
BjIT2是另一種抑制性昆蟲毒素，來自Buthotus judaicus，純化方法由Lester等發(fā)表在“生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)”(Biochem.Biophys.Acta)701370-381(1982)上。BjIT2以兩種異構(gòu)體形式存在，其差別在于氨基酸序列的位置15上，異構(gòu)體I在該位置上為異亮氨酸，異構(gòu)體II則為纈氨酸。
LqhIT2是來自Leiurus quinquestriaius hebraeus的另一種抑制性昆蟲毒素，其純化是經(jīng)過反相高效液相色譜而獲得的。
還發(fā)現(xiàn)一種“中間態(tài)”的毒素，它能影響昆蟲的鈉通道，作用方式同α毒素影響哺乳動(dòng)物鈉通道的方式非常相似。這一種神經(jīng)毒素是由黃色的Leuirus quinquestriatus hebraeus蝎(Buthinae，Bnthidae)產(chǎn)生的，本文中稱之為Lqhp35。該毒素的鑒定和純化見Citan等的描述，見“源自Lenirusquinquestriatus hebraeus毒液的昆蟲毒素”(Toxin to Insects Derived from theVenom of the Leiurus quinquestriatus hebraeus)一文，發(fā)表在“生物化學(xué)”(Biochemistry)，29，5941-5947(1990)，并更名為LqhoIT。
從Chactoid scorpion(Scorpio maurus palmatus)的毒液中純化的其它毒素，也能應(yīng)用。如SmpIT2毒素，是從Chactoid scorpion(Scorpio mauruspalmatus)中得到的抑制性昆蟲毒素，其純化見Lazarovici等的報(bào)道(“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2578397-8404(1982))。
其它的從Chactoid scorpion(Scorpio maurus palmatns)的毒液中純化得到的毒素還有SmpCT2和SmpCT3，以及甲殼類毒素，它們的純化見Lazarovici的博士論文(耶路撒冷Hebrew大學(xué)，1980)“Scorpio maurus palmatus蝎(Scovpionidae)毒液組成和作用的研究”。
為控制昆蟲而構(gòu)建重組的桿狀病毒時(shí)，需優(yōu)選包含一段分泌信號(hào)序列。這一序列可以來源于細(xì)菌、酵母、真菌或高等真核生物(包括動(dòng)物和植物)的蛋白質(zhì)(如參考Watson在“核酸研究”(Nucl.Ac.Res.)125145-5164(1984)中的文章)。較優(yōu)選的是來源于昆蟲蛋白的分泌信號(hào)序列，象來自惜古比天蠶蛾(Hyalophora cecropia)的殺菌肽B的分泌信號(hào)序列(見Van Hofsten等在“國家科學(xué)院院刊”(PNAS)，822240-2243(1985)的文章)，以及煙草天蛾(Manducasexta)的脫殼激素(Horodyski等“國家科學(xué)院院刊”(PNAS)，868123-8127(1989))。優(yōu)選的還有與蝎毒素天然相連的分泌信號(hào)序列，這些序列可以通過分析mRNA、cDNA或基因組DNA來確定。其中更為優(yōu)選的是AaIT的天然分泌信號(hào)序列(見Bougis等“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)，26419259-19265(1989))。
外源蛋白或毒素可以表達(dá)為該毒素的功能性衍生物。毒素的“功能性衍生物”是具有生物活性(功能上或結(jié)構(gòu)上)的一種化合物，其活性與該毒素的生物學(xué)活性大致相同?！肮δ苄匝苌铩币辉~意在包括一個(gè)分子的“片段”、“變體”、“類似物”和“化學(xué)衍生物”。一個(gè)毒素類分子的“片段”指該分子的任何多肽類附屬結(jié)構(gòu)。一個(gè)毒素類分子的“變體”是指結(jié)構(gòu)上或功能上與整個(gè)毒素分子或其片段大致相同的分子?！按笾孪嗤笔侵竷蓚€(gè)分子在結(jié)構(gòu)上大致相同，或者具有類似的生物活性。因此，假如兩個(gè)分子有相似活性，按照上述定義，即使其中一個(gè)分子的結(jié)構(gòu)在另一分子中沒有，或者即使氨基酸殘基的序列不完全相同，那么也認(rèn)為它們是“變體”。一個(gè)毒素類分子的“類似物”是指一個(gè)分子同另一個(gè)分子的整體或部分片段具有大致相同的功能。按這里的定義，當(dāng)一個(gè)分子包含額外的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)在正常情況下不屬于另一分子的一部分時(shí)，就稱該分子為另一分子的“化學(xué)衍生物”。
這些結(jié)構(gòu)可以提高分子的可溶性、吸收作用和生物半衰期等。具有這些作用的結(jié)構(gòu)揭示在Remington的“制藥科學(xué)”(Pharmaceutical Sciences)(1980)。將這些結(jié)構(gòu)連到分子上的技術(shù)已是廣為人知。
毒素的表達(dá)，一般來說要包括一段啟動(dòng)子片段，其長度足于引導(dǎo)RNA合成的起始。桿狀病毒的一個(gè)基因是編碼多角體蛋白的。由于多角體蛋白是已知的真核基因中表達(dá)率最高的，因此，盡管其它啟動(dòng)子和雜合的啟動(dòng)子序列也可以應(yīng)用，但仍以多角體蛋白啟動(dòng)子為優(yōu)選。
