一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雌雄同體紫菜的雙單倍體群體組建的方法；取顏色差異明顯的雌雄同體紫菜葉狀體(配子體)作為雜交親本；將已形成精子囊的雙親葉狀體混合培養(yǎng)，收集果孢子；選取具萌發(fā)管的果孢子單獨(dú)培養(yǎng)成絲狀體(孢子體)；誘導(dǎo)并獲取該絲狀體的殼孢子，培養(yǎng)至肉眼可見的F1葉狀體，如90％以上的葉狀體是含有雙親顏色的嵌合體，則用于組建雙單倍體群體；分離四色塊嵌合體上的每個(gè)色塊，獲取每個(gè)色塊的單孢子或單離體細(xì)胞培養(yǎng)至肉眼可見的葉狀體，通過(guò)該葉狀體單棵培養(yǎng)和自體受精獲得每棵四色塊嵌合體上每個(gè)色塊的純系絲狀體，組成雙單倍體群體。本發(fā)明解決了雌雄同體紫菜雙單倍體群體的組建問(wèn)題，為其遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法?！颈尘凹夹g(shù)】[00〇2]雌雄同體紫菜中的條斑紫菜(Pyropia yezoensis)是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的大型食用海藻，在我國(guó)的長(zhǎng)江以北地區(qū)被廣泛栽培，每年創(chuàng)造約50億元的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)條斑紫菜的大規(guī)模栽培可轉(zhuǎn)移和固定大量的碳(防止海洋酸化)以及氮和磷(防止富營(yíng)養(yǎng)化)等元素， 對(duì)保持近海生態(tài)平衡具有十分重大的意義。條斑紫菜的栽培歷史長(zhǎng)達(dá)40余年，目前已形成了育苗、栽培、加工和銷售等完整的產(chǎn)業(yè)化體系，相反，對(duì)于其遺傳學(xué)等基礎(chǔ)理論研究一直處于相對(duì)不足的地步，目前仍未見條斑紫菜遺傳連鎖圖譜和物理圖譜的相關(guān)報(bào)道。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建是基因組研究中的重要環(huán)節(jié)，是基因定位與克隆、基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。目前，我國(guó)已構(gòu)建了一大批作物、林木及藥用植物的遺傳連鎖圖，如水稻、小麥、玉米等經(jīng)濟(jì)作物，為人們從分子水平認(rèn)識(shí)和了解植物特性與生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，進(jìn)行重要性狀的遺傳分析、分離和克隆重要基因等作出了重大貢獻(xiàn)。
[0003]海藻遺傳連鎖圖譜的相關(guān)研究起步較晚，目前已在海帶(Laminaria japonica)、 壇紫菜(Pyropia haitanensis)、裙帶菜(Undaria p innatifi da)和水云(Ec to carpus siliculosus)中有遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的報(bào)道。
[0004]條斑紫菜遺傳圖譜構(gòu)建過(guò)程中的難點(diǎn)就是雜交，因?yàn)闂l斑紫菜是雌雄同體的種類，在雜交的過(guò)程中，自體受精和異體受精同時(shí)進(jìn)行，且自體受精的概率要遠(yuǎn)高于異體受精，故在鑒定異體受精形成的雜合絲狀體時(shí)難度較大。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明涉及一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，所述方法包括如下步驟:
[0008]S1、選取葉狀體顏色差異明顯的雌雄同體紫菜葉狀體(配子體)作為雜交親本；
[0009]S2、選取已形成精子囊的雙親葉狀體混合培養(yǎng)，至雙親葉狀體上開始有果孢子囊的形成時(shí)，將雙親葉狀體分開單獨(dú)培養(yǎng)，直至各自葉狀體上的果孢子囊發(fā)育成熟，分別收集果孢子；[001 〇] S3、當(dāng)果孢子形成萌發(fā)管時(shí)，取單個(gè)萌發(fā)的果孢子單獨(dú)培養(yǎng)，使其萌發(fā)成一個(gè)單克隆的絲狀體(孢子體)藻落；
