一種百合脫毒籽球的快速培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了切花百合脫毒培養(yǎng)的組培方法和利用鼓泡式生物反應(yīng)器快速膨大脫毒小鱗莖(種球)的培養(yǎng)方法，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域和植物細胞工程的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]百合是重要的觀賞花卉，主要用于切花品種生產(chǎn)。百合在開放條件下生長，不可避免地被病毒侵染，百合無癥病毒Lily symptomless virus (LSV)、黃瓜花葉病毒Cucumbermosaic virus (CMV)、百合斑駁病毒LiIy mottle virus (LMoV)、郁金香碎花病毒Tulipbreaking virus (TBV)和百合叢族病毒Lily rosettle virus (LRV)是影響百合花齊生產(chǎn)的常見病毒。病毒侵染植株會造成百合農(nóng)藝性狀嚴重退化，極大地影響了百合的生產(chǎn)。寄生在百合鱗莖中的病毒，隨著鱗莖芽眼萌發(fā)長成植株的生長過程，病毒會在百合植株體內(nèi)進行復(fù)制繁殖，但在代謝活躍的莖尖分生組織中沒有病毒。百合脫毒技術(shù)就是利用莖尖部分沒有病毒的特性，在無菌環(huán)境條件下，利用人工配置的培養(yǎng)基，培育出無病毒試管苗或籽球，然后將組培苗和籽球在人工隔離或天然隔離條件下，生長成為供切花使用的商品種球。近年來國內(nèi)百合的消費量逐年增大，但目前我國百合生產(chǎn)中，將近90%以上的種球依賴進口。少量的國產(chǎn)脫毒種球的生產(chǎn)，絕大多數(shù)采用傳統(tǒng)組培方式，不但生產(chǎn)周期長，而且還需要投入大量的人力，頻繁的更換培養(yǎng)基，生產(chǎn)過程需要很大的培養(yǎng)空間，為了保證培養(yǎng)空間溫濕度，滿足培養(yǎng)條件需要消耗很多能源。為了解決國產(chǎn)脫毒種球生產(chǎn)中存在的問題，特開展利用生物反應(yīng)器快速培養(yǎng)百合脫毒籽球方法的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明包括:外植體滅菌和生長點的剝?nèi)?；脫毒培養(yǎng)；組培各階段培養(yǎng)基的配比；脫毒籽球在反應(yīng)器中的膨大培養(yǎng)；冷藏春化；馴化移栽幾個過程。本發(fā)明選用花卉市場大眾喜愛的“西伯利亞”(Siberia), “索幫”(Sorbonne), “馬可波羅”(Marco polo)，〃曼妮莎” (Manissa)，“康伽德奧” (Concad’ O) 5個品種為材料,采用綜合脫毒技術(shù),即將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法。優(yōu)化了脫毒百合種球組培培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)程序，快速培養(yǎng)得到脫毒組培籽球，縮短了百合脫毒優(yōu)質(zhì)種球的快繁時間，同時籽球的定植成活率較高。本發(fā)明易于在切花百合原種的規(guī)?；旆鄙a(chǎn)中推廣應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種百合脫毒籽球的快速培養(yǎng)方法方法，按如下步驟進行:
(I)百合種球的栽種:在35-38°C條件下種植百合種球，栽種后經(jīng)7-15天的培養(yǎng)，待芽長高葉集生莖的中部形似蓮座狀。
[0005](2)外植體滅菌和生長點的剝?nèi)?采集步驟⑴的百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0.1%升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍。外植體清洗干凈后，開始剝?nèi)∩L點，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點，生長點長度為0.4-0.8 (mm)，將剝?nèi)〉纳L點作為組培培養(yǎng)外植體。
[0006](3)脫毒培養(yǎng):將步驟(3)剝?nèi)〉耐庵搀w百合莖尖生長點接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4% 蔗糖 + 瓊脂粉 6g/L (pH 5.8))，經(jīng)過40-60天培養(yǎng)，生長點膨大成直徑2-3cm的葉叢。②將葉叢切成0.5cm小塊，接種于含病毒唑的培養(yǎng)基(MS+NAA0.2-0.5mg/L+4% 蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-10mg/L+ 瓊脂粉 5g/L+0.5%活性炭(pH5.8))，經(jīng)過40-60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。
[0007](4)病毒檢測:將步驟②瓶苗進行酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(ELISA)和RT-PCR檢測，確認無百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)病毒。
[0008](5)脫毒籽球誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟②經(jīng)過病毒檢測無病毒脫毒瓶苗轉(zhuǎn)移到籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4% 蔗糖 + 瓊脂粉 5g/L+0.5% 活性炭(pH 5.8))，在溫度22 士 1°C，光照強度1500LX，光照12h/d的環(huán)境條件下培養(yǎng)40_60d，直接誘導(dǎo)出脫毒籽球。
[0009](6)增殖培養(yǎng):將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑0.3-0.5cm材料,接種于和籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上,在溫度22 士 1°C,光照12h/d，光照強度1000-1500LX的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個月，可以擴繁3_4倍。
[0010](7)脫毒籽球的膨大培養(yǎng):將步驟(5)培養(yǎng)的組培籽球分開，形成單個的小籽球，大約直徑0.3-0.5cm,接種于籽球膨大培養(yǎng)基(MS+NAA 0.2-0.5mg/L+吡效隆CPPU l_4mg/L+6%蔗糖(pH 5.8))，在22 士 1°C，1500Lx 12h光照、12h黑暗條件下培養(yǎng)45天，培養(yǎng)籽球直徑可達1.0-1.4cm，根系在3-5條/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。
[0011](8)冷藏:取出步驟(6)培養(yǎng)的脫毒籽球，用清水沖洗掉培養(yǎng)液，包裹于消毒草炭中，經(jīng)3-4 1:冷藏處理30-40天打破休眠。