如后面將要進(jìn)一步說明的，我們從苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)構(gòu)建了一個(gè)特殊的重組桿狀病毒，即把來自Androctonous australis(Hector)的一個(gè)編碼昆蟲毒素的基因克隆到AcNPV的基因組上，而毒素的表達(dá)受多角體蛋白的啟動(dòng)子控制。(這一重組體構(gòu)建也描述在美國專利申請(qǐng)?zhí)朜o08/229,417(已注明參考書目)和“生物技術(shù)”(Bio/Technohgy)，9848-852，1991中)。我們把這一特殊的用于說明具體實(shí)施的桿狀病毒稱為“AcAaIT”。但有人用“HIT”代替“IT”來指毒素(如見Loret等Biochemistry,29，pp1492-1501(1990)，作者把蝎子中幾種有活性的神經(jīng)毒素描述為“Androctonous australis Hector”。我們運(yùn)用了這一重組的桿狀病毒(比如與稱為“WtAcNPV”的野生型AcNPV比較)，以下將有詳細(xì)描述。然而，應(yīng)該了解的是，盡管AcAaIT作為特殊優(yōu)選，但本發(fā)明并不局限于這一用來例證的特殊的重組桿狀病毒。
因此，以上描述的重組桿狀病毒是實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)部分或一個(gè)方面，而用本發(fā)明可以治理的害蟲為群聚昆蟲、蜱螨類和線蟲類?？捎靡哉f明治理的昆蟲類害蟲有煙芽夜蛾、棉鈴蟲、棉葉波紋夜蛾、八字地老虎、透翅切根夜蛾、青銅地蠶、草地貪夜蛾、甜菜夜蛾和豆雜色夜蛾。實(shí)施本發(fā)明的另一部分或方面，是將這些已描述的重組桿狀病毒與化學(xué)殺蟲劑相結(jié)合。
可實(shí)施本發(fā)明方法的合成有機(jī)殺蟲劑包括鈉離子通道興奮劑(如擬除蟲菊酯)、鈉離子通道阻斷劑(如吡唑啉)、乙酰膽堿酯酶抑制劑(如有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯)、煙酰乙酰膽堿結(jié)合劑(如咪蚜胺)、γ-氨基丁酸能的結(jié)合劑(如emamectin和fipronil)、真蛸胺的興奮劑或拮抗劑(如甲脒)以及氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑(如吡咯殺蟲劑)。
如下文中實(shí)驗(yàn)部分將要進(jìn)一步舉例說明的，我們運(yùn)用了低劑量的氯氰菊酯(II型擬除蟲菊酯)或丙烯除蟲菊酯(I型擬除蟲菊酯)，與野生型的AcNPV(WtAcNPV)或AcAaIT(大于99％致死的濃度)相結(jié)合，處理煙芽夜蛾(H.virescens)幼蟲以說明本發(fā)明。
將重組的AcAaIT與上述提到的任何一種擬除蟲菊酯(即使是小劑量的)相結(jié)合使用，能產(chǎn)生一個(gè)劑量-反應(yīng)，其效果大于增效作用。因此，使用本發(fā)明重組的AcAaIT與丙烯除蟲菊酯或氯氰菊酯相結(jié)合作用于昆蟲幼蟲時(shí)，能比用野生型WtAcNPV分別減少半致死時(shí)間54.8％和64.6％。這些數(shù)據(jù)說明了一個(gè)令人驚奇的特性和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。也就是說，擬除蟲菊酯和AaIT相互作用能產(chǎn)生超過增效作用的殺滅速度，也提高了AcAaIT的殺滅速度(即其效果大于單一效果的代數(shù)和)。更令人驚奇的結(jié)果是煙芽夜蛾的抗性品系比殺蟲劑易感品系對(duì)重組桿狀病毒更為敏感，證明了本發(fā)明有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。
拋開理論束縛，我們認(rèn)為同時(shí)使用AaIT和擬除蟲菊酯能對(duì)鈉通道產(chǎn)生協(xié)同作用。那些與重組桿狀病毒結(jié)合使用時(shí)能產(chǎn)生協(xié)同作用的毒素，似乎可以根據(jù)其作用機(jī)理進(jìn)行推測(cè)。根據(jù)其作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的活性預(yù)測(cè)的有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯，結(jié)果也都發(fā)現(xiàn)有協(xié)同作用。
因此，在實(shí)施本發(fā)明中，所控制的害蟲(和/或處理的活動(dòng)場(chǎng)所)是采用重組桿狀病毒和有機(jī)殺蟲劑相結(jié)合的方法進(jìn)行處理，而該有機(jī)殺蟲劑能按其作用機(jī)理預(yù)測(cè)其協(xié)同作用。采用兩者相結(jié)合處理害蟲時(shí)，也可以簡便地用單一混合制劑的方法。
眾所周知，有機(jī)殺蟲劑的使用可以采用噴灑、噴霧、撒粉、散射或傾倒等方法，也可按配方制成粉劑、粉末、顆粒狀或裝入聚合物膠囊。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以運(yùn)用上述常規(guī)的方法，而優(yōu)選的方法是將有機(jī)殺蟲劑和重組的桿狀病毒按照所需的比例混合，典型的可以添加入惰性的載體。如粘土、乳糖、脫脂豆粉等以助于使用。
但也可以將每一組分分開來使用，即先用桿狀病毒處理，然后用有機(jī)殺蟲劑(最好在48小時(shí)之內(nèi))。當(dāng)先用桿狀病毒(接著用有機(jī)殺蟲劑)時(shí)，可以采用象噴灑這樣的常規(guī)方法。先使用桿狀病毒的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能產(chǎn)生“掉落”特性，這將在下文的實(shí)施例3中進(jìn)行描述。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)中用到的重組體AcAaIT是以重組轉(zhuǎn)移載體pAcUW2(B)·AaIT形式構(gòu)建的，它能通過口傳染并能表達(dá)一種昆蟲選擇性毒素(AaIT)，該毒素是從蝎類的Androctonus australis中分離到的，受p10啟動(dòng)子控制。這一重組體的構(gòu)建較早報(bào)道在“生物技術(shù)”(Bio/Technology)，9848-852(1991年9月)中。簡要地說，轉(zhuǎn)移載體pBK283中的AaIT毒素基因(在此有時(shí)也稱AaHIT)用SacI和XbaI消化，切下完整的AaIT基因，這其中包含了一段分泌所需的家蠶素的信號(hào)序列，將DNA片段插在pTZ-18R質(zhì)粒的SacI和XbaI位點(diǎn)之間。用SacI切開該質(zhì)粒，并將SacI-BamHI-SacI人工接頭插在該位點(diǎn)上。最后得到的質(zhì)粒含有2個(gè)BamHI位點(diǎn)，一個(gè)靠近毒素cDNA的5′末端，另一個(gè)位于終止密碼子和起始片段的XbaI酶切位點(diǎn)之間。連接頭和AaIT基因的插入用BamHI酶切、1％瓊脂糖凝膠電泳和篩選所得300bp片段的方法來證實(shí)。實(shí)驗(yàn)中采用Gene Clean(Biol01)的方案以便回收約30％的毒素片段，用于插入轉(zhuǎn)移載體。
