專利名稱：用于確認(rèn)靶和途徑有效/無效的方法
背景技術(shù)：
在過去數(shù)年進(jìn)行的基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究已經(jīng)確立了興奮性氨基酸(EAA)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞質(zhì)例如谷氨酸和天門冬氨酸與各種病理學(xué)狀態(tài)例如中風(fēng)和CNS創(chuàng)傷之間的關(guān)系。例如，腦局部缺血、中風(fēng)或創(chuàng)傷后的神經(jīng)組織變性的主要機(jī)制似乎涉及大腦內(nèi)EAA系統(tǒng)的過度激活，即，谷氨酸鹽和天門冬氨酸鹽的過度釋放。該過程稱為延遲的興奮性毒性，某些神經(jīng)細(xì)胞群選擇性地對興奮性毒性敏感。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，腺苷還具有抑制突觸前EAA釋放的活性，從而可以減弱其興奮性毒性，因此，它的釋放將會(huì)嚴(yán)重干擾該系統(tǒng)的靶確認(rèn)研究。由于腺苷的作用通常是由細(xì)胞外受體介導(dǎo)的，因此，腺苷的藥理學(xué)相關(guān)的集合體是在細(xì)胞外的。腺苷還具有神經(jīng)-行為作用，并起CNS抑制劑的作用，也就是說可以抑制神經(jīng)活性。它還是天然的抗驚厥劑和鎮(zhèn)靜劑。新的研究表明，在正常情況下，腺苷可以促進(jìn)睡眠，因此可以干擾涉及睡眠相關(guān)性反應(yīng)的途徑，例如睡眠呼吸暫停。有越來越多的證據(jù)表明腺苷是一種重要的“疲勞因子”，并且可以干擾對支撐睡眠周期的分子的確認(rèn)研究。例如，在大腦中，研究表明關(guān)鍵受體位于大腦喚醒網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞上。一些科學(xué)家確信，腺苷可以通過靶向于大腦內(nèi)的喚醒網(wǎng)絡(luò)例如膽堿能系統(tǒng)如刺激睡眠的膽堿能基底前腦和mesopontine膽堿能核來促進(jìn)睡眠。所有這些腺苷的作用均會(huì)干擾在它起作用的系統(tǒng)和途徑中的靶確認(rèn)研究。
因此，非常需要能夠迅速、有效地篩選大量基因及其表達(dá)產(chǎn)物的方法，以確定其功能，從而確定其在設(shè)計(jì)用于治療與靶基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)的疾病和病癥的治療劑中的用途。此外，還需要適于測試單個(gè)基因的功能并同時(shí)避免激發(fā)可能會(huì)使對結(jié)果的解釋變得困難的其它基因功能的方法。
以下將參照具體的附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易從說明書中看出本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。
本發(fā)明的圖2證實(shí)了是含有腺苷(A)而不是那些不含腺苷(脫A)的寡核苷酸(oligos)可以釋放有生物活性的腺苷。釋放的腺苷激活腺苷受體并引起生物學(xué)響應(yīng)，該生物學(xué)響應(yīng)會(huì)干擾準(zhǔn)備在靶確認(rèn)研究中進(jìn)行觀察的信號。向患有哮喘的兔子施用兩種21-聚體的隨機(jī)硫代磷酸反義寡核苷酸(oligos)，一種含有腺苷(三角形)，一種是脫A寡核苷酸(圓圈)。含有腺苷的寡核苷酸引起氣道伸縮率的明顯降低，反應(yīng)了A受體活性，而脫A隨機(jī)寡核苷酸沒有影響。
圖3和4證實(shí)了反義寡核苷酸可以有效地確認(rèn)與肺或氣道疾病有關(guān)的靶有效。圖3說明了對腺苷A1受體反義的寡核苷酸以及錯(cuò)配對照反義寡核苷酸在兔模型中對支氣管動(dòng)態(tài)伸縮率的影響。圖3說明了對腺苷A1受體反義的寡核苷酸的特異性，由A1腺苷受體反義寡核苷酸治療的氣道組織中存在的A1和A2腺苷受體的數(shù)量表示。
參照如下優(yōu)選實(shí)施方案的描述，將可以更好地理解本發(fā)明。
本文所描述的研究工作以及實(shí)施例中所討論的結(jié)果清楚地表明，通過將本發(fā)明的方法應(yīng)用于新靶點(diǎn)(當(dāng)其被發(fā)現(xiàn)時(shí))和/或已知靶點(diǎn)(當(dāng)將其與其功能相關(guān)聯(lián)時(shí))，成功地實(shí)現(xiàn)了確認(rèn)靶的有效。實(shí)驗(yàn)性研究還證實(shí)，當(dāng)采用特異性靶向的非磷酸二酯反義寡核苷酸時(shí)，通過抗衡或減弱由靶蛋白介導(dǎo)的作用，本發(fā)明的方法在確認(rèn)靶有效/無效時(shí)是高度選擇性和有效的。對于所有靶向腺苷A1受體mRNA的反義寡核苷酸、靶向腺苷A2b受體mRNA的1反義寡核苷酸、靶向A3受體mRNA的2反義寡核苷酸、靶向緩激肽受體的1反義寡核苷酸，證實(shí)可以通過外源性給藥腺苷來消除由特異性腺苷受體介導(dǎo)的抗衡作用。此外，本發(fā)明的方法在確認(rèn)特定選擇的靶有效/無效時(shí)是特異性的，不能抑制其它靶點(diǎn)，如靶向于腺苷A1和緩激肽基因以及mRNA的反義寡核苷酸所示。此外，結(jié)果表明，采用低腺苷含量或不含腺苷的寡核苷酸的本發(fā)明的方法只產(chǎn)生非常低的、或者完全沒有不利副作用或毒性。這表示在提供高度有效和特異性的確認(rèn)靶有效的方法時(shí)是100％成功的，例如在呼吸系統(tǒng)中所證實(shí)的。本發(fā)明可以相同的方式廣泛應(yīng)用于編碼涉及或與氣道疾病有關(guān)的呼吸/肺系統(tǒng)蛋白的所有基因和相應(yīng)的mRNA以及與特定的疾病或病癥(所述疾病或病癥可能與特定的功能或終點(diǎn)例如CNS有關(guān))有關(guān)的其它系統(tǒng)的靶點(diǎn)。還用磷酸二酯寡核苷酸以及其中的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵代替了的同種寡核苷酸對本發(fā)明的方法進(jìn)行了比較。應(yīng)用本發(fā)明方法的結(jié)果表明，比磷酸二酯寡核苷酸有出人意料的優(yōu)越性。因此，高腺苷含量(33％)的反義寡核苷酸不適于獲得明確的靶確認(rèn)數(shù)據(jù)，因?yàn)樗鼈兊慕到鈺?huì)引起多效的腺苷-介導(dǎo)的作用。本發(fā)明的方法所使用的低腺苷低聚物顯然沒有這些副作用。本發(fā)明描述了一種可用于進(jìn)行明確的“確認(rèn)靶有效”的方法，該方法可用于例如呼吸道或肺系統(tǒng)、CNS以及腺苷的釋放會(huì)引起多效作用的其它器官或系統(tǒng)。該方法涉及使用低A或脫A反義寡核苷酸，即具有低A含量或不含腺苷的寡核苷酸，從而不會(huì)在降解時(shí)釋放大量具有明顯生物活性的腺苷。本發(fā)明的方法可用于基本上所有的基因，但特別適用于如下基因子集G蛋白偶聯(lián)受體、神經(jīng)激素受體、神經(jīng)肽受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、G蛋白、鈣通道蛋白、鈉通道蛋白、鉀通道受體、氯通道受體，也就是說在正?；蛴屑膊〉腃NS、心臟、肺、腎、血液、免疫系統(tǒng)中表達(dá)的基本上所有的基因以及如下所列的基因。因此，本發(fā)明所描述的確認(rèn)方法不僅可用于本文所述的基因和系統(tǒng)，而且還可用于其它基因?qū)俸蛠唽僖约盎蚓W(wǎng)絡(luò)。
成功的藥物開發(fā)程序取決于迅速、準(zhǔn)確地評估候選基因產(chǎn)物作為藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的適宜程度。以前，該過程需要耗費(fèi)相當(dāng)長的時(shí)間以及人力和財(cái)力資源。本發(fā)明提供了迅速、可信的在各種生物學(xué)系統(tǒng)中確認(rèn)靶有效/無效的方法，該方法使用專有的低或脫腺苷反義寡核苷酸(本文統(tǒng)稱為脫A-ASON)。使用脫A-ASON，本發(fā)明的方法可以以用傳統(tǒng)的技術(shù)無法達(dá)到速度和準(zhǔn)確度確認(rèn)潛在的基因靶點(diǎn)有效/無效。脫A-ASON提供了比傳統(tǒng)的方法更高的準(zhǔn)確度和速度水平。脫A-ASON不能降解和釋放會(huì)通過引起腺苷誘導(dǎo)的副作用而干擾靶確認(rèn)的具有生物活性的腺苷。在ASON中，有一個(gè)亞組是用于呼吸給藥的，在此稱為RASON。本發(fā)明人用脫A-RASON進(jìn)行了本發(fā)明的方法以確認(rèn)腺苷A1、A2和A3靶有效。本發(fā)明的方法還可在位點(diǎn)特異性的功能基因消除后，用于大腦任何區(qū)域內(nèi)的涉及生物化學(xué)、行為學(xué)、生理學(xué)評估的CNS靶點(diǎn)，該方法使用脫A-BASON、即不能降解釋放腺苷的反義寡核苷酸(在腦內(nèi)原位給藥)，它是大腦生理學(xué)的主要調(diào)節(jié)劑。除了確認(rèn)肺靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)性有效外，用CNS相關(guān)靶點(diǎn)說明了本發(fā)明的方法，通常包括用脫A反義寡核苷酸進(jìn)行多步驟的靶確認(rèn)。