[0011]S4、培養(yǎng)所述單克隆的絲狀體藻落經(jīng)誘導(dǎo)后放散的殼孢子，至肉眼可見的？:葉狀體，在顯微鏡下觀察Fi葉狀體的顏色及色塊數(shù)量(可隨機(jī)選取1000棵以上的？:葉狀體)，如 90%以上的Fi葉狀體為含有雙親顏色的嵌合葉狀體且色塊數(shù)為2塊、3塊或4塊，則該單克隆的絲狀體藻落是由雙親雜交而成的雜合絲狀體，其FHf中有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體可用于構(gòu)建雙單倍體群體；[〇〇12]S5、從含有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體上分離單個(gè)色塊，取該色塊經(jīng)誘導(dǎo)后放散的單孢子或單離體細(xì)胞，培養(yǎng)至肉眼可見的葉狀體，取單棵培養(yǎng)，最終通過(guò)該單棵葉狀體自體受精獲得每棵四色塊嵌合葉狀體上每個(gè)色塊的純系絲狀體，從而組建成雙單倍體群體。
[0013]本發(fā)明中，用于雜交的雙親的葉狀體顏色必須差異較大，且用肉眼很容易區(qū)分的。 必須選擇四色塊嵌合體作為群體構(gòu)建的材料，防止破壞DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)，造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象。從嵌合葉狀體上分離的單個(gè)色塊不能直接用于雙單倍體群體的構(gòu)建，必須以該色塊的單孢子萌發(fā)的葉狀體或體細(xì)胞再生的葉狀體為材料，防止該色塊在從嵌合體上分離下來(lái)之前就可能與其它色塊發(fā)生受精，導(dǎo)致獲得的絲狀體是雜合的絲狀體。
[0014]上述步驟S2中，如一直混合培養(yǎng)至發(fā)育成熟，再收集果孢子則不可行，因?yàn)槿绻旌吓囵B(yǎng)至發(fā)育成熟，則親本a上的果孢子有可能釋放后粘附在親本b的葉狀體上，這樣在收集親本b的果孢子的時(shí)候可能會(huì)混有親本a的果孢子，導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果；因?yàn)闂l斑紫菜是雌雄同體的，雜交過(guò)程中每個(gè)親本葉狀體上既形成雄性配子，也能形成雌性配子，也就是說(shuō)每個(gè)親本葉狀體既可以做父本也可以做母本，所以在放散果孢子之前就要把雙親葉狀體分開，這樣的話，某棵葉狀體上放散的果孢子的母本就是該葉狀體，另一棵則是父本。[〇〇15] 優(yōu)選的，步驟S2中，已形成精子囊的雙親葉狀體是通過(guò)如下步驟獲得的:取親本絲狀體的藻段置于溫度25±l°c、光子通量密度20-30wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D的條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液為添加2 % (v/v)MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水，培養(yǎng)至50 %以上的營(yíng)養(yǎng)藻絲發(fā)育成熟，形成殼孢子囊枝;取出一半含有殼孢子囊枝的藻絲在溫度19土 1°C，光子通量密度40_ 50wii〇l nf2 ? jT1，光周期10L:14D的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為添加2%(v/v)MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水，至成熟殼孢子囊枝釋放殼孢子到培養(yǎng)液中；將含有殼孢子的培養(yǎng)液(用200目篩絹過(guò)濾獲得殼孢子懸浮液)，繼續(xù)培養(yǎng)至該殼孢子萌發(fā)的小葉狀體長(zhǎng)大，且至葉狀體稍部開始形成精子囊，即可。
[0016] 優(yōu)選的，步驟S2中，所述混合培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度19±1°C，光子通量密度40-50WI1O1 nf2 ? jT1，光周期10L:14D，培養(yǎng)液為添加2%MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水。[〇〇17]優(yōu)選的，步驟S2中，葉狀體上的果孢子囊發(fā)育成熟后，將葉狀體取出在室溫下陰干，再將葉狀體置于消毒海水中1.5?2.5h，刺激果孢子囊放散出果孢子;每天重復(fù)一次，直至收集到足夠數(shù)量的果孢子。
[0018]優(yōu)選的，步驟S3中，當(dāng)果孢子形成萌發(fā)管且萌發(fā)管的長(zhǎng)度達(dá)到果孢子直徑的3-5倍時(shí)，取單個(gè)萌發(fā)的果孢子進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。在果孢子形成萌發(fā)管且萌發(fā)管的長(zhǎng)度達(dá)到果孢子直徑的3-5倍時(shí)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，可極大提高獲得雜合果孢子的概率。