將pAcUW2(B)質(zhì)粒載體酶切和去磷酸化，把酶切下來的AaIT基因片段連接到該質(zhì)粒載體的BglII克隆位點(diǎn)上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM101菌株中。連接的結(jié)果去除了BglII和BamHI位點(diǎn)，將所得的質(zhì)粒進(jìn)行篩選，看是否含單一的SacI位點(diǎn)。用1％瓊脂糖凝膠電泳從60個(gè)克隆中鑒定出3個(gè)SacI陽性克隆。插入的方向是通過SacI(其酶切位點(diǎn)在AaIT基因的5′末端)和BamHI(酶切位點(diǎn)在轉(zhuǎn)移載體上多角體蛋白基因的編碼序列中)的雙酶切來驗(yàn)證。3個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體中的2個(gè)以正確的方向攜帶了AaIT基因，并且有一段長度約1.6kb片段誘導(dǎo)正確定位。這樣構(gòu)建的質(zhì)粒最后導(dǎo)致AaIT的cDNA序列，插在復(fù)制的p10蛋白啟動(dòng)子的下游序列和多角體蛋白基因5的上游序列之間，由此構(gòu)成了重組質(zhì)粒pAcUW2(B)·AaIT。
重組AcNPV的分離在補(bǔ)充了2.5％的胎牛血清的ExCell 400(JR Scientific)培養(yǎng)基上培養(yǎng)草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞(Sf-9)。將Sf-9細(xì)胞連同pAcUW2(B)質(zhì)粒和多角體蛋白陰性AcNPV DNA一起，用鈣沉淀法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。感染5天之后鑒定、收集多角體蛋白的感染細(xì)胞，重組病毒用挑取多角體蛋白陽性噬斑的方法進(jìn)行純化。純化時(shí)用1％SDS(十二烷基磺酸鈉)處理每次噬斑純化后的細(xì)胞，以排除多角體蛋白陰性的非重組病毒，從而加速純化過程。在重組病毒的初次噬斑試驗(yàn)之后，對(duì)單個(gè)噬斑再連續(xù)進(jìn)行3輪純化，培養(yǎng)最終所得的純的重組體培養(yǎng)，并保存在4℃和-80℃。
重組體AcUW2(B)·AaIT生物學(xué)活性的篩選重組病毒經(jīng)初次噬斑試驗(yàn)純化后，總共分離到6個(gè)噬斑，將它們懸浮于500μ1加了2.5％胎牛血清的ExCell培養(yǎng)基中。在35mm培養(yǎng)皿上生長的Sf-9細(xì)胞中(75％單層細(xì)胞)接種100μl(含約106噬斑形成單位)的懸液，感染7天后收集細(xì)胞。將收集起來的單個(gè)培養(yǎng)物在1000g下離心5分鐘，收集上清液，并與沉淀的細(xì)胞分離開。再將細(xì)胞重懸于雙蒸水，用1％SDS處理，震蕩5分鐘，洗滌三遍。粗略計(jì)算上清液中每毫升的噬斑形成單位數(shù)。
實(shí)施例2具體死亡率的研究用2齡煙芽夜蛾(H.virescers)幼蟲進(jìn)行，詳盡的描述見較早引用的論文(“生物技術(shù)”(Bio Technolgy)，Vol.9)中的實(shí)驗(yàn)方案。致死時(shí)間來自用重組體和野生型AcNPV處理2齡煙芽夜蛾(H.virescerns)幼蟲所得的結(jié)果，采用的劑量為常用的每片食物中含250個(gè)多角體蛋白包涵體(PIBs)。
表1給出了用AcUW2(B)·AaIT(AcAIT)和野生型AcNPV處理煙芽夜蛾(H.virescens)2齡幼蟲的劑量-反應(yīng)和死亡時(shí)間。
表1處理 LD(PIBs) LT(小時(shí))105090 10 50 90重組體AcUW2(B)·AaIT 1.56 13.3 113 59.8a88.0a129a野生型AcNPV 2.72 21.9 175 91.4 125172a表示與其它處理方式有顯著差異-POLO概率值分析程序(CI0.95)PIBs＝多角體蛋白包涵體LT＝致死時(shí)間；LD＝致死劑量這些數(shù)據(jù)證明了AcUW2(B)·AaIT對(duì)煙芽夜蛾(H.virescens)幼蟲的殺滅速度明顯快于野生型的AcNPV。
實(shí)施例3感染了重組體AcAaIT的幼蟲，在死亡之前的10-15小時(shí)典型地出現(xiàn)麻痹的癥狀，并開始停止攝食。因此，可把這些幼蟲看成為功能性死亡。用AcAaIT處理幼蟲寄主比用野生型AcNPV的殺死時(shí)間減少40％。
我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)煙芽夜蛾(H.virescens)的幼蟲受病毒感染后，攝食蕃茄植株所造成的植株損害的差異。各植株都用2條4齡幼蟲，三組幼蟲分別是未經(jīng)感染的對(duì)照組(I)、48小時(shí)前感染野生型AcNPV組(II)和感染重組體AcAaIT組(III)。這些幼蟲可以在植株上連續(xù)攝食直至死亡。
經(jīng)AcAaIT處理的幼蟲對(duì)植株的攝食損傷明顯要少。然而，不明顯的是感染了AcAaIT的幼蟲不能給蕃茄植株造成更多的危害，因?yàn)檫@些幼蟲從植株上掉落下來。事實(shí)上，我們觀察到在感染AcAaIT的8條4齡和5齡幼蟲中，有5條在感染120小時(shí)后從植株上掉落下來。這些幼蟲顯然已不能爬回植株，因?yàn)樗鼈円验_始出現(xiàn)麻痹癥狀，這一現(xiàn)象有時(shí)被稱為“掉落”特性，說明見