[0012](9)移栽馴化:將步驟(7)籽球取出，用2000倍阿米西達藥液浸泡籽球20分鐘，然后定植到80-90穴的穴盤中，穴盤基質(zhì):草炭I份、蛭石I份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤。定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤。放到網(wǎng)室內(nèi)養(yǎng)護，晝溫20-25°C，夜溫10-15°C，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養(yǎng)液。
[0013](10)待籽球直徑長到2cm以上，可選擇具夏季冷涼氣候的800?1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
【主權(quán)項】
1.一種百合脫毒籽球的快速培養(yǎng)方法，其特征在于，按如下步驟進行: (1)外植體滅菌和生長點的剝?nèi)?在35-38°C條件下種植百合種球，經(jīng)過7-15天的培養(yǎng)，待芽長高并綻開成蓮座狀，開始采集百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0.1%升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒；取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍；外植體清洗干凈后，開始剝?nèi)∩L點，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點，生長點長度為.0.4-0.8 (mm)，將剝?nèi)〉纳L點立即接種； (2)脫毒培養(yǎng):步驟①誘導(dǎo)培養(yǎng)，剝?nèi)〉陌俸锨o尖生長點接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4% 蔗糖 + 瓊脂粉 6g/L(pH 5.8))，經(jīng)過.40-60天培養(yǎng)，生長點膨大成直徑2-3 (cm)的葉叢； ②將葉叢切成0.5(em)小塊，接種于含病毒唑的培養(yǎng)基(MS+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-10mg/L+ 瓊脂粉 5g/L+0.5%活性炭(ρΗ5.8))，經(jīng)過 40-60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗； (3)病毒檢測:將步驟②瓶苗送到，農(nóng)業(yè)部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)，經(jīng)檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象并不帶百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)等病毒，才確認是百合脫毒種苗； (4)脫毒籽球誘導(dǎo)培養(yǎng):經(jīng)過病毒檢測，將步驟②脫毒瓶苗轉(zhuǎn)移到籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖 + 瓊脂粉 5g/L+0.5%活性炭(pH 5.8))，在溫度22土 1°C，光照強度1500LX，光照12h/d的環(huán)境條件下培養(yǎng)40_60d，直接誘導(dǎo)出脫毒籽球； (5)增殖培養(yǎng):將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑0.3-0.5cm材料,接種于和籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上，在溫度22± 1°C,光照12h/d，光照強度1000-1500LX的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個月，可以擴繁3_4倍； (6)脫毒籽球在生物反應(yīng)器內(nèi)液體培養(yǎng):將步驟(5)培養(yǎng)的組培籽球分開，形成單個的小籽球，大約直徑0.3-0.5cm,然后接種于反應(yīng)器內(nèi)；液體培養(yǎng)基(MS+NAA 0.2-0.5mg/L+吡效隆 CPPU l-4mg/L+6%蔗糖(pH 5.8))，在 22土rC、1500Lx 和 2L/min 通氣量條件下培養(yǎng)45天，培養(yǎng)籽球直徑可達1.0-1.4cm，根系在3_5條/粒，籽球重0.7-1.2g/粒; (7)冷藏:取出步驟(6)培養(yǎng)的脫毒籽球，用清水沖洗掉培養(yǎng)液，包裹于消毒草炭中，經(jīng)3-4°C冷藏處理30-40天打破休眠； (8)移栽馴化:將步驟(7)籽球取出，用2000倍阿米西達藥液浸泡籽球20分鐘，然后定植到80-90穴的穴簽中，穴盤基質(zhì):草炭I份、蛭石I份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤；定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤；放到網(wǎng)室內(nèi)養(yǎng)護，晝溫20-25°C，夜溫10-15°C，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養(yǎng)液； (9)待籽球直徑長到2cm以上，可選擇具夏季冷涼氣候的800?1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
【專利摘要】本發(fā)明公開了百合脫毒籽球的快速培養(yǎng)方法，即通過在？35-38℃條件熱處理栽種百合種球7-15？天、剝?nèi)崽幚砗蟀俸戏N球莖尖生長點為外植體，接種于病毒唑？(Ribavirin)？含量？5-10mg/L的培養(yǎng)基中脫毒培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(ELISA)？和？RT-PCR？檢測對脫毒組培苗進行百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒？(LMoV)？病毒病毒的檢測，此發(fā)明通過綜合脫毒技術(shù)確保培養(yǎng)出的百合籽球去除病毒感染，并優(yōu)化了脫毒百合種球組培培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)程序，快速培養(yǎng)得到脫毒組培籽球，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域和植物細胞工程領(lǐng)域技術(shù)。
【IPC分類】A01H4/00, A01G1/00
【公開號】CN105613283
【申請?zhí)枴緾N201410581640
【發(fā)明人】楊長能
【申請人】松桃宏發(fā)肉食品有限責(zé)任公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月27日