[0019]優(yōu)選的，步驟S4中，單克隆的絲狀體藻落經(jīng)誘導(dǎo)后放散殼孢子包括如下步驟:取單克隆的絲狀體藻落的藻段進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25?35d后取少量絲狀體，取該絲狀體的藻段置于溫度25±1°C、光子通量密度20-30圓〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D的條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至50%以上的營(yíng)養(yǎng)藻絲發(fā)育成熟，形成殼孢子囊枝;取出一半含有殼孢子囊枝的藻絲在溫度19±1°C，光子通量密度40-50圓〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D的條件下培養(yǎng)，至成熟殼孢子囊枝釋放殼孢子到培養(yǎng)液中，將含有殼孢子的培養(yǎng)液(用200目篩絹)過(guò)濾掉雜質(zhì)后，既得殼孢子。
[0020]優(yōu)選的，所述擴(kuò)大培養(yǎng)的過(guò)程為取絲狀體藻落，在消毒的塑料墊板上用消毒的單面刀片切碎，切碎后的藻段長(zhǎng)度以l-2mm為宜，將所有藻段轉(zhuǎn)移到含有100ml培養(yǎng)液的三角燒瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，條件為溫度19±1°C、光子通量密度40-50wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D，靜置培養(yǎng)。
[0021]優(yōu)選的，步驟S5中，挑選含有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體單獨(dú)培養(yǎng)，當(dāng)某一色塊長(zhǎng)至 0.8?1.2cm長(zhǎng)時(shí)，將其切下單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)其放散單孢子，如該色塊經(jīng)誘導(dǎo)仍無(wú)單孢子放散，則將該色塊用海螺酶液處理獲得單離體細(xì)胞。
[0022]優(yōu)選的，步驟S5中，所述單孢子或單離體細(xì)胞在萌發(fā)至0.8?1.2cm時(shí)，進(jìn)行單棵培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選的，所述雌雄同體紫菜為條斑紫菜。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0025]1、本發(fā)明解決了雌雄同體的條斑紫菜葉狀體的雜交及雜合絲狀體的鑒定等細(xì)節(jié)問(wèn)題，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了條斑紫菜遺傳圖譜的作圖群體一雙單倍體群體；
[0026]2、目前沒有公開資料報(bào)道雌雄同體紫菜一條斑紫菜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，而作圖群體的構(gòu)建是遺傳圖譜構(gòu)建的基礎(chǔ)，通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建雌雄同體紫菜雙單倍體群體，從而為構(gòu)建雌雄同體紫菜(如，條斑紫菜)遺傳連鎖圖譜奠定基礎(chǔ)。[〇〇27]3、遺傳連鎖圖譜能指導(dǎo)基因組的大規(guī)模組裝，同時(shí)也能定位重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTLs位點(diǎn)，為克隆重要功能基因奠定基礎(chǔ)，故本發(fā)明是條斑紫菜基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)。
[0028]4、目前無(wú)公開資料報(bào)道條斑紫菜全基因組的完整圖譜，本發(fā)明的成果將為全基因組的大規(guī)模組裝提供有力工具?！靖綀D說(shuō)明】[〇〇29]圖1為條斑紫菜野生色品系PY-LS及紅色突變品系PY-HT的葉狀體(日齡30d，標(biāo)尺 5cm)；
[0030]圖2為條斑紫菜果孢子沉底后萌發(fā)成的絲狀體藻落；
[0031]圖3為條斑紫菜具有雙親顏色組合的嵌合葉狀體幼苗；
[0032]圖4為條斑紫菜嵌合葉狀體四個(gè)色塊的絲狀體；
[0033]圖5為條斑紫菜四色塊顏色嵌合體。【具體實(shí)施方式】[〇〇34]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]實(shí)施例