圖1。
在
圖1中，A組照片顯示的是受幼蟲侵害之前的蕃茄植株。因此，圖IA為幼蟲侵害之前的對(duì)照組植株，IB表示該植株在受無病毒感染的幼蟲自由攝食、直至實(shí)驗(yàn)停止時(shí)的狀況。如圖(圖片是按照片復(fù)制)所示，對(duì)照組的蕃茄植株被幼蟲嚴(yán)重?cái)z食。圖IIA也是未引入幼蟲時(shí)的蕃茄植株，IIB是該植株中引入了已感染野生型AcNPV的幼蟲，經(jīng)190-200小時(shí)的攝食，幼蟲死亡、實(shí)驗(yàn)終止時(shí)的情況(此時(shí)IB、IIB、IIIB實(shí)驗(yàn)都終止)。盡管IIB植株經(jīng)受幼蟲死亡之前200小時(shí)左右的攝食侵害，但仍可看出它比IB組的狀況有很大改善。當(dāng)我們比較IIIA(實(shí)驗(yàn)開始)和IIIB(實(shí)驗(yàn)結(jié)束)時(shí)，可以看出IIIB植株在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的葉子還相當(dāng)多。這是由于新構(gòu)建的桿狀病毒AcAaIT感染幼蟲后，幼蟲的行為在死亡之前受到嚴(yán)重影響，結(jié)果8條幼蟲中的5條經(jīng)120小時(shí)攝食之后，從植株上掉下來。其余3條不久之后也從植株上掉落下來。
表2證實(shí)了昆蟲受到刺激之后大量時(shí)間不攝食，或爬離食物基質(zhì)的情況。
表2感染期間煙芽夜蛾幼蟲離開食物基質(zhì)的時(shí)間百分比。
食物基質(zhì) AcAaIT野生型病毒棉花 80.40％ 13.30％長葉萵苣 64.20％ 15.40％玻璃生菜 85.90％ 13.20％食物 59.90％ 11.00％為獲得如表2所概括的資料，新生幼蟲用含病毒包涵體2000 PIBs/μl的濃度小滴喂養(yǎng)，并每隔6-8小時(shí)檢查，幼蟲按是否在食物基質(zhì)上分別計(jì)數(shù)，并概括成上述表2。在感染后64小時(shí)，所有煙芽夜蛾幼蟲中有超過57％不在食物基質(zhì)上，而野生型的比例為32％(此時(shí)還未表現(xiàn)出癥狀)。這一實(shí)驗(yàn)的目的是為了證實(shí)感染了AcAaIT的幼蟲在死亡之前已處于麻痹狀態(tài)(或其攝食行為已終止)，而在野生型病毒感染的昆蟲中，沒有這一現(xiàn)象。有可能的是，低濃度的神經(jīng)毒素AaIT在感染幼蟲早期會(huì)刺激幼蟲宿主，從而出現(xiàn)“掉落”或攝食終止現(xiàn)象。盡管幼蟲仍有攝食和危害的可能性，但它已不能接近植株。由于麻痹作用而使幼蟲宿主減少了危害時(shí)間和提前出現(xiàn)活動(dòng)抑制。AcAaIT有效地減少了宿主的食物消耗，因而也就可解釋為對(duì)植株攝食危害的減小。
實(shí)施例4人們常常引用致死慢和由此造成作物損害，來說明病毒殺蟲劑在商業(yè)上成功的主要局限。能在24小時(shí)至48小時(shí)內(nèi)使害蟲致死是經(jīng)典殺蟲劑的共同目標(biāo)。因此，在本項(xiàng)研究中我們重點(diǎn)研究用致死時(shí)間(LTs)表示的殺滅速度。相似的方法也可以用來確定致死劑量，而該指標(biāo)有著重要的經(jīng)濟(jì)意義。
如表3A和3B所概括的那樣，我們研究了六種殺蟲劑在小劑量時(shí)(24小時(shí)死亡率10-20％的濃度，見表4)，同野生型AcNPV或重組AcAaIT(＞LC99)相結(jié)合使用對(duì)新生的煙芽夜蛾(H.virescens)幼蟲的作用。例如，兩種研究的化合物為擬除蟲菊酯和丙烯除蟲菊酯(I型擬除蟲菊酯)。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的丙烯除蟲菊酯或氯氰菊酯(cypermethrin)與野生型AcNPV相結(jié)合使用時(shí)，產(chǎn)生次加性反應(yīng)(subadditive response)。因此，將丙烯除蟲菊酯和野生的AcNPV相結(jié)合能使半致死時(shí)間縮短至71.9小時(shí)，比單獨(dú)使用AcNPV的時(shí)間減了17.9％(理論上加性效應(yīng)的時(shí)間為53.1小時(shí))；同樣，氯氰菊酯同野生型AcNPV相結(jié)合產(chǎn)生的半致死時(shí)間為65.8小時(shí)，比單用野生型AcNPV所需時(shí)間減少了24.2％(理論上兩者結(jié)合的半致死時(shí)間為52.1小時(shí))。這些結(jié)果表明擬除蟲菊酯和野生型AcNPV在作用上是相互獨(dú)立的，但產(chǎn)生一個(gè)次加性反應(yīng)，因?yàn)閮烧呓Y(jié)合使用時(shí)產(chǎn)生正效應(yīng)，盡管其作用大小要明顯低于理論值(加性效應(yīng))。
表3A殺蟲劑與野生型和重組桿狀病毒結(jié)合化合物 通用名 類型 作用方式來源丙烯除蟲菊酯Cinerine， I型擬除蟲菊酯 鈉通道興奮劑 Roussel Uclaf Div，Alleviate， Agrovetennaire，BioallethrinParis.France氯氰菊酯 Ammo， II型擬除蟲菊酯 鈉通道興奮劑 ICIAmericas(Zeneca)Cymbush， Goldsboro，NCCynoff，Cyperkill，F(xiàn)enom，Arrivo二氯二苯 DDT 氯代烴鈉通道興奮劑 由加州大學(xué)Davis分校的三氯乙烷 B.D.Hammock合成硫丹Thiodan， 環(huán)二烯類 GABA通道興奮劑 FMC Corp.
Cyclodan，Ag Chemical GroupThiosulfan， Middleport，NYMalix，Thionex，Tiovel滅多蟲Lannate， 氨基甲酸酯AChE抑制劑 E.I.DuPon de Nemours & Co.