開始的步驟需要識(shí)別用于靶確認(rèn)的全身系統(tǒng)或區(qū)域，例如CNS、呼吸系統(tǒng)、腎、心臟區(qū)域等。然后，利用公共的文庫例如GenBank或其它公有的文庫或私人文庫例如特定公司所專有的文庫。例如，包含有記載于公共和私人數(shù)據(jù)庫中的所有G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的特定文庫。目前存在有大約250個(gè)GPCR。因此，本發(fā)明的靶確認(rèn)方法適用于測試在將選定的一組靶例如GPCR用適宜的脫A反義寡核苷酸弱化時(shí)，會(huì)發(fā)生什么樣的生理學(xué)、生物物理學(xué)、生物學(xué)、行為學(xué)等事件。為此，按照如下描述設(shè)計(jì)并合成脫A反義寡核苷酸用于預(yù)先選擇的靶基因，例如上述的GPCR。然后將脫A反義寡核苷酸進(jìn)行測試，首先是體外測試，例如使用適宜的細(xì)胞系、初級細(xì)胞培養(yǎng)物或其它細(xì)胞組織。所述體外測試可用于確定所設(shè)計(jì)的多種針對特異性靶的脫A反義寡核苷酸中哪些是“活性最強(qiáng)的”反義物質(zhì)。也就是說，哪一種可以最佳地向下調(diào)節(jié)或消除基因表達(dá)。這可以用生物物理學(xué)、生物學(xué)、生理學(xué)試驗(yàn)或其它可與細(xì)胞的特定活性相關(guān)聯(lián)的試驗(yàn)來進(jìn)行。在其它情況下，在體外系統(tǒng)中剔除靶基因本身就可以提供有用的靶確認(rèn)信息。然后選出活性最強(qiáng)的脫A反義寡核苷酸并進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用，例如直接滴注到大腦的各個(gè)區(qū)域進(jìn)行CNS研究、給藥到與呼吸系統(tǒng)有關(guān)的肺靶點(diǎn)等。這可以通過本領(lǐng)域已知的方法來完成，例如，對于大腦的靶點(diǎn)，通過立體定位地植入插管；對于呼吸靶點(diǎn)，通過吸入給藥；對于血液靶點(diǎn)，通過全身性給藥；對于器官和其它局部系統(tǒng)以及實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血管心臟細(xì)胞，通過原位給藥；對于腎靶點(diǎn)，通過吸入或直接滴注進(jìn)行全身性給藥?？梢圆捎眯袨閷W(xué)、生物物理學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)和其它試驗(yàn)，并通過施用適宜的反義寡核苷酸以消除一種或多種靶基因而在各動(dòng)物中獲得數(shù)據(jù)。行為學(xué)功能或終點(diǎn)例如食物攝取、焦慮、性沖動(dòng)、認(rèn)知等，或者生理學(xué)終點(diǎn)例如溫度、腦電圖(ECG)、心電圖(EKG)、腎小球過濾體積和含量、離子潴留、蛋白損失等，可以通過本領(lǐng)域已知的方法來評估。這些步驟用CNS在如下所示的流程圖中進(jìn)行了舉例說明。
本發(fā)明的方法依賴于將低A或脫A-ASON應(yīng)用于呼吸(脫A-RASON)、CNS(脫A-BASON)、腎(脫A-KASON)、心臟(脫A-CASON)、血液(脫A-SASON)、免疫系統(tǒng)(脫A-IASON)、惡性組織(脫A-MASON)和其它功能而不釋放具有顯著生物活性量的腺苷。通過該方式，本發(fā)明的方法防止了肺、CNS、腎、心臟、血液、免疫系統(tǒng)、惡性細(xì)胞聚集體中不利的腺苷受體激活。用目前已知的方法獲得的結(jié)果不太能說明問題，因?yàn)槌Ｒ?guī)的反義構(gòu)建體含有約25％的正常(高)水平的腺苷并且能激活腺苷受體。該作用使得結(jié)果變得模糊并且使得對功能性的解釋變得混亂。例如，在肺中，寡核苷酸釋放的腺苷將會(huì)引起氣道直徑的改變(支氣管縮小)、炎癥和表面活性劑的分泌，在該情況下的所有作用均與不同靶的確認(rèn)無關(guān)。這些“副作用”使得用寡核苷酸或核酶在該情況下獲得的數(shù)據(jù)無法進(jìn)行解釋。同樣，當(dāng)將含有腺苷的反義寡核苷酸用于腦時(shí)，它的作用使得許多可以用作終點(diǎn)來確認(rèn)靶有效的功能變得難以解釋。例如，腺苷會(huì)引起神經(jīng)傳遞的抑制、誘導(dǎo)睡眠、抗-傷害感受、介導(dǎo)乙醇的各種作用(包括運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào))、心臟功能的自主控制、D1和D2多巴胺受體的拮抗作用、CNS血流的改變、以及許多其它的作用。當(dāng)使用反義寡核苷酸在高反應(yīng)性肺、CNS和其它含有腺苷受體或?qū)ο佘沼蟹磻?yīng)的系統(tǒng)中進(jìn)行靶確認(rèn)研究時(shí)，顯然不應(yīng)存在顯著量的腺苷。由于這些原因，本發(fā)明的方法提供了一種優(yōu)越的靶確認(rèn)工具。本發(fā)明方法的特別有用的應(yīng)用是研究與呼吸道、CNS、血液、惡性和失控生長的細(xì)胞以及許多其它系統(tǒng)有關(guān)的治療領(lǐng)域，這些系統(tǒng)可以分別作為靶點(diǎn)，并且分別測量與該靶有關(guān)的一種或多種功能。
由于本發(fā)明的方法是在生物科學(xué)的獨(dú)特的歷史時(shí)期發(fā)明的，它將允許更迅速并且更有效地利用從測序人類基因組所獲得的信息。了解人類基因組中各種基因的序列是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)夢寐以求的東西。它的完成將可以把特定的基因與它們的功能聯(lián)系起來，然后制造出完全新型的藥物，這些藥物可以更好地接近患病的心臟并且沒有現(xiàn)有藥物的副作用。目前存儲(chǔ)的大量序列提供了重要的靶點(diǎn)。本發(fā)明的方法提供了一種價(jià)值無法衡量的工具，該工具可用來識(shí)別對于體內(nèi)功能非常重要、也就是說對于疾病非常重要的基因，并且可用來確定抑制所述基因的功能是否有治療上的用途。確定抑制基因的功能是否有治療用途的方法稱為“確認(rèn)靶有效”。它是藥物開發(fā)過程中非常重要的早期步驟，有助于確定是否要消耗關(guān)鍵性的資源來開發(fā)用于抑制靶基因功能的新藥物。就此而言，確認(rèn)靶有效和確認(rèn)靶無效是同樣重要的，確認(rèn)靶無效是證實(shí)抑制其功能是沒有功能性(治療性)作用的。在藥物開發(fā)過程中盡早地確認(rèn)靶無效可以防止將資源浪費(fèi)在沒有結(jié)果的藥物開發(fā)工作上。這將導(dǎo)致更迅速、更集中地研究更有生產(chǎn)價(jià)值的靶點(diǎn)。本發(fā)明的迅速而且精確的確認(rèn)靶有效的方法可以在大量信息、例如從人類基因組計(jì)劃獲得的信息的治療應(yīng)用中產(chǎn)生成功與失敗的差異。在本發(fā)明方法中的反義寡核苷酸的體內(nèi)試驗(yàn)可以在體外以及重要疾病的動(dòng)物模型、包括呼吸疾病例如哮喘、激素疾病、遺傳病、肥胖等，包括CNS、腎、心臟的疾病、血液疾病等的模型中實(shí)施?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如，在清醒、自由的嚙齒動(dòng)物、兔子或靈長目動(dòng)物，例如TruePrimateJ或其它物種中的完整身體的體積描記技術(shù)。因此，本發(fā)明的方法有助于確定在疾病或病癥的功能和編碼推測與其相關(guān)的靶多肽的基因或mRNA之間是否存在相關(guān)性。該方法本身通常包括如下步驟獲取含有最多約15％腺苷(A)的寡核苷酸(oligos)，該寡核苷酸對于選自靶基因及其相應(yīng)的mRNA、選自3′和5′內(nèi)含子-外顯子邊界以及編碼區(qū)和非編碼區(qū)之間的并列部分的基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)、以及編碼與預(yù)先選定的疾病或病癥有關(guān)的多肽的所有mRNA片段的靶是反義的；從寡核苷酸中選擇出在體外與靶mRNA雜交時(shí)可以明顯抑制或消除由mRNA編碼的多肽表達(dá)的寡核苷酸；向個(gè)體施用足以在體內(nèi)與靶mRNA雜交量的選定的寡核苷酸；然后評估在施用寡核苷酸前后與疾病或病癥有關(guān)的個(gè)體的功能；其中，功能值的改變大于約70％表示正相關(guān)，在約40至約70％之間表示可能相關(guān)，低于約30％表示不相關(guān)。