[0036]1.1條斑紫菜雜交親本葉狀體(配子體)的選擇和培養(yǎng)[〇〇37]作為雜交親本的條斑紫菜應(yīng)具有明顯的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，一般選擇具有肉眼可明顯區(qū)分的顏色不同的藻體，本方案以條斑紫菜野生色品系PY-LS(圖1，左圖)及紅色突變品系PY-HT(圖1，右圖)為例進(jìn)行說(shuō)明。除此以外，在考慮親本間多態(tài)性差異與可育性的同時(shí)，應(yīng)盡量選取親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)、遺傳差異性大和分子標(biāo)記多態(tài)性強(qiáng)的材料作為雜交親本，以利于開展優(yōu)良性狀基因的定位和克隆。
[0038]稱取100mg濕重的親本絲狀體(孢子體)，置消毒的塑料墊板上，用消毒的單面刀片切碎成短的藻段，長(zhǎng)度在1mm左右，轉(zhuǎn)移至直徑為90mm的玻璃培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，以畫十字的方式搖勾，使藻段在皿內(nèi)均勾分布。將含有藻段的培養(yǎng)皿置于溫度25± 1°C、光子通量密度20-30wii〇l nf2 ? jT1，光周期10L:14D的條件下靜置培養(yǎng)。每隔5d檢查發(fā)育情況，約30d左右，可見50 %以上的營(yíng)養(yǎng)藻絲發(fā)育成熟，形成殼孢子囊枝。[〇〇39]用鑷子從培養(yǎng)皿中取出一半的藻絲，放入含有200ml消毒海水的充氣瓶中培養(yǎng)，另外放入一股維尼綸繩(長(zhǎng)3-4cm)供殼孢子附著，培養(yǎng)溫度19土 TC，光子通量密度40-50mi〇1 nf2 ? s'光周期10L:14D。在較低溫度的刺激下，成熟殼孢子囊枝進(jìn)一步形成雙分孢子，釋放到培養(yǎng)液中即殼孢子，殼孢子在水流的作用下附著到維尼綸繩上。取出附著殼孢子的維尼綸繩移至新的充氣瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。殼孢子在維尼綸繩上萌發(fā)，約30d時(shí)長(zhǎng)至lcm左右的小葉狀體，將其從維尼綸繩上摘下繼續(xù)充氣培養(yǎng)，至40d時(shí)選取健康完整且未成熟的葉狀體進(jìn)行單棵培養(yǎng)，培養(yǎng)至葉狀體稍部開始形成精子囊。所用培養(yǎng)液均為富含MES營(yíng)養(yǎng)鹽的消毒海水 (王素娟，張小平，徐志東，等.壇紫菜營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究.海洋與湖沼， 1986.17(3): 217-221 ?)，每5d更換一半的培養(yǎng)液。
[0040] 1.2條斑紫菜葉狀體的雜交及果孢子的收集[〇〇411挑選健康的已形成精子囊的雙親葉狀體(PY-LS和PY-HT)各1棵，置含有500ml消毒海水的充氣瓶中混合培養(yǎng)，使二者雜交，培養(yǎng)溫度19±1°C，光子通量密度40-50wii〇l nf2 ? s<，光周期10L:14D。條斑紫菜葉狀體的雌性生殖細(xì)胞果胞的形成稍晚于精子囊的形成，且二者混合發(fā)育，故作為雜交親本的條斑紫菜葉狀體同時(shí)能夠釋放精子作為父本，同時(shí)也能接受精子作為母本，即自體受精和異體受精同時(shí)發(fā)生。同時(shí)，果胞常在成片精子囊的邊緣形成，故自體受精的概率要遠(yuǎn)高于異體受精。[〇〇42]混合培養(yǎng)的過(guò)程中，每隔2天觀察雙親葉狀體上果孢子囊的形成，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有大量果孢子囊形成時(shí)，將雙親葉狀體分開，分別用不同的充氣瓶單獨(dú)培養(yǎng)，直至各自葉狀體上的果孢子囊發(fā)育成熟。將葉狀體取出用吸水紙吸干表面水分，在室溫下陰干葉狀體約30min，再將葉狀體置于含有50ml消毒海水的培養(yǎng)皿中，刺激果孢子囊放散出果孢子，2h后將葉狀體放回充氣瓶中培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置倒置顯微鏡下檢查是否有果孢子放散，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有果孢子放散時(shí)，用吸管吹打使放散的果孢子在培養(yǎng)皿內(nèi)均勻分布，并靜置培養(yǎng)。每天重復(fù)一次，直至收集到足夠數(shù)量的果孢子。
[0043] 1.3條斑紫菜果孢子和絲狀體的培養(yǎng)