Nudrin Wilmmgton DE溴丙磷Curacon，Polycron 有機(jī)磷酸鹽AChE抑制劑 Ciba-Geigy Greensboro，NCSelecronGABA，γ-氨基丁酸；AChE，乙酰膽堿酯酶表3B新生的煙芽夜蛾幼蟲對(duì)重組體或野生型AcNPV和低濃度的經(jīng)典殺蟲劑的時(shí)間-反應(yīng)
a劑量反應(yīng)曲線是根據(jù)煙芽夜蛾的新生幼蟲對(duì)經(jīng)典殺蟲劑的反應(yīng)作出的。用NPV感染新生幼蟲是采用小滴喂養(yǎng)法讓幼蟲感染2000個(gè)多角體蛋白的包涵體，三種使用的NPV包括WtAcNPV，AcAaIT和AcJHE.KK。要與殺蟲劑結(jié)合處理的幼蟲要立即轉(zhuǎn)到經(jīng)過10-20％致死濃度(24小時(shí))處理過的小瓶子中。死亡率每隔8-12小時(shí)記錄，數(shù)據(jù)用10g概率值分析程序(POLO-PC)進(jìn)行分析。
然而，如表5的數(shù)據(jù)所示，將重組的AcAaIT同小劑量的一種擬除蟲菊酯相結(jié)合，能產(chǎn)生大于加性效應(yīng)的劑量-反應(yīng)。因此，我們觀察到AcAaIT同丙烯除蟲菊酯或氯氰菊酯(cypermethrin)相結(jié)合能使半致死時(shí)間比單獨(dú)用AcAaIT分別減少30.0％和38.7％。將AcAaIT與丙烯除蟲菊酯或氯氰菊酯相結(jié)合處理的半致死時(shí)間分別為感染后40.2小時(shí)和31.5小時(shí)(表3)，兩者都分別低于45.8小時(shí)和44.8小時(shí)的理論值(加性效應(yīng))。這些數(shù)據(jù)提示擬除蟲菊酯和AaIT之間能相互作用產(chǎn)生快于增強(qiáng)作用(potentiation)的殺滅速度，并且協(xié)同增強(qiáng)了AcAaIT的殺滅速度(增補(bǔ)協(xié)同作用(supplemental synergism)-即作用效果快于單個(gè)效果的代數(shù)和)。
將另一個(gè)重組體病毒AcJHE.KK用作重組體NPV和AcAaIT的對(duì)照。AcJHE.KK表達(dá)保幼激素酯酶的修飾態(tài)。該酶來源于昆蟲，并在許多鱗翅目昆蟲中有著重要的調(diào)節(jié)發(fā)育的作用。修飾后的JHE顯示出對(duì)幾種鱗翅目昆蟲有殺滅效果(Bonning和Hammock，1994)。盡管JHE.KK的作用模式尚未完全了解。但我們認(rèn)為它并不干擾昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AcJHE.KK與氯氰菊酯共同作用于昆蟲時(shí)，半致死時(shí)間減少了23.8％，為52.5小時(shí)，顯著高于47.2小時(shí)這一兩者共同作用的理論時(shí)間，表明它是一種次加性效應(yīng)(subadditive)，而非增補(bǔ)協(xié)同效應(yīng)(supplemental effect)(見表5)。由于AcJHE.KK同AcAaIT有著相近的半致死時(shí)間，這些數(shù)據(jù)表明擬除蟲菊酯并非無選擇性地增強(qiáng)任何桿狀病毒殺滅昆蟲的速度。因此，進(jìn)一步支持了重組病毒AcAaIT和擬除蟲菊酯殺蟲劑之間有著增補(bǔ)協(xié)同關(guān)系。
如表3B所示，另一種鈉通道興奮劑DDT也被選來與NPV病毒一起作用。將DDT和野生型AcNPV結(jié)合使用能比單獨(dú)用野生型AcNPV縮短24％的半致死時(shí)間，為66.0小時(shí)(表3B)。數(shù)據(jù)顯示，這一結(jié)合作用產(chǎn)生了次加性效應(yīng)(理論時(shí)間為46.7小時(shí))。將DDT與AcAaIT相結(jié)合比單用AcAaIT減少29.0％的半致死時(shí)間(為41.2小時(shí))。這兩者結(jié)合使用顯示出純粹的加性效應(yīng)(即理論值＝實(shí)際值)，因?yàn)槔碚摰陌胫滤罆r(shí)間為40.8小時(shí)，與實(shí)際時(shí)間非常接近。
另一殺蟲劑硫丹(環(huán)二烯類)也被用來與NPV結(jié)合，以研究兩者的相互作用。有趣的是，當(dāng)硫丹與野生型AcNPV結(jié)合作用時(shí)顯示出拮抗作用，兩者結(jié)合時(shí)的半致死時(shí)間為78.1小時(shí)，比單獨(dú)使用殺蟲劑的73.3小時(shí)的半致死時(shí)間長，表明了有拮抗反應(yīng)。而當(dāng)AcAaIT與硫丹結(jié)合作用時(shí)，半致死時(shí)間為47.7小時(shí)，明顯快于單用AcAaIT或硫丹作用所需時(shí)間，表明為次加性反應(yīng)。
另外還用氨基甲酸酯(滅多蟲methomyl)和有機(jī)磷酸鹽(溴丙磷profenofos)殺蟲劑分別結(jié)合AcNPV或AcAaIT進(jìn)行研究。有趣的是，兩種殺蟲劑與野生型AcNPV結(jié)合使用時(shí)產(chǎn)生增補(bǔ)協(xié)同作用。滅多蟲和野生型AcNPV相結(jié)合作用的半致死時(shí)間為50.3小時(shí)，而理論的反應(yīng)時(shí)間為71.9小時(shí)(表3)。同樣，溴丙磷同野生型AcNPV結(jié)合使用的半致死時(shí)間的58.5小時(shí)，而理論的加性反應(yīng)時(shí)間為73.5小時(shí)。類似地，滅多蟲或溴丙磷同AcAaIT結(jié)合也產(chǎn)生增補(bǔ)協(xié)同反應(yīng)。滅多蟲或溴丙磷與AcAaIT結(jié)合的半致死時(shí)間分別為34.3小時(shí)和53.2小時(shí)。AcAaIT和滅多蟲結(jié)合作用時(shí)的殺滅速率比單用野生型AcNPV快61.8％，比單用重組AcAaIT也快36.0％。溴丙磷同AcAaIT結(jié)合使用比單用野生型AcNPV和重組的AcAaIT的殺滅時(shí)間分別縮短了40.8％和17.0％。
總之，我們的數(shù)據(jù)表明，擬除蟲菊酯殺蟲劑和乙酰膽堿酯酶抑制劑似乎為重組病毒AcAaIT在田間使用中的增效作用提供了最大可能，因此，使用重組的AcAaIT成為特別優(yōu)選。但其它表達(dá)AaIT基因的重組桿狀病毒株也為優(yōu)選(即HzAaIT或SfAaIT)。對(duì)擬除蟲菊酯來說，這些數(shù)據(jù)提示，同時(shí)使用AaIT和擬除蟲菊酯會(huì)對(duì)昆蟲鈉通道產(chǎn)生協(xié)同反應(yīng)?；谶@些結(jié)果，應(yīng)該將不同劑量的擬除蟲菊酯同AcAaIT或其它能表達(dá)AaIT基因的重組病毒結(jié)合起來試驗(yàn)，以確定田間使用效果。我們所建議的低劑量擬除蟲菊酯，應(yīng)對(duì)有益的節(jié)肢動(dòng)物的作用盡量小，從而不會(huì)影響病毒對(duì)寄主的專一性。相信將兩者相結(jié)合的方法在對(duì)付抗性的策略上是有用的。