反義寡核苷酸可以通過選擇含有至少4個(gè)鄰近的選自G和C的核酸的靶的片段來構(gòu)建，并獲得約4、6、8、10至約15、25、45、60個(gè)核苷酸長的含有選定的片段并且C和G的含量為約0％、約3％、約5％、約10％、約12％至約15％的第一寡核苷酸?；蛘?，可以根據(jù)其類型和/或活性的范圍來選擇靶片段，所述活性可用于不同的目的。如果存在的話，可以有任意數(shù)量的腺苷(從一至全部)被“通用的”或替代的堿基例如可與胸腺嘧啶核苷堿基結(jié)合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受體具有小于約0.3的腺苷堿基激動(dòng)劑活性的雜芳族堿基或在腺苷A2a受體沒有活性的雜芳族堿基所取代。雜芳族堿基可以是嘧啶和嘌呤，其可以被取代，例如被O、鹵素、NH2、SH、SO、SO2、SO3、COOH以及支鏈和稠合的伯和仲氨基、烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、鏈烯氧基、?；?、環(huán)?；⒎蓟；?、鏈炔氧基、環(huán)烷氧基、芳?；?、芳硫基、芳基磺酰氧基(sulfoxyl)、鹵代環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基、鏈烯基環(huán)烷基、鏈炔基環(huán)烷基、鹵代芳基、烷基芳基、鏈烯基芳基、鏈炔基芳基、芳基烷基、芳基鏈烯基、芳基鏈炔基、芳基環(huán)烷基取代，其又可以被O、鹵素、NH2、伯、仲和叔胺、SH、SO、SO2、SO3、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基和雜芳基取代。但是，其它化合物和其它取代基也適用于本發(fā)明的方法。通常，嘧啶和嘌呤在1、2、3、4、7和8位取代，但也包括其它取代。嘧啶和嘌呤的例子是茶堿、咖啡因、二羥丙茶堿、乙羥茶堿、哌醋茶堿、巴米茶堿、恩丙茶堿和具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式的黃嘌呤 其中R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、鏈烯基或鏈炔基，R3是H、芳基、二環(huán)烷基、二環(huán)烯基、二環(huán)炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、O-環(huán)烷基、O-環(huán)烯基、O-環(huán)炔基、NH2-烷基氨基-酮氧基烷氧基-芳基和單和二烷基氨基烷基-N-烷基氨基-SO2芳基。通用的和替代的堿基的具體例子是3-硝基吡咯-2′-脫氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脫氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脫氧肌苷、2′-脫氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮或2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤，但也可以使用其它堿基。首選在腺苷受體沒有活性、也就是說在腺苷受體既沒有激動(dòng)劑特性也沒有拮抗劑特性的腺苷類似物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果寡核苷酸中存在CpG二核苷酸的話，該方法還可以用甲基化的胞嘧啶(mC)來代替CpG二核苷酸中的至少一個(gè)未甲基化的C，但也可以取代多個(gè)或全部取代。也可以采用在嘧啶上的其它C-5修飾，例如C-5丙炔。為了實(shí)現(xiàn)該方法，優(yōu)選將反義寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)或全部連接殘基用選自如下的殘基取代或修飾甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼雜磷酸酯(boranophosphate)、formacetal、thioformacetal、硫醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、砜、亞硫酸酯、亞砜、硫化物、羥基胺、2′-亞甲基(甲基亞氨基)、(MMI)、2′-甲氧基甲基(MOM)、2′-甲氧基乙基(MOE)、2′-亞甲基氧基(甲基亞氨基)(MOMA)、2′-甲氧基甲基(MOM)、2′-O-甲基、氨基磷酸酯和C-5取代的(例如C-5丙炔)殘基及其組合。適用于該方法的反義寡核苷酸為約7、約9、約11、約13、約15、約18、約21至約25、約28、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60個(gè)單核苷酸長，但其它長度也是適宜的。
本發(fā)明的方法還可合并使用與一種可被細(xì)胞內(nèi)化或攝取的物質(zhì)以及本領(lǐng)域已知的靶向于細(xì)胞的物質(zhì)例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白和鏈霉抗生物素蛋白連接的反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與載體相連，所述載體可以是原核的或真核的。載體的例子是本領(lǐng)域已知的，無需在本發(fā)明中進(jìn)一步描述。反義寡核苷酸的給藥量通常是可以有效減少mRNA的產(chǎn)量或利用度或增加其降解的量或可以減少所存在的多肽的量的量。例如，當(dāng)待被確認(rèn)的基因與呼吸功能有關(guān)時(shí)，可以將反義寡核苷酸直接向肺給藥。當(dāng)基因和功能與其它系統(tǒng)有關(guān)時(shí)，優(yōu)選將核酸向受影響的區(qū)域例如腦、心臟、腎、膀胱、性腺和生殖系統(tǒng)、呼吸和肺系統(tǒng)、在癌癥情況下的腫瘤、血液、免疫系統(tǒng)、肺、皮膚、眼、鼻通道、頭皮、睪丸、子宮頸、口腔、咽、食管、小腸和大腸、滑膜組織、肌肉、卵巢、耳道等以及來源于選定的靶位點(diǎn)的各種細(xì)胞原位給藥。在許多情況下，疾病或病癥會(huì)影響某些系統(tǒng)或系統(tǒng)的區(qū)域，例如上述的那些。例如，呼吸疾病可能伴有支氣管收縮的增加、炎癥、IgE-介導(dǎo)的過敏、表面活性劑的生產(chǎn)和其它癥狀，例如在哮喘、過敏性鼻炎、COPD、肺腫瘤、ARDS等。當(dāng)疾病或病癥與免疫學(xué)機(jī)能不良有關(guān)時(shí)，靶點(diǎn)可以選自免疫球蛋白和抗體受體、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體、基因和其它基因產(chǎn)物以及編碼它們和相關(guān)功能的相應(yīng)的mRNA、基因和mRNA側(cè)翼區(qū)和內(nèi)含子和外顯子邊界等。當(dāng)疾病或病癥與惡性腫瘤或癌有關(guān)時(shí)，靶點(diǎn)可以選自與癌癥相關(guān)的基因產(chǎn)物、編碼它們的基因和mRNA、與癌基因有關(guān)的基因和mRNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及外顯子和內(nèi)含子邊界等。
用于本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過如下方法來生產(chǎn)從與影響肺氣道的疾病和/或病癥有關(guān)的多肽、編碼它們的基因和RNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界中選擇靶點(diǎn)，然后獲取選自對應(yīng)于編碼靶多肽的靶基因和mRNA的mRNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界的mRNA序列；選擇至少一種mRNA片段，合成一種或多種對選定的mRNA片段反義的寡核苷酸；以及，如需要，用通用或替代的堿基代替一個(gè)或多個(gè)A(s)以使寡核苷酸中A的含量降低至最高約為所有核苷酸的10％。編碼的與肺系統(tǒng)有關(guān)的多肽的具體例子NfκB轉(zhuǎn)錄因子、白介素-8受體(IL-8R)、白介素5受體(IL-5R)、白介素4受體(IL-4R)、白介素3受體(IL-3R)、白介素-1β(IL-1β)、白介素1β受體(IL-1βR)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、類胰蛋白酶、主要堿性蛋白、(2-腎上腺素受體激酶、內(nèi)皮縮血管肽受體A、內(nèi)皮縮血管肽受體B、前內(nèi)皮縮血管肽原、緩激肽B2受體、IgE高親和性受體、白介素1(IL-1)、白介素1受體(IL-1R)、白介素9(IL-9)、白介素-9受體(IL-9R)、白介素11(IL-11)、白介素-11受體(IL-llR)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶(COX)、細(xì)胞內(nèi)粘著分子1(ICAM-1)血管細(xì)胞粘著分子(VCAM)、Rantes、內(nèi)皮白細(xì)胞粘著分子(ELAM-1)、單核細(xì)胞活化因子、嗜中性白細(xì)胞趨化因子、嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、防衛(wèi)素1、2和3、毒蕈鹼乙酰膽堿受體、血小板活化因子、腫瘤壞死因子α、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶IV、P物質(zhì)、P物質(zhì)受體、組胺受體、胃促胰酶、CCR-1 CC趨化因子受體、CCR-2 CC趨化因子受體、CCR-3 CC趨化因子受體、CCR-4 CC趨化因子受體、CCR-5 CC趨化因子受體、前列腺素類受體、GATA-3轉(zhuǎn)錄因子、嗜中性白細(xì)胞粘著受體、MAP激酶、白介素-9(IL-9)、NFAT轉(zhuǎn)錄因子、STAT 4、MIP-1α、MCP-2、MCP-3、MCP-4、親環(huán)蛋白、磷脂酶A2、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、金屬蛋白酶、CSBP/p38 MAP激酶、胰蛋白 受體、PDG2、白介素-3(IL-3)、白介素-1β(IL-1β)、環(huán)孢菌素A-結(jié)合蛋白、FK5-結(jié)合蛋白、α4β1選擇蛋白、纖連蛋白、α4β7選擇蛋白、Mad CAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、PECAM-1、LFA-1選擇蛋白、C3bi、PSGL-1、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、CD-34、L-選擇蛋白、p150，95、Mac-1(CD11b/CD18)、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、VLA-4、CD-18/CD11a、CD11b/CD18、ICAM2和ICAM3、C5a、CCR3(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子受體)、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、LTB-4、AP-1轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶C、半胱氨酰白三烯受體、Tachychinnen受體(tach R)、IκB激酶1 & 2、STAT 6、c-mas和NF-白介素-6(NF-IL-6)。