[0044]在果孢子的培養(yǎng)過(guò)程中，每天鏡檢其萌發(fā)情況，當(dāng)觀察到果孢子形成萌發(fā)管且萌發(fā)管的長(zhǎng)度達(dá)到果孢子直徑的3-5倍時(shí)，用自制的玻璃毛細(xì)管(管徑30-50M1)將單個(gè)萌發(fā)的果孢子吸出并在含有15ml消毒海水的玻璃試管(15 X 200mm)中單獨(dú)培養(yǎng)，使其萌發(fā)成一個(gè)單克隆的絲狀體藻落。為了確保每次只吸出一個(gè)萌發(fā)的果孢子，可將吸出的液體吹到載玻片上，在顯微鏡下檢查。同時(shí)為了防止交叉污染，每吸一次應(yīng)更換新的玻璃毛細(xì)管，確保每個(gè)試管中長(zhǎng)成的絲狀體藻落是單克隆的。將含有萌發(fā)果孢子的試管放在試管架上靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2,期間不更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)30d左右仔細(xì)觀察可見果孢子在萌發(fā)形成的分枝絲狀體，繼續(xù)培養(yǎng)至50d時(shí)會(huì)形成一個(gè)直徑3-5mm的藻落。絲狀體藻落在試管中的生長(zhǎng)有三種類型，包括貼壁、沉底(圖2)或漂浮在液面上。
[0045]1.4條斑紫菜雜合絲狀體的分離與鑒定
[0046]自體受精后放散的果孢子和異體受精后放散的雜合果孢子在形態(tài)和大小方面均無(wú)法用肉眼區(qū)分，故用玻璃毛細(xì)管吸取單個(gè)果孢子的時(shí)候只能隨機(jī)取樣。兩種果孢子萌發(fā)成的絲狀體在顏色上會(huì)出現(xiàn)區(qū)別。如果雜交親本為野生色的PY-LS和紅色的PY-HT，因?yàn)橐吧鄬?duì)于紅色是顯性，那么從PY-HT葉狀體上放散的雜合果孢子會(huì)萌發(fā)成野生色的雜合絲狀體(顏色同PY-LS的絲狀體)，而純合果孢子會(huì)萌發(fā)成紅色的純合絲狀體(顏色同PY-HT 的絲狀體)；如果從PY-LS葉狀體上收集的果孢子，無(wú)論是雜合的還是純合的，均萌發(fā)成野生色的絲狀體藻落。[〇〇47]為了進(jìn)一步驗(yàn)證，需將待驗(yàn)證的雜合絲狀體藻落從試管中取出，用鑷子輕輕將藻落撕碎，并轉(zhuǎn)移到含有50ml培養(yǎng)液的三角燒瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2，約30d左右取少量絲狀體，按照1.1的方法獲得待驗(yàn)證雜合絲狀體的殼孢子。不同之處在于，僅放一根長(zhǎng)約 lcm的維尼綸繩，其目的是為了檢測(cè)是否放散殼孢子。當(dāng)殼孢子開始放散時(shí)，每天早上11: 00-11:30分將培養(yǎng)液用200目的篩絹過(guò)濾，殼孢子會(huì)通過(guò)篩絹上的微孔，而絲狀體則被阻擋在篩絹上。將過(guò)濾收集到的殼孢子在直徑90mm的培養(yǎng)皿中靜置培養(yǎng)，使殼孢子基部附著在皿底生長(zhǎng)。篩絹上的絲狀體則被放回至充氣瓶中，繼續(xù)刺激其放散殼孢子。[0〇48]殼孢子在培養(yǎng)皿中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2,期間每周更換一半培養(yǎng)液。培養(yǎng)30d 左右肉眼可見殼孢子萌發(fā)的葉狀體，長(zhǎng)度約5mm。挑出葉狀體置于載玻片上用顯微鏡檢查， 記錄嵌合體的類型及數(shù)量。如果發(fā)現(xiàn)90%以上的葉狀體為含有雙親顏色的嵌合葉狀體(圖 3)，則說(shuō)明該絲狀體為雜合絲狀體，可用于雙單倍體群體的構(gòu)建。
[0049]1.5條斑紫菜雙單倍體群體的構(gòu)建
[0050]挑選含有4個(gè)色塊的？:嵌合葉狀體，每棵嵌合葉狀體用單獨(dú)的一個(gè)充氣瓶培養(yǎng)，條件同1.2。當(dāng)嵌合葉狀體上的某一色塊長(zhǎng)至約lcm長(zhǎng)時(shí)，將其切下單獨(dú)培養(yǎng)，同時(shí)放入一股 3cm長(zhǎng)的維尼綸繩供單孢子附著。如果該色塊不放散單孢子，則將其葉狀體用海螺酶液處理獲得單離體細(xì)胞(嚴(yán)興洪，劉新軼，張善霹.條斑紫菜葉狀體細(xì)胞的發(fā)育與分化.水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2004(02): 145-154.)。將上述單孢子或單離體細(xì)胞在其萌發(fā)至lcm左右時(shí)，再次單棵培養(yǎng)， 最終通過(guò)自體受精獲得每棵嵌合葉狀體上每個(gè)色塊的純合絲狀體(品系)，方法同1.3，從而構(gòu)建成雙單倍體群體(圖4)。