氨基甲酸酯和有機(jī)磷酸鹽殺蟲劑都對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)有毒害作用。這些化合物抑制了乙酰膽堿酯酶，導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)突觸區(qū)積聚，從而產(chǎn)生神經(jīng)反應(yīng)過多，導(dǎo)致昆蟲麻痹。因此，將殺蟲劑和肽毒素同時(shí)使用可產(chǎn)生增補(bǔ)協(xié)同反應(yīng)。這一反應(yīng)很難用病毒本身的原因來說明，即便病毒本身是有作用的。但是，核多角體病毒NPV能夠感染神經(jīng)細(xì)胞，并最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞裂解?？梢韵胂蟮贸觯窠?jīng)細(xì)胞由于NPV的侵染而裂解后，會(huì)造成周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的增加，并導(dǎo)致神經(jīng)肌肉的異常。這一作用可以解釋野生型和重組NPV同滅多蟲或溴丙磷結(jié)合使用時(shí)都會(huì)觀察到的增補(bǔ)協(xié)同效應(yīng)。
如前面所提到的，這些研究強(qiáng)調(diào)的是病毒和化學(xué)殺蟲劑在聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)昆蟲半致死時(shí)間的影響，但同樣的方法也可以應(yīng)用于研究劑量。在這里我們使用殺蟲劑在24小時(shí)致死百分之十的劑量(LD10s)，以減少直接由化學(xué)殺蟲劑造成的癥狀和死亡(表4)。在實(shí)際中，有多種因素會(huì)影響到使用的劑量，包括費(fèi)用、生物和化學(xué)殺蟲劑是否能得到、環(huán)保問題、田間種群的抗性水平和其它控制害蟲所需考慮的問題。
實(shí)施例5在這項(xiàng)研究中，我們比較了野生型和AcAaIT分別對(duì)擬除蟲菊酯敏感和抗性(PEG)的煙芽夜蛾(H.viresceus)幼蟲的致死時(shí)間(LTs)。從敏感的和抗性的新生幼蟲對(duì)野生型AcNPV和重組的AcAaIT的反應(yīng)看，非常相似。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析(POLO-PC)表明，在斜率(PEG斜率為9.51，敏感幼蟲為9.82，95％CL)和截距上無明顯差異。而當(dāng)這些病毒作用在擬除蟲菊酯抗性幼蟲上，以試驗(yàn)其效果時(shí)，出現(xiàn)了如下令人驚奇的結(jié)果，數(shù)據(jù)分析表明野生型和重組AcAaIT之間的斜率(斜率PEG為13.9，敏感幼蟲為7.73，95％CL)和截距有著明顯差異。但我們的結(jié)果卻顯示抗性品系而不是敏感品系更及時(shí)地被殺滅。Stoneville品系的90％致死時(shí)間(LT90)為感染后103小時(shí)，而PEG品系為78.1小時(shí)，表明殺死抗性品系的速率明顯快了24.1％。
這些結(jié)果表明，重組的桿狀病毒，如AcAaIT，可能對(duì)田間抗擬除蟲菊酯的煙芽夜蛾幼蟲比對(duì)易感性幼蟲更為有效，因而可有效對(duì)付擬除蟲菊酯抗性問題。
因此，本發(fā)明一方面是利用AcAaIT來控制對(duì)擬除蟲菊酯有抗性的害蟲類昆蟲的暴發(fā)。而且，AcAaIT可以作為對(duì)付抗性的策略之一，延緩或防止田間擬除蟲菊酯抗性的出現(xiàn)。除了減少抗性種群外，這一策略應(yīng)擴(kuò)展到提高擬除蟲菊酯殺蟲劑的功效。
實(shí)施例6我們研究了幾種殺蟲劑在低劑量下與野生型AcNPV病毒或AcAaIT(＞LC99)配合使用對(duì)煙芽夜蛾新生幼蟲的作用(24小時(shí)的LC10-LC20，表4)。所研究的兩種化合物為擬除蟲菊酯類的丙烯除蟲菊酯(擬除蟲菊酯I型)和氯氰菊酯(擬除蟲菊酯II型)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛣┝康谋┏x菊酯或氯氰菊酯同野生型AcNPV結(jié)合使用時(shí)有次加性反應(yīng)。
表4化合物 數(shù)量每小瓶中殺蟲劑量(μg)24小時(shí)的死亡率(％)丙烯除蟲菊酯 121 0.05 14.0氯氰菊酯 110 0.008 11.8滴滴涕 80 0.02 18.8硫丹 80 0.002 17.5滅多蟲 125 0.02 20.8溴丙磷 150 0.06 16.3殺蟲劑的致死濃度(LC10-LC20)摘自Campanhola和Plapp(1989)的結(jié)果。
參看以下表5，將丙烯除蟲菊酯和野生型AcNPV結(jié)合使用，能使半致死時(shí)間減少到71.9小時(shí)(理論上的加性效應(yīng)為53.1小時(shí))，比單用野生型AcNPV縮短了17.9％。同樣，當(dāng)氯氰菊酯同野生型AcNPV結(jié)合作用，能使半致死時(shí)間為65.8小時(shí)(理論上為52.1小時(shí))，這比單用野生型AcNPV縮短了24.2％。這些結(jié)果提示，擬除蟲菊酯與野生型AcNPV相互獨(dú)立作用，但能產(chǎn)生一個(gè)次加性反應(yīng)，因?yàn)楸M管兩者相結(jié)合所產(chǎn)生的效果比理論上的相互作用(即加性效應(yīng))明顯要小，但仍然為正效應(yīng)。
將重組NPV(即AcAaIT)病毒同低劑量的擬除蟲菊酯配合使用，能產(chǎn)生一個(gè)大于加性效應(yīng)的劑量-反應(yīng)。我們觀察到，AcAaIT同丙烯除蟲菊酯或氯氰菊酯相結(jié)合使用時(shí)，比單用AcAaIT分別減少30.0％和38.7％的半致死時(shí)間(LT50s)。將AcAaIT與丙烯除蟲菊酯和氯氰菊酯配合使用時(shí)，半致死時(shí)間分別為感染后40.2小時(shí)和31.5小時(shí)(表5)。這兩個(gè)半致死時(shí)間都分別低于45.8小時(shí)和47.2小時(shí)的理論致死時(shí)間(加性效應(yīng))，這說明它們之間有協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。
表5重組體或野生型AcNPV同低濃度經(jīng)典殺蟲劑的相互作用
LT＝致死時(shí)間；RecNPV＝重組NPV
a劑量反應(yīng)曲線是用煙芽夜蛾的新生幼蟲對(duì)經(jīng)典殺蟲劑的反應(yīng)作出的，用NPV感染幼蟲是采用小滴喂養(yǎng)法讓幼蟲感染2000個(gè)多角體病毒包涵體。幼蟲立即轉(zhuǎn)移到經(jīng)10-20％致死濃度(24小時(shí))處理過的小瓶子中，每隔8-12小時(shí)計(jì)數(shù)一次。
b理論殺死時(shí)間＝1[1/單用病毒的半致死時(shí)間+1/單用殺蟲劑的半致死時(shí)間]c作用－增補(bǔ)協(xié)同作用實(shí)際時(shí)間＞理論時(shí)間；加性協(xié)同作用實(shí)際時(shí)間＝理論時(shí)間；次加性作用單獨(dú)使用的最快時(shí)間＜實(shí)際時(shí)間＜理論時(shí)間；拮抗作用實(shí)際時(shí)間＜單獨(dú)使用的最快時(shí)間前述例子用以說明本發(fā)明的部分具體實(shí)施方案，并無意限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書限定。