與CNS、眼、心血管和心肺系統(tǒng)有關(guān)的多肽或基因的例子是G蛋白偶聯(lián)受體(約250種是已知的，約750-1,000種是假定的，仍需要進(jìn)行測序)、神經(jīng)肽基因、神經(jīng)肽受體基因、興奮性氨基酸受體基因、氯通道基因、鈣通道基因、嘌呤受體基因、腎上腺素受體基因、血清素受體基因、血清素轉(zhuǎn)運(yùn)基因、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因、鉀通道基因、酪氨酸激酶、磷酸化酶、乙酰膽堿受體、縮膽囊肽受體、一氧化氮合酶、多巴胺受體、膽堿能受體、血管緊張素、血管緊張素受體、包括鉀通道在內(nèi)的離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白，包括與髓鞘形成/脫髓鞘以及軸和樹狀結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放介質(zhì)和結(jié)構(gòu)、眼疾病，特別是視網(wǎng)膜和相關(guān)結(jié)構(gòu)的疾病有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白、降鈣素及其受體、神經(jīng)鈣蛋白及其受體、CGRP及其受體、心房肽及其受體、腦鈉尿肽及其受體、緩激肽及其受體、Baro受體、GABA/GABA受體、苯并二吖庚因受體、膽堿酯酶、大麻酯受體、鈣調(diào)蛋白及其受體、鈣/鈉交換泵、碳酸酐酶、兒茶酚胺及其受體、組胺受體、毒蕈鹼受體、阿片受體、趨化因子、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶、膽鈣化醇、炎癥介質(zhì)、包括細(xì)胞因子、白介素、干擾素及其受體、脂氧合酶途徑的酶、蛋白酶、DP(PGD2)受體、磷酸肌醇相關(guān)的酶、內(nèi)皮縮血管肽及其受體、腦啡肽酶、腦啡肽、苯并二吖庚因受體、GABA轉(zhuǎn)氨酶、促生長激素神經(jīng)肽及其受體、胃泌素釋放因子、生長因子、生長因子抑制劑、細(xì)胞周期蛋白、核苷激酶、核苷酸激酶、癌基因受體、5-羥色胺(5HT)受體、ADH、IGF、胰島素受體、內(nèi)酰胺酶、紅藻氨酸鹽受體、激肽釋放酶及其受體、白三烯-相關(guān)的酶、脂調(diào)素、L-NMMA及受體、促黑素細(xì)胞激素、甾體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶及合酶、NMDA和受體、嗎啡受體、MPTP、神經(jīng)激肽及其受體、煙鹼受體、磷脂酶、血小板活化因子、信號傳導(dǎo)蛋白、PDGF、強(qiáng)啡肽、前列環(huán)素、催乳素及其受體、催乳素釋放抑制因子、前激素、前列腺素類s、前列腺素及其受體、凝血酶、凝血酶原、蝶酰谷氨酸及其受體、麥角酸受體、蛇和蝎毒受體、腎素血管緊張素系統(tǒng)成分、逆轉(zhuǎn)錄酶、第二信使和相關(guān)的酶、鈉通道、促生長素抑制素及其受體、生長激素及其受體、p物質(zhì)、k物質(zhì)、突觸遞質(zhì)、速激肽、河豚毒素受體、血栓烷及其受體、甲狀腺激素、激素、促甲狀腺素和受體、普羅瑞林、T4、T3拓?fù)洚悩?gòu)酶、腫瘤壞死因子及其受體、TGF及其受體、黃嘌呤氧化酶、病毒信使RNAs、細(xì)菌mRNA、環(huán)狀肽催產(chǎn)素及其受體、縮膽囊素(Chlecystokinin)及其受體、血管緊張肽及其受體、單胺氧化酶、酪氨酸-激酶連接受體等。其它特定的靶基因是，例如，G蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體、鈣通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、鈉通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、鉀通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體以及氯通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)受體、神經(jīng)激素和神經(jīng)激素受體、神經(jīng)肽和神經(jīng)肽受體等，包括本專利所列舉的那些。其它靶基因是，例如，G蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體、鈣通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、鈉通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、鉀通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體以及氯通道蛋白和相關(guān)的蛋白受體、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)受體、神經(jīng)激素和神經(jīng)激素受體、神經(jīng)肽和神經(jīng)肽受體等。
在本方法中，可將組合物體外施用、口服、腔內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、肛門內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、子宮內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、肺部施用、腎內(nèi)施用、節(jié)內(nèi)(intranodularly)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、intraotically施用、淋巴內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、頰內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用、腫瘤內(nèi)施用、腺內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、血管內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、通過植入、吸入施用、真皮內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、耳內(nèi)施用、皮膚或頭皮上或子宮頸上(例如局部施用)、心臟內(nèi)施用、通過緩釋、持續(xù)釋放或通過泵施用等。與不同系統(tǒng)和疾病有關(guān)的靶基因和mRNA是編碼多肽例如轉(zhuǎn)錄因子、刺激和活化因子、細(xì)胞因子及其受體、白介素、白介素受體、趨化因子、趨化因子受體、內(nèi)源性產(chǎn)生的特異性和非特異性酶、免疫球蛋白、抗體受體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)受體、CNS和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)肽遞質(zhì)、粘著分子、防衛(wèi)素、生長因子、血管活性肽、肽受體和結(jié)合蛋白的基因和mRNA以及對應(yīng)于癌基因的基因和mRNA。寡核苷酸的給藥可以通過含有液體載體的口服制劑來進(jìn)行，例如溶液劑、混懸劑、水包油和油包水乳劑，和/或以散劑、糖衣丸、片劑、膠囊、噴霧劑、氣霧劑、溶液、混懸液和乳劑的形式給藥。當(dāng)以局部制劑的形式給藥時(shí)，載體可以選自霜?jiǎng)?、凝膠、軟膏、噴霧劑、氣霧劑、貼劑、溶液、混懸液和乳液。當(dāng)制劑是可注射的制劑時(shí)，載體可以選自含水和醇溶液及混懸液、油溶液和混懸液、水包油和油包水乳液等。當(dāng)制劑是直腸用制劑時(shí)，其可以是栓劑的形式，當(dāng)制劑是經(jīng)皮制劑時(shí)，載體可以選自含水和醇溶液、油溶液和混懸液、水包油和油包水乳液等，但也可以使用其它載體。經(jīng)皮制劑可以是離子電滲療法的經(jīng)皮制劑，其中的載體選自含水和醇溶液、油溶液和混懸液、水包油和油包水乳液，該制劑還可含有透皮促進(jìn)劑，有許多透皮促進(jìn)劑均是本領(lǐng)域已知的。同樣適用于延遲給藥的制劑是含有制劑的可植入膠囊或藥筒。在該情況下，載體也可以選自含水和醇溶液及混懸液、油溶液和混懸液、水包油和油包水乳液、疏水性載體，例如脂質(zhì)的囊或顆粒，例如由N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲基-銨甲基硫酸鹽和/或其它脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體以及微晶。對于肺部應(yīng)用，制劑優(yōu)選是可吸入的制劑，例如氣霧劑的形式。為了延長靶區(qū)域的接觸時(shí)間，可將寡核苷酸通過局部植入、栓劑、舌下制劑等輸送，所有這些制劑均是本領(lǐng)域已知的。