[0051]選擇4色塊嵌合葉狀體作為構(gòu)建雙單倍體群體的原因:條斑紫菜的絲狀體是二倍的孢子體，放散的殼孢子也是二倍體，殼孢子最初的兩次分裂是減數(shù)分裂，形成四個(gè)減數(shù)分裂子細(xì)胞不分離的四分子體，條斑紫菜葉狀體則是由四個(gè)單倍體細(xì)胞繼續(xù)分裂形成的嵌合葉狀體，但是在實(shí)際的發(fā)育過(guò)程中，四個(gè)細(xì)胞不一定都能夠正常發(fā)育形成4色塊的嵌合體， 故組成F1嵌合葉狀體的色塊數(shù)量從1-4不等。只有選擇4色塊的嵌合體，才能將減數(shù)分裂產(chǎn)生的不同基因型全部包含在雙單倍體群體中，選擇少于4個(gè)色塊的嵌合體會(huì)導(dǎo)致某些不能正常發(fā)育的基因型的消失，從而破壞雙單倍體群體的遺傳結(jié)構(gòu)，有可能造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，影響遺傳作圖的準(zhǔn)確性。在壇紫菜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建過(guò)程中，偏分離的分子標(biāo)記高達(dá)29.3 %，其原因可能是沒有選擇4色塊嵌合體作為構(gòu)建群體的材料(從50個(gè)F1嵌合葉狀體上分離到166 個(gè)色塊)(Xie，C.，C.Chen，Y.Xu,等.Construct1n of a genetic linkage map for Porphyra haitanensis(Bangiales,Rhodophyta)based on sequence-relatedamplified polymorphism and simple sequence repeat markers.Journal of Phycology，2010 ? 46(4): 780-787 ?)，平均每個(gè)嵌合體有3 ? 3個(gè)色塊。
[0052]雙單倍體群體各品系的命名原則:嵌合體編號(hào)+色塊編號(hào)+色塊顏色，嵌合體編號(hào)為1-50或以上，表示含有4個(gè)色塊的F1嵌合體的編號(hào);色塊編號(hào)按照嵌合葉狀體上4個(gè)色塊從基部到稍部的線性排列順序，編號(hào)1-4,色塊1位于嵌合葉狀體的基部，色塊4位于嵌合葉狀體的稍部;色塊顏色用字母表示，W為與PY-LS—樣的野生色，R為與PY-HT—樣的紅色，W’ 和R’分別為重組后形成的重組色。如果某個(gè)品系的編號(hào)為36-3R，則表示該品系來(lái)自挑選的第36棵4色塊嵌合葉狀體，該色塊在嵌合體上的位置位于從下往上數(shù)的第3塊，R代表該色塊的顏色為紅色(圖5)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:51、選取葉狀體顏色差異明顯的雌雄同體紫菜葉狀體作為雜交親本；52、選取已形成精子囊的雙親葉狀體混合培養(yǎng)，至雙親葉狀體上開始有果孢子囊的形 成時(shí)，將雙親葉狀體分開單獨(dú)培養(yǎng)，直至各自葉狀體上的果孢子囊發(fā)育成熟，分別收集果孢 子；53、當(dāng)果孢子形成萌發(fā)管時(shí)，取單個(gè)萌發(fā)的果孢子單獨(dú)培養(yǎng)，使其萌發(fā)成一個(gè)單克隆的 絲狀體藻落；54、培養(yǎng)所述單克隆的絲狀體藻落經(jīng)誘導(dǎo)后放散的殼孢子，至肉眼可見的？:葉狀體，顯 微鏡下觀察Fi葉狀體的顏色及色塊數(shù)量，如90%以上的Fi葉狀體為含有雙親顏色的嵌合葉 狀體且色塊數(shù)為2塊、3塊或4塊，則該單克隆的絲狀體藻落是由雙親雜交而成的雜合絲狀 體，其^代中有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體可用于構(gòu)建雙單倍體群體；55、從含有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體上分離單個(gè)色塊，取該色塊經(jīng)誘導(dǎo)后放散的單孢子 或單離體細(xì)胞，培養(yǎng)至肉眼可見的葉狀體，取單棵培養(yǎng)，最終通過(guò)該單棵葉狀體自體受精獲 得每棵四色塊嵌合葉狀體上每個(gè)色塊的純系絲狀體，從而組建成雙單倍體群體。2.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S2 中，已形成精子囊的雙親葉狀體是通過(guò)如下步驟獲得的:取親本絲狀體的藻段置于溫度25 ±1°C、光子通量密度20-30wii〇l m—2 ? s—S光周期10L:14D的條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液為添 加2 %MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水，培養(yǎng)至50 %以上的營(yíng)養(yǎng)藻絲發(fā)育成熟，形成殼孢子囊枝;取出 一半含有殼孢子囊枝的藻絲在溫度19±1°C，光子通量密度40-50wii〇lm—2 ? s—I光周期10L: 14D的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為添加2 %MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水，至成熟殼孢子囊枝釋放殼孢子 到培養(yǎng)液中；將含有殼孢子的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至該殼孢子萌發(fā)的小葉狀體長(zhǎng)大，且至葉狀 體稍部開始形成精子囊，即可。