根據(jù)PCT條約第19條修改權(quán)利要求書的聲明國際局于1995年10月30日收到修改的權(quán)利要求書，其中，對(duì)原始公開文本中的權(quán)利要求第1-3，17，20，21，23，25，27做了修改，增加了權(quán)利要求第32-35項(xiàng)，其余權(quán)利要求未做改變。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1、一種控制包括群聚昆蟲、蜱螨類和線蟲類害蟲的方法，包括采用重組昆蟲病毒和有機(jī)殺蟲劑相結(jié)合的方法處理所述害蟲或它們的活動(dòng)場(chǎng)所，重組的昆蟲病毒感染所述的害蟲細(xì)胞后能夠表達(dá)一種外源蛋白，將兩者相結(jié)合的方法能有效地加快殺滅害蟲的速度。
2、權(quán)利要求1的方法，其中該外源蛋白是一種昆蟲毒素，或者是該昆蟲毒素的功能性衍生物，對(duì)所述害蟲具有活性。
3、權(quán)利要求2的方法，其中該昆蟲毒素是一種蝎毒素。
4、權(quán)利要求1的方法，其中該昆蟲病毒是桿狀病毒。
5、權(quán)利要求4的方法，其中該桿狀病毒是核型多角體病毒。
6、權(quán)利要求5的方法，其中該桿狀病毒來自苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、油桐尺蠖(Buzura suppressuria)、蘋囊蛾(Cydia pomonella)、美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)、棉鈴蟲(Heliothis arrigera)、Mariestia brassicae、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera littoralis或Spodoptera litura。
7、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是鈉通道興奮劑。
8、權(quán)利要求7的方法，其中該鈉通道興奮劑是擬除蟲菊酯。
9、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑為乙酰膽堿酯酶抑制劑。
10、權(quán)利要求9的方法，其中該乙酰膽堿酯酶抑制劑是有機(jī)磷酸鹽。
11、權(quán)利要求9的方法，其中該乙酰膽堿酯酶抑制劑是氨基甲酸酯。
12、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種鈉通道阻斷劑。
13、權(quán)利要求1 2的方法，其中該鈉通道阻斷劑是吡唑啉。
14、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種煙酰乙酰膽堿結(jié)合劑。
15、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是γ-氨基丁酸能的結(jié)合劑。
16、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是真蛸胺(octapamine)的興奮劑或拮抗劑。
17、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑。
18、權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是結(jié)合到陽離子通道上的藥劑。
19、權(quán)利要求18的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種肽。
20、一種控制抗殺蟲劑的害蟲的方法，包括用重組昆蟲病毒處理所述害蟲或其活動(dòng)場(chǎng)所，結(jié)合應(yīng)用一定量的害蟲對(duì)其有抗性的殺蟲劑處理其活動(dòng)場(chǎng)所，該重組病毒能在所侵染的害蟲細(xì)胞中表達(dá)一種外源蛋白，殺蟲劑的用量不超過應(yīng)用于非抗性害蟲的量，將重組昆蟲病毒和殺蟲劑有效結(jié)合能提高殺死所述害蟲的速度。
21、權(quán)利要求20的方法，其中對(duì)所述抗性害蟲的殺死速度快于殺死對(duì)殺蟲劑沒有抗性的害蟲的速度。
22、權(quán)利要求20的方法，其中該昆蟲病毒是桿狀病毒。
23、一種治理抗殺蟲劑的害蟲的方法，包括確定一個(gè)殺蟲劑的第一量，害蟲對(duì)該殺蟲劑有抗性，所述的第一量要足以殺死至少約一半的昆蟲；以及對(duì)所述害蟲的活動(dòng)場(chǎng)所，用所述殺蟲劑按第二量用藥，結(jié)合重組桿狀病毒，該病毒能夠在所述害蟲的感染細(xì)胞中表達(dá)一種外源蛋白，所述第二量低于決定用量步驟中的第一量，而殺蟲劑和重組桿狀病毒結(jié)合使用殺死速度要快于單用殺蟲劑或桿狀病毒的殺死速度。
24、權(quán)利要求20或23的方法，其中該殺蟲劑是擬除蟲菊酯。
25、權(quán)利要求23的方法，其中該桿狀病毒是一種核型多角體病毒。
26、權(quán)利要求24的方法，其中該核型多角體病毒為苜蓿銀紋夜蛾(Autographa califonica)。
27、權(quán)利要求25的方法，其中該外源蛋白是一種昆蟲選擇性毒素。
28、權(quán)利要求26的方法，其中該毒素來源于Androctonus australis。
29、權(quán)利要求27的方法，其中該害蟲屬于斜紋夜蛾屬(Spodoptera)、Trichoplusia屬或棉鈴蟲屬(Hcliothis)。
30、權(quán)利要求27的方法，其中該害蟲是煙芽夜蛾(Heliothis virescens)或美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)。
31、權(quán)利要求29的方法，其中該殺蟲劑是擬除蟲菊酯。
32、權(quán)利要求1或5的方法，其中該殺死害蟲的速度快于理論上兩者結(jié)合的殺死時(shí)間C，其中，C是以下列關(guān)系式來定義1/C＝1/A+1/B，在此，A是重組昆蟲病毒在一特定濃度下的單個(gè)殺死時(shí)間，B是有機(jī)殺蟲劑在一特定濃度下的單個(gè)殺死時(shí)間。
33、權(quán)利要求5的方法，其中該桿狀病毒是能表達(dá)來源于Androctonusaustralis的毒素的苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒，而殺蟲劑為擬除蟲菊酯或乙酰膽堿酯酶抑制劑。
34、權(quán)利要求20的方法，其中該昆蟲病毒為苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒，它能表達(dá)來源于Androctonus australis的毒素，所述殺蟲劑為擬除蟲菊酯。