證實(shí)該方法優(yōu)于其它方法的一個(gè)因素是，可以獲得更為可信和精確的數(shù)據(jù)。反義核酶技術(shù)在體內(nèi)環(huán)境中不穩(wěn)定，在核酶和其它寡核苷酸中存在腺苷妨礙了獲得可信的數(shù)據(jù)，例如，在高反應(yīng)性呼吸道和其它含有大量腺苷受體的系統(tǒng)中。到目前為止，還沒有其它的方法證實(shí)能夠明確地在含有腺苷的系統(tǒng)例如呼吸道中弱化靶點(diǎn)并同時(shí)提供可信和準(zhǔn)確的相關(guān)性。此外，本發(fā)明的方法可用于闡明基因網(wǎng)絡(luò)例如神經(jīng)元基因網(wǎng)絡(luò)，這是對于在更寬的范圍內(nèi)分離鑒定單個(gè)基因的量的飛躍。這可以通過如下方法來完成選擇一種以上與代謝途徑有關(guān)的靶點(diǎn)，然后對其分別進(jìn)行測試以及與其它靶點(diǎn)一起進(jìn)行測試，也就是說，一次施用一種反義寡核苷酸，然后是兩種、三種等，然后對結(jié)果進(jìn)行比較以確定是否有連接、它們是否依次工作等。本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫適于補(bǔ)充一種更精細(xì)的藥物開發(fā)方法，以滿足在認(rèn)知、記憶、疼痛、焦慮、行為障礙、攝食行為、饑餓和飽滿感以及神經(jīng)病學(xué)疾病等與CNS有關(guān)的領(lǐng)域中的嚴(yán)格的醫(yī)學(xué)需求。本發(fā)明的方法包括四個(gè)基礎(chǔ)領(lǐng)域用于辨別與新藥物開發(fā)有關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)的功能性基因組，原位雜交以了解這些網(wǎng)絡(luò)在腦內(nèi)的分布，私有的位點(diǎn)特異性功能性基因消除(SSFGA)以確定網(wǎng)絡(luò)內(nèi)各基因的功能，用于定性和定量分析基因和基因網(wǎng)絡(luò)在各種與醫(yī)學(xué)有關(guān)的行為中的參與情況的多因素行為學(xué)分析，用于辨別基因和基因網(wǎng)絡(luò)在錐體束外系統(tǒng)例如心血管和肺系統(tǒng)中的作用的生理學(xué)、生物物理學(xué)、生物化學(xué)等分析。
該方法對于CNS的應(yīng)用可以包括疼痛、飽滿感、焦慮/情緒障礙、性沖動(dòng)、認(rèn)知/認(rèn)知障礙、睡眠/睡眠障礙等領(lǐng)域。辨別所識(shí)別的新基因和基因網(wǎng)絡(luò)的功能性意義的能力取決于對它們的空間表象的評估。例如，可用原位雜交來確定選定的基因和基因網(wǎng)絡(luò)在腦內(nèi)的精確三維(3-D)位置，以及用來使基因消除研究精確地靶向于評估其作為藥物開發(fā)程序的候選藥物的意義。位點(diǎn)特異性功能基因消除(SSFGA)提供了一種選擇性地在所需的系統(tǒng)區(qū)域例如腦內(nèi)弱化靶基因表達(dá)的方法。用于確認(rèn)CNS靶有效的SSFGA可以用按照如下描述設(shè)計(jì)的低A或脫A反義寡核苷酸來進(jìn)行。使用反義寡核苷酸的其它方法提供了不明確的數(shù)據(jù)，因?yàn)樗玫墓押塑账釙?huì)降解并釋放出腺苷，而腺苷是生物活性最強(qiáng)的一種內(nèi)分泌物，例如在CNS和含有腺苷受體的其它靶系統(tǒng)內(nèi)。在寡核苷酸降解時(shí)釋放的腺苷可以抑制或促進(jìn)神經(jīng)傳遞(這取決于它釋放時(shí)所處的系統(tǒng)和特定的區(qū)域，例如腦區(qū)域)、誘導(dǎo)睡眠、影響傷害感受、改變丘腦紡錘體的節(jié)律、減輕或加強(qiáng)多種藥物的作用、影響心血管功能和呼吸的自主控制、抑制Ca+流和GABA的突觸前功能、抑制自發(fā)的和受激的神經(jīng)原放電、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、減少突觸后的興奮性、抑制假定為學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)事件的長期強(qiáng)化、以及通過引起頭側(cè)的支氣管擴(kuò)張來引起多效性。顯然，通過寡核苷酸在腦或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物內(nèi)降解釋放出明顯量的腺苷在靶確認(rèn)研究中是禁忌的。適于用作CNS靶確認(rèn)終點(diǎn)的神經(jīng)學(xué)和行為學(xué)試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的。例如，記憶試驗(yàn)、三維或空間能力、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)控制、對外部刺激的敏感性和反應(yīng)性、視覺、眼協(xié)調(diào)、皮膚感覺能力、味覺和嗅覺識(shí)別等。生理學(xué)參數(shù)的測試也是本領(lǐng)域已知的，并且可以依賴于對導(dǎo)電性例如EKG和EEG，或其它功能如心率和心臟節(jié)律、水排泄、睡眠圖型等的測量。在許多情況下，副作用，特別是心肺、腎的副作用和其它副作用構(gòu)成了使?jié)撛诘乃幬镩_發(fā)CNS靶點(diǎn)不合格的主要原因。反過來，CNS副作用又經(jīng)常使適宜的治療性心肺、腎和其它藥物不合格。因此，最好在開發(fā)藥物時(shí)盡可能早地獲得弱化CNS靶點(diǎn)所造成的心肺影響的證據(jù)。當(dāng)這種影響在開發(fā)程序中發(fā)現(xiàn)得較遲時(shí)，它們會(huì)使程序在晚得多的階段被取消。本發(fā)明的方法采用現(xiàn)有技術(shù)中的分析手段、關(guān)鍵的手術(shù)、電生理學(xué)和其它類型的試驗(yàn)來評估各種有害的影響，例如弱化呼吸靶點(diǎn)對心血管的影響以及弱化呼吸靶點(diǎn)對CNS或心血管系統(tǒng)的任何有害的副作用。例如，在清醒、自由的動(dòng)物中進(jìn)行的肺功能研究以及心功能的研究可以對弱化候選CNS靶點(diǎn)的潛在影響進(jìn)一步地深入了解。
靶確認(rèn)可以通過上述SSFGA用靶向于各種在人類病理學(xué)(例如神經(jīng)肽Y(NPY)/勒帕茄堿受體)和攝食行為中具有推測的功能的已知受體和從CNS基因文庫中發(fā)現(xiàn)的新靶點(diǎn)的低A或脫A反義寡核苷酸進(jìn)行?？蓪?dòng)物模型進(jìn)行特定受體的SSFGA靶向作用，然后評估各種行為的改變，例如攝食行為、痛覺缺失、運(yùn)動(dòng)行為、感覺運(yùn)動(dòng)反射、選通過程、性和生殖行為、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶等。這組基礎(chǔ)廣泛的行為試驗(yàn)為弱化特定CNS靶點(diǎn)的影響提供了一種敏感的衡量方法，并且在藥物開發(fā)的決定過程的開始階段提供了一種決定性的知識(shí)。與生理學(xué)/生物物理學(xué)/生物化學(xué)分析結(jié)合，該方法提供了迅速、增強(qiáng)的測定候選靶點(diǎn)作為進(jìn)一步的藥物開發(fā)嘗試的有價(jià)值的焦點(diǎn)的可能性的判定。本發(fā)明的方法在基因和蛋白靶點(diǎn)的確認(rèn)上對現(xiàn)有的方法進(jìn)行了改進(jìn)，表現(xiàn)在使用靶向于與不同系統(tǒng)有關(guān)的基因的脫腺苷反義寡核苷酸來抑制基因產(chǎn)物的表達(dá)并測試這些方法的影響和癥狀學(xué)以及變化。本發(fā)明以本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)為前提，即，當(dāng)寡核苷酸在體內(nèi)代謝為它的單核苷酸時(shí)，會(huì)釋放有生物活性的腺苷代謝物。含有腺苷(A)的寡核苷酸會(huì)降解并釋放出腺苷代謝物，而該代謝物會(huì)激活例如位于肺中的腺苷受體而引起支氣管收縮、炎癥等。本發(fā)明的技術(shù)以設(shè)計(jì)靶向于和涉及不同功能、疾病和病理學(xué)的系統(tǒng)有關(guān)的基因和mRNA的反義寡核苷酸為基礎(chǔ)。對寡核苷酸進(jìn)行修飾以減少它們的腺苷含量，從而使在降解時(shí)由于腺苷的釋放所引起的不利副作用的出現(xiàn)減至最少。