3.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S2 中，所述混合培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度19±1°C，光子通量密度40-50mi〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D， 培養(yǎng)液為添加2 % MES營(yíng)養(yǎng)液的消毒海水。4.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S2 中，葉狀體上的果孢子囊發(fā)育成熟后，將葉狀體取出在室溫下陰干，再將葉狀體置于消毒海 水中1.5?2.5h，刺激果孢子囊放散出果孢子;每天重復(fù)一次，直至收集到足夠數(shù)量的果孢 子。5.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S3 中，當(dāng)果孢子形成萌發(fā)管且萌發(fā)管的長(zhǎng)度達(dá)到果孢子直徑的3-5倍時(shí)，取單個(gè)萌發(fā)的果孢子 單獨(dú)培養(yǎng)。6.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S4 中，單克隆的絲狀體藻落經(jīng)誘導(dǎo)后放散殼孢子包括如下步驟:取單克隆的絲狀體藻落的藻 段進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25?35d后取少量絲狀體，取該絲狀體的藻段置于溫度25 ± 1°C、光子通量 密度20-30圓〇1 nf2 ? jT1，光周期10L:14D的條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至50%以上的營(yíng)養(yǎng)藻絲 發(fā)育成熟，形成殼孢子囊枝;取出一半含有殼孢子囊枝的藻絲在溫度19±1°C，光子通量密 度40-50wi1l nf2 ? s'光周期10L:14D的條件下培養(yǎng)，至成熟殼孢子囊枝釋放殼孢子到培 養(yǎng)液中，過(guò)濾除雜后既得殼孢子。7.如權(quán)利要求6所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，所述擴(kuò)大 培養(yǎng)的過(guò)程為取絲狀體藻落，在消毒的塑料墊板上用消毒的單面刀片切碎，切碎后的藻段 長(zhǎng)度以l-2mm為宜，將所有藻段轉(zhuǎn)移到含有100ml培養(yǎng)液的三角燒瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，條件為溫 度19±1°C、光子通量密度40-50wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D，靜置培養(yǎng)。8.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S5 中，挑選含有四個(gè)色塊的嵌合葉狀體單獨(dú)培養(yǎng)，當(dāng)某一色塊長(zhǎng)至0.8?1.2cm長(zhǎng)時(shí)，將其切下 單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)其放散單孢子，如該色塊經(jīng)誘導(dǎo)仍無(wú)單孢子放散，則將該色塊用海螺酶液 處理獲得單離體細(xì)胞。9.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，步驟S5 中，所述單孢子或單離體細(xì)胞在萌發(fā)至0.8?1.2cm時(shí)，進(jìn)行單棵培養(yǎng)。10.如權(quán)利要求1所述的雌雄同體紫菜雙單倍體群體組建的方法，其特征在于，所述雌 雄同體紫菜為條斑紫菜。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK106069717SQ201610429722
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】黃林彬, 嚴(yán)興洪
【申請(qǐng)人】上海海洋大學(xué)