35、權(quán)利要求23的方法，其中該桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalfornica)核型多角體病毒，它能表達(dá)來源于Androctonus australis的毒素，所述殺蟲劑是擬除蟲菊酯。
權(quán)利要求
1.一種控制包括群聚昆蟲、蜱螨類和線蟲類害蟲的方法，包括采用重組昆蟲病毒和有機(jī)殺蟲劑相結(jié)合的方法處理所述害蟲或它們的活動(dòng)場(chǎng)所。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該重組昆蟲病毒在感染此病毒的害蟲細(xì)胞中表達(dá)一種外源蛋白，或者其功能性衍生物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該表達(dá)的外源蛋白或功能性衍生物是一種昆蟲毒素。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該昆蟲病毒是桿狀病毒。
5.權(quán)利要求4的方法，其中該桿狀病毒是核型多角體病毒。
6.權(quán)利要求5的方法，其中該桿狀病毒來自苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifonica)、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、油桐尺蠖(Buzura suppressuria)、蘋蠹蛾(Cvdiapomonella)、美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)、棉鈴蟲(Heliothis arrigera)、Mariestia brassicae、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera littoralis或Spodoptera litura。
7.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是鈉通道興奮劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中該鈉通道興奮劑是擬除蟲菊酯。
9.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑為乙酰膽堿酯酶抑制劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該乙酰膽堿酯酶抑制劑是有機(jī)磷酸鹽。
11.權(quán)利要求9的方法，其中該乙酰膽堿酯酶抑制劑是氨基甲酸酯。
12.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種鈉通道阻斷劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該鈉通道阻斷劑是吡唑啉。
14.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種煙酰乙酰膽堿結(jié)合劑。
15.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是γ-氨基丁酸能的結(jié)合劑。
16.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是真蛸胺(octapamine)的興奮劑或拮抗劑。
17.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是氧化磷酸化(oxphos)的解偶聯(lián)劑。
18.權(quán)利要求1或5的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是結(jié)合到陽離子通道上的藥劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該有機(jī)殺蟲劑是一種肽。
20.一種控制抗殺蟲劑害蟲的方法，包括用重組昆蟲病毒處理所述害蟲或其活動(dòng)場(chǎng)所，同時(shí)結(jié)合使用一定量的殺蟲劑處理害蟲的活動(dòng)場(chǎng)所，該害蟲對(duì)所用殺蟲劑具抗性。
21.權(quán)利要求20的方法，其中該殺蟲劑的量比可測(cè)定的致死劑量減少。該致死劑量是不使用病毒時(shí)的劑量。
22.權(quán)利要求20的方法，其中該昆蟲病毒是桿狀病毒。
23.一種治理抗殺蟲劑害蟲的方法，包括先確定一個(gè)害蟲對(duì)其有抗性的殺蟲劑的第一量，所述第一量要足以殺死至少約一半的昆蟲；以及對(duì)所述害蟲的活動(dòng)場(chǎng)所，按照預(yù)定的量用所述的殺蟲劑，結(jié)合重組桿狀病毒進(jìn)行處理，該第二量要比所述的測(cè)定步驟中的第一量低。
24.權(quán)利要求20或23的方法，其中該殺蟲劑是擬除蟲菊酯。
25.權(quán)利要求20、23或24的方法，其中該桿狀病毒是一種核型多角體病毒。
26.權(quán)利要求24的方法，其中該核型多角體病毒為苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)病毒。
27.權(quán)利要求25的方法，其中該重組桿狀病毒表達(dá)一種昆蟲選擇性毒素。
28.權(quán)利要求26的方法，其中該毒素來源于Androctonus australis。
29.權(quán)利要求27的方法，其中該害蟲屬于斜紋夜蛾屬(Spodoptera)、Tichoplusia屬或棉鈴蟲屬(Heliothis)。
30.權(quán)利要求27的方法，其中該害蟲為煙芽夜蛾(Heliothis virescens)或美洲棉鈴蟲(Heliocoverpa zea)。
31.權(quán)利要求29的方法，其中該殺蟲劑是擬除蟲菊酯。
全文摘要
昆蟲類害蟲可以采用重組病毒和有機(jī)殺蟲劑相結(jié)合的方法處理害蟲或其活動(dòng)場(chǎng)所而得到控制。重組病毒優(yōu)選為桿狀病毒。將重組的桿狀病毒與化學(xué)殺蟲劑相結(jié)合的方法，能在害蟲(如昆蟲)中產(chǎn)生劑量—反應(yīng)，其作用強(qiáng)于加性效應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)選治理方法是使用能表達(dá)一種外源蛋白或毒素的重組桿狀病毒和擬除蟲菊酯殺蟲劑。用本發(fā)明治理對(duì)擬除蟲菊酯有抗性的害蟲特別有效。
文檔編號(hào)A01N37/20GK1159143SQ95194902
公開日1997年9月10日 申請(qǐng)日期1995年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月5日
發(fā)明者布魯斯·D·哈莫克, 比利·F·麥卡琴 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)