這樣做改善了所觀察到的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特別是當(dāng)腺苷受體可能涉及與所觀察的作用相似或相反的作用時(shí)，或者通過引起所觀察系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膭?dòng)態(tài)平衡的改變間接地改善。通過該方式，本發(fā)明人以特定的基因?yàn)榘悬c(diǎn)來設(shè)計(jì)一種或多種選擇性地與相應(yīng)的mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸，如需要，可通過用通用的或可替代的堿基或不能激活腺苷A1、A2a、A2b或A3受體的腺苷類似物代替來降低其中的腺苷含量。在其以前的經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人認(rèn)為，除了“向下調(diào)節(jié)”或消除特異性基因外，還可以通過選擇缺乏胸腺嘧啶核苷(T)或胸腺嘧啶核苷(T)含量低的RNA蛋白片段或者用其它可與胸腺嘧啶核苷結(jié)合但不能激活腺苷受體和產(chǎn)生腺苷在肺等中的作用的核苷酸堿基(稱為通用的或可替代的堿基)代替一個(gè)或多個(gè)存在于所設(shè)計(jì)的寡核苷酸中的腺苷來增加結(jié)果的精確性。由于腺苷(A)是一種與胸腺嘧啶核苷(T)互補(bǔ)的核苷酸，當(dāng)T出現(xiàn)在RNA中時(shí)，反義寡核苷酸將在同樣的位置含有A。為了達(dá)到一致，在本專利中，當(dāng)從左向右讀時(shí)，所有的RNA和寡核苷酸均用5′至3′方向的單鏈表示，盡管它們的互補(bǔ)序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，所有的核苷酸堿基和氨基酸均用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)所推薦的方式來表示，或用已知的3個(gè)字母的代碼(對于氨基酸)來表示。
本發(fā)明的方法可用于確認(rèn)許多靶基因有效或無效，從與個(gè)體的一個(gè)功能有關(guān)的單個(gè)基因到與一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)或途徑有關(guān)的多種單個(gè)的基因。確認(rèn)有效/無效是指通過實(shí)驗(yàn)證據(jù)來證實(shí)一種特定的基因是否與多種生物物理學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)、行為學(xué)等功能之一有關(guān)。即使一種基因在開始時(shí)沒有作用，但也可以將其與另一種基因靶點(diǎn)一起測試，因?yàn)榭赡苄枰瑫r(shí)消除它們的表達(dá)才能觀察到作用。本發(fā)明的反義物質(zhì)的腺苷含量具有降低的A含量以防止該物質(zhì)在體內(nèi)降解時(shí)釋放出A。例如，如果該系統(tǒng)是肺或呼吸系統(tǒng)，有大量基因與不同的功能有關(guān)，包括下表1所列的那些。
表1肺疾病或病癥肺和炎癥靶點(diǎn)NfκB轉(zhuǎn)錄因子 白介素-8受體(IL-8R)白介素-5受體(IL-5R)白介素-4受體(IL-4R)白介素-3受體(IL-3R)白介素-1β(IL-1β)白介素-1β受體(IL-1βR)嗜酸細(xì)胞活化趨化因子類胰蛋白酶 主要堿性蛋白β2-腎上腺素受體激酶 內(nèi)皮縮血管肽受體A內(nèi)皮縮血管肽受體B 前內(nèi)皮縮血管肽原緩激肽B2受體(B2BR) IgE(高親和性受體)白介素-1(IL-1) 白介素1體(IL-1R)白介素-9(IL-9) 白介素-9受體(IL-9R)白介素-11(IL-11) 白介素-11受體(IL-11R)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 環(huán)加氧酶(COX)細(xì)胞內(nèi)粘著分子1(ICAM-1)血管細(xì)胞粘著分子P亞組(VCAM)Rantes 內(nèi)皮白細(xì)胞粘著分子內(nèi)皮縮血管肽ETA受體(ELAM-1)環(huán)加氧酶-2(COX-2) GM-CSF，內(nèi)皮縮血管肽-1單核細(xì)胞活化因子 嗜中性白細(xì)胞趨化因子嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶 防衛(wèi)素1、2、3毒蕈鹼乙酰膽堿受體 血小板活化因子腫瘤壞死因子α 5-脂氧合酶磷酸二酯酶IV P物質(zhì)P物質(zhì)受體 組胺受體胃促胰酶 CCR-1CC趨化因子受體白介素-2(IL-2) 白介素-4(IL-4)白介素-12(IL-12) 白介素-5(IL-5)白介素-6(IL-6) 白介素-7(IL-7)白介素-8(IL-8) 白介素-12受體(IL-12R)白介素-7受體(IL-7R)白介素-1(IL-1)白介素-14受體(IL-14R) 白介素-14CCR-2 CC趨化因子受體 CCR-3 CC趨化因子受體CCR-4 CC趨化因子受體 CCR-5 CC趨化因子受體前列腺素類受體 GATA-3轉(zhuǎn)錄因子嗜中性白細(xì)胞粘著受體 MAP激酶白介素-15(IL-15) 白介素-15受體(IL-15R)白介素-11(IL-11) 白介素-11受體(IL-11R)NFAT轉(zhuǎn)錄因子 STAT4MIP-1α MCP-2MCP-3MCP-4親環(huán)蛋白(A，B等) 磷脂酶A2堿性成纖維細(xì)胞生長因子 金屬蛋白酶CSBP/p38 MAP激酶 類胰蛋白酶受體PDG2 白介素-3(IL-3)白介素-10(IL-10) 環(huán)孢菌素A-結(jié)合蛋白FK506-結(jié)合蛋白 α4β1選擇蛋白纖連蛋白 α4β7選擇蛋白cMad CAM-1 LFA-1(CD11a/CD18)PECAM-1 LFA-1選擇蛋白C3bi PSGL-1E-選擇蛋白 P-選擇蛋白CD-34L-選擇蛋白p150，95 Mac-1(CD11b/CD18)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 VLA-4STAT-1 STAT-2CD-18/CD11a CD11b/CD18ICAM2和ICAM3 C5aCCR3(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子CCR1，CCR2，CCR4，CCR5受體)LTB-4AP-1轉(zhuǎn)錄因子蛋白激酶C半胱氨酰白三烯受體Tachykinnen受體(tach R) IκB激酶1 & 2白介素-2受體(IL-2R) (例如，P物質(zhì)，NK-1 & NK-3受體)STAT6c-masNF-白介素-6(NF-IL-6) 白介素-10受體(IL-10R)白介素-3(IL-3) 白介素-2受體(IL-2R)白介素-13(IL-13) 白介素-12受體(IL-12R)白介素-14(IL-14) 白介素-6受體(IL-6R)白介素-16(IL-16) 白介素-13受體(IL-13R)Medullasin白介素-16受體(IL-16R)腺苷A1受體(A1R) 類胰蛋白酶-I腺苷A2b受體(A2bR) 腺苷A3受體(A3R)β類胰蛋白酶 STAT-3腺苷A2a受體(A2aR) IgE受體β亞單位(IgE Rβ)Fc-ε受體CD23抗原 IgE受體α亞單位(IgE Rα)IgE受體Fc受體(IgERFcεR) P物質(zhì)受體組氨酸脫羧酶 類胰蛋白酶-1前列腺素D合酶 嗜曙紅細(xì)胞陽離子蛋白嗜曙紅細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素 嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶內(nèi)皮一氧化氮合酶 內(nèi)皮單核細(xì)胞活化因子嗜中性白細(xì)胞氧化酶因子組織蛋白酶G巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1- 白介素-8受體α亞單位(IL-8Rα)α/Rantes受體 內(nèi)皮縮血管肽受體ET-B這些基因以及其它的基因與呼吸的正常功能以及伴有呼吸病理學(xué)的疾病有關(guān)，包括囊性纖維化、哮喘、肺動(dòng)脈高壓和血管收縮、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支氣管炎、呼吸窘迫綜合征(ARDS)、過敏性鼻炎、肺癌和肺轉(zhuǎn)移癌以及其它氣道疾病，包括那些有炎癥反應(yīng)的疾病。已證實(shí)腺苷A1、A2a、A2b和A3受體、CCR3(趨化因子受體)、緩激肽2B、CAM(血管細(xì)胞粘著分子)和嗜曙紅細(xì)胞受體等的反義寡核苷酸可以有效地向下調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。其中的一些可以緩解癥狀或減輕呼吸病痛和/或炎癥，例如，通過“向下調(diào)節(jié)”腺苷A1、A2a、A2b和/或A3受體和CCR3、緩激肽2B、CAM(血管細(xì)胞粘著分子)和嗜曙紅細(xì)胞受體。這些物質(zhì)可在本發(fā)明的方法中單獨(dú)使用，或與靶向于其它基因的反義寡核苷酸結(jié)合使用，以確認(rèn)與它們有關(guān)的途徑和/或網(wǎng)絡(luò)有效。為了獲得更好的結(jié)果，優(yōu)選將寡核苷酸通過吸入或其它方法直接施用到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)，從而可以使寡核苷酸達(dá)到肺部而不會(huì)在全身內(nèi)廣泛散布。與系統(tǒng)給藥或通過其它全身途徑給藥相比，這樣做可以使用較低的劑量，因此可以降低由于物質(zhì)在體內(nèi)的廣泛分布所引起的不利副作用的數(shù)量和程度。已證實(shí)本發(fā)明的物質(zhì)可以降低組織表達(dá)的受體蛋白的量。因此，這些物質(zhì)不僅可以和它們的靶點(diǎn)例如受體相互作用，而且可以降低其它藥物也可以與其相互作用的靶蛋白的數(shù)量。通過該方式，本發(fā)明的物質(zhì)提供了極高的效力而毒性很低。
以上討論的受體僅僅是本發(fā)明的技術(shù)能力強(qiáng)的一些例子。事實(shí)上，可以通過本發(fā)明的方法以相同的方式靶向于大量基因，以明顯地向下調(diào)節(jié)或消除蛋白質(zhì)的表達(dá)并觀察在系統(tǒng)例如呼吸、CNS、心血管、腎和其它系統(tǒng)內(nèi)一種或多種功能的任何改變。例如，在呼吸系統(tǒng)內(nèi)，測試的功能可以是呼吸的減輕、支氣管收縮、炎癥、慢性支氣管炎、表面活性劑的生產(chǎn)等，以及其它與疾病和病癥有關(guān)的方面，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、吸入燒傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、囊性纖維化、肺纖維化、輻射肺炎、扁桃腺炎、肺氣腫、牙疼、口腔炎癥、關(guān)節(jié)痛、食管炎、肺癌和食管癌等。這些功能很有價(jià)值，因?yàn)樗鼈兣c呼吸功能障礙有關(guān)，例如在哮喘、過敏、過敏性鼻炎、肺支氣管收縮和肺高壓、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏、哮喘、囊性纖維化、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、直接或通過轉(zhuǎn)移而侵染到肺的癌癥的情況下，本發(fā)明的方法可用于一系列潛在的靶mRNA，包括在上表1中所列的靶點(diǎn)。在CNS系統(tǒng)中，可以選擇的功能是食物攝取/飽滿感、情緒變化、焦慮、性欲/性功能障礙、認(rèn)知、性功能/功能障礙、腦創(chuàng)傷、阿耳茨海默氏介質(zhì)(Alzheimer’s mediator)、動(dòng)脈瘤等。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過如下方法制得先選擇含有至少4個(gè)相連的選自G和C的核酸和/或具有特定的活性類型和/或強(qiáng)度的靶核酸的片段，然后獲得4至60個(gè)核苷酸長的含有選定片段并且胸腺嘧啶核苷(T)核酸的含量最多為(含)約15％、優(yōu)選約12％、約10％、約7％、約5％、約3％、約1％、更優(yōu)選不含胸腺嘧啶核苷的第一寡核苷酸。后一步驟可以通過獲取4至60個(gè)核苷酸長的含有對選定片段反義的序列的第二寡核苷酸來進(jìn)行，第二寡核苷酸的腺苷堿基含量最多為(含)約15％、優(yōu)選約12％、約10％、約7％、約5％、約3％、約1％、更優(yōu)選不含腺苷。當(dāng)選定的片段含有至少一個(gè)胸腺嘧啶核苷堿基時(shí)，可在相應(yīng)的反義寡核苷酸片段中用通用的或替代的堿基代替腺苷堿基，當(dāng)在呼吸系統(tǒng)確認(rèn)時(shí)，所述通用的或替代的堿基選自可與胸腺嘧啶核苷堿基結(jié)合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受體具有小于約10％、優(yōu)選小于約1％、更優(yōu)選小于約0.3％的腺苷堿基激動(dòng)劑活性的雜芳族堿基或在腺苷A2a受體沒有活性的雜芳族堿基。如需要，可在其它系統(tǒng)中測定在其它系統(tǒng)中的腺苷活性。
類似的雜芳族堿基可以選自所有的嘧啶和嘌呤類化合物，其可以被O、鹵素、NH2、SH、SO、SO2、SO3、COOH以及支鏈和稠合的伯和仲氨基、烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、鏈烯氧基、?；h(huán)?；⒎蓟；?、鏈炔氧基、環(huán)烷氧基、芳?；?、芳硫基、芳基磺酰氧基、鹵代環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基、鏈烯基環(huán)烷基、鏈炔基環(huán)烷基、鹵代芳基、烷基芳基、鏈烯基芳基、鏈炔基芳基、芳基烷基、芳基鏈烯基、芳基鏈炔基、芳基環(huán)烷基所取代，其又可以被O、鹵素、NH2、伯、仲和叔胺、SH、SO、SO2、SO3、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基和雜芳基取代。嘧啶和嘌呤可以在本領(lǐng)域已知的所有位置被取代，但優(yōu)選在1、2、3、4、7和/或8位被取代。更優(yōu)選的嘧啶和嘌呤是茶堿、咖啡因、二羥丙茶堿、乙羥茶堿、哌醋茶堿、巴米茶堿、恩丙茶堿和具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式的黃嘌呤
其中R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、鏈烯基或鏈炔基，R3是H、芳基、二環(huán)烷基、二環(huán)烯基、二環(huán)炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、O-環(huán)烷基、O-環(huán)烯基、O-環(huán)炔基、NH2-烷基氨基-酮氧基(ketoxy)烷氧基-芳基、單和二烷基氨基烷基-N-烷基氨基-SO2芳基等。在糖中的類似的修飾也是本發(fā)明的實(shí)施方案。對應(yīng)于靶RNA中所存在的胸腺嘧啶核苷(T)的反義寡核苷酸中的腺苷含量減少可以防止寡核苷酸降解成可以向系統(tǒng)例如肺、腦、心臟、腎等、其周圍的組織釋放腺苷的產(chǎn)物，從而預(yù)防由于它所引起的任何不想要的作用。
例如，可以選擇NfκB轉(zhuǎn)錄因子作為靶點(diǎn)，尋求它的mRNA或DNA中的低胸腺嘧啶核苷(T)或脫胸腺嘧啶核苷(脫T(desT))片段。只選擇mRNA或DNA的脫T部分，然后由其產(chǎn)生脫A反義作為它們的互補(bǔ)鏈。當(dāng)發(fā)現(xiàn)了大量RNA脫T部分時(shí)，可以推斷出反義部分的序列。通常，可以獲得約10至30甚至更大量的脫A反義序列。這些反義序列可以包括對應(yīng)于靶點(diǎn)的mRNA的脫T部分的部分或全部脫A反義寡核苷酸序列，例如在上表1和下表2中所示的那些，以及其它與腦、心血管和腎系統(tǒng)的功能有關(guān)的那些。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，所發(fā)現(xiàn)的反義寡核苷酸被稱為100％不含A。對于每個(gè)對應(yīng)于靶基因、例如NFκB轉(zhuǎn)錄因子的原始脫A反義寡核苷酸序列，通?？稍诎谢蚧騌NA內(nèi)發(fā)現(xiàn)約10至30個(gè)具有低胸腺嘧啶核苷(RNA)含量的序列。根據(jù)本發(fā)明，選定的片段序列還可以在第二、第三或第四序列中含有少量的胸腺嘧啶核苷(RNA)核苷酸。在某些情況下，高的腺苷含量可能足以使反義寡核苷酸對靶點(diǎn)活性降低甚至沒有活性。根據(jù)本發(fā)明，這些所謂的“不完全脫A”序列優(yōu)選含有低于約15％、約12％、約10％、約7％、約5％和約2％腺苷的腺苷含量。首選不含腺苷(0％)。但是，在某些情況下，更高的腺苷含量是可以接受的而寡核苷酸仍不會(huì)顯示有害的“腺苷活性”。特別重要的實(shí)施方案是腺苷核苷酸被“固定”或者被可以以相似或相同的親和性與天然DNA中存在的四種核苷酸(A、G、C和T)中的兩種或多種進(jìn)行堿基配對的“通用或替代的”堿基所代替。
在本發(fā)明中，通用的或替代的堿基是指可以與胸腺嘧啶核苷雜交但與腺苷受體或腺苷通過其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生不利副作用的分子結(jié)合的能力較弱或者基本上不能與之結(jié)合的任何化合物、更常見的是腺苷類似物?；蛘撸梢允褂猛耆荒芗せ钕佘帐荏w例如腺苷A1、A2a、A2b和/或A3受體、首選A1受體的腺苷類似物。通用或替代堿基的一個(gè)例子是α-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)，技術(shù)人員可以知道如何選擇其它的，該“固定”步驟產(chǎn)生了另一種新的序列，不同于和天然存在的序列反義的序列，這使得反義寡核苷酸可以與靶RNA結(jié)合，優(yōu)選結(jié)合得同樣好。通用或替代堿基的另一個(gè)例子是2-脫氧核糖基-(5-硝基吲哚)。通用或替代堿基的另一個(gè)例子是3-硝基吡咯-2′-脫氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脫氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脫氧肌苷、2′-脫氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮和2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤。此外，雖然其雜交的能力有所降低但仍可代替任何其它堿基的通用或替代堿基包括3-硝基吡咯2′-脫氧核苷2-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脫氧肌苷和2′-脫氧水粉蕈素(Glen Research，Sterling，VA)。更特異性的錯(cuò)配修復(fù)可以使用“P”核苷酸、6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮(其堿基與鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(A)配對)和“K”核苷酸、2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤(其堿基與胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶核苷(T)配對)。也可以使用本領(lǐng)域已知的或可以獲得的其它物質(zhì)。參見，例如，Loakes，D.和Brown，D.M.，Nucl.Acids Res.224039-4043(1994)；Ohtsuka，E.等，J.Biol.Chem.260(5)2605-2608(1985)；Lin，P.K.T.和Brown，D.M.，NucleicAcids Res.20(19)5149-5152(1992；Nichols，R.等，Nature 369(6480)492-493(1994)；Rahmon，M.S.和Humayun，N.Z.，Mutation Research377(2)263-8(1997)；Amosova，O.等，Nucleic Acids Res.25(10)1930-1934(1997)；Loakes D.& Brown，D.M.，Nucleic Acids Res.22(20)4039-4043(1994)，其關(guān)于通用或替代的堿基及其制備以及在核酸結(jié)合中的用途的部分引入本文作為參考。
當(dāng)在天然的靶點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了不完全脫T序列時(shí)，通常對其進(jìn)行選擇以使約1至3個(gè)通用或替代的堿基替換將足以獲得100％“脫A”的反義寡核苷酸。因此，本發(fā)明提供了針對不同靶點(diǎn)的A含量低或不含A的反義寡核苷酸，以及其中有一個(gè)或多個(gè)腺苷核苷酸，例如約1至3個(gè)或更多，通過用“通用或替代”的堿基置換所“固定”了的反義寡核苷酸。通用或替代的堿基是本領(lǐng)域已知的，無需在此列出。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以知道哪些堿基可以作為通用或替代的堿基并用其代替A。
文中所用的術(shù)語在某個(gè)系統(tǒng)例如呼吸、炎癥、CNS、心肺、腎免疫和其它系統(tǒng)內(nèi)確認(rèn)靶“有效”或“無效”是指如下過程先在系統(tǒng)例如CNS或心血管或心肺系統(tǒng)內(nèi)選擇一個(gè)治療領(lǐng)域。可以在這些系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行選擇用于研究的領(lǐng)域是焦慮、情緒障礙、飽滿感和食欲的調(diào)節(jié)、疼痛、認(rèn)知、睡眠誘導(dǎo)和障礙、體溫調(diào)節(jié)等通過大腦控制或調(diào)節(jié)的領(lǐng)域，以及下表2所例舉的那些。
隨后的步驟是選擇對應(yīng)于適宜系統(tǒng)的基因序列數(shù)據(jù)庫，例如CNS、肺、心臟系統(tǒng)、腎系統(tǒng)、血液、免疫系統(tǒng)、肺和呼吸系統(tǒng)、性功能/機(jī)能障礙、皮膚、眼、鼻通道、頭皮、睪丸、子宮頸、口腔、咽、食道、小腸和大腸、滑膜組織、卵巢、耳道和其它系統(tǒng)。靶基因選自已知與CNS或CNS的特定區(qū)域有關(guān)的那些，以及功能未知的那些。也可以選擇功能已知和可能在該系統(tǒng)中出現(xiàn)的基因。然后按照本文所述設(shè)計(jì)這些靶基因或mRNA片段的反義寡核苷酸。最后，通過與細(xì)胞和組織DNA和RNA體外雜交，根據(jù)消除或明顯減少靶基因表達(dá)的能力對寡核苷酸進(jìn)行選擇。然后將體外顯示出高的向下調(diào)節(jié)、消除或表達(dá)抑制作用的寡核苷酸用于體內(nèi)測試，優(yōu)選位點(diǎn)特異性地應(yīng)用于例如腦、心臟、腎、肺等區(qū)域，并預(yù)測其行為學(xué)、生物物理學(xué)、生物化學(xué)、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、感覺、生理學(xué)和其它功能，對這些進(jìn)行評估是為了確定在靶點(diǎn)和功能之間是否存在相關(guān)。例如，在呼吸系統(tǒng)中，可能顯示相關(guān)性，進(jìn)行該治療的個(gè)體將表現(xiàn)出呼吸道或炎性肺疾病或其它肺病癥如惡性腫瘤的癥狀的可能性降低。此處所用的術(shù)語“向下調(diào)節(jié)”是指引起靶向的分子內(nèi)蛋白的生產(chǎn)、分泌或利用度降低(從而引起濃度的降低)，包括完全消除。
表2與靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)有關(guān)的疾病和病癥的例子癡呆 中風(fēng) 焦慮抗傷害感受 痛覺缺失心肺功能自主控制 行為障礙 創(chuàng)傷性腦損傷器管性腦疾病變性腦病CNS疾病發(fā)展的藥物敏感性異常和 視覺(病毒性的等) 變形(合法的和非法的)認(rèn)識(shí)力 食物飽滿感醇敏感性 心臟病發(fā)作學(xué)習(xí) 抑郁 攝食腦炎麻醉 聽覺嗅覺 低氧癥精神分裂癥腦癌 顱缺陷記憶神經(jīng)病神經(jīng)性疼痛牙痛 頭痛 感覺 運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情緒障礙 情緒鼓舞 雙相性精神障礙 飲食障礙惡病質(zhì)動(dòng)脈瘤心臟和血管 充血性心臟和血管心臟和血管滲出 心臟病 疼痛炎癥 中風(fēng)心絞痛 心衰局部缺血 血小板形成再狹窄 病毒感染心律失常 血管滲透性動(dòng)脈變性 性欲血管生成和抑制結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)缺陷 發(fā)怒 移植物排斥本發(fā)明主要涉及在哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物中確認(rèn)靶有效，該組的動(dòng)物包括人和非人類的類人猿、野生和家養(yǎng)的動(dòng)物、海洋和陸地上的動(dòng)物、家庭寵物和動(dòng)物園的動(dòng)物，例如，貓科動(dòng)物、犬、馬、厚皮獸類、鯨魚，但更優(yōu)選人類。該技術(shù)的一種特別適宜的應(yīng)用是用于獸醫(yī)的目的，包括獸醫(yī)所關(guān)注的所有類型的小型和大型動(dòng)物，包括野生動(dòng)物、海洋動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園的動(dòng)物等。靶基因和蛋白優(yōu)選哺乳動(dòng)物的，靶序列優(yōu)選與所治療的個(gè)體屬于同一物種。盡管在許多情況下，不同物種的靶也是適宜的，特別是那些與受體的序列顯示大于約45％同源性、優(yōu)選大于約85％同源性、更優(yōu)選大于約95％同源性的靶RNA或基因的部分。一組優(yōu)選的物質(zhì)包括脫A反義寡核苷酸。另一個(gè)優(yōu)選的組包括其中有一個(gè)或多個(gè)腺苷堿基被通用或替代的堿基所代替了的不完全脫A寡核苷酸。
術(shù)語“反義”寡核苷酸通常是指小的、合成的寡核苷酸，類似于單鏈DNA，其在本專利中用于通過抑制靶信使RNA(mRNA)來抑制基因的表達(dá)。參見Milligan，J.F.等，J.Med.Chem.36(14)，1923-1937(1993)，其相關(guān)的部分全文引入本文作為參考。本發(fā)明的方法使用反義物質(zhì)來抑制靶基因的表達(dá)，包括上表1中所列的那些。該物質(zhì)通常通過將反義寡核苷酸與本領(lǐng)域已知的信使RNA(mRNA)的編碼(有義)序列雜交得到。外源性施用本發(fā)明的物質(zhì)可以降低由靶基因所編碼的mRNA和蛋白的水平和/或引起所處理的細(xì)胞生長特性或形狀的改變。參見，Milligan等(1993)；Helene，C.和Toulme，J.Biochim.Biophys.Acta 1049，99-125(1990)；Cohen，J.S.D.編，寡核苷酸脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑；CRC PressBoca Raton，F(xiàn)L(1987)，其相關(guān)的部分全文引入本文作為參考。文中所用的“反義寡核苷酸”通常是合成的核苷酸的短序列，該序列(1)可在適宜的雜交條件下與編碼靶蛋白的mRNA的任意部分雜交，并且(2)在雜交后可以引起靶蛋白基因表達(dá)的降低。術(shù)語“脫腺苷”(脫A)和“脫胸腺嘧啶核苷”(脫T)是指基本不含腺苷(脫A)或胸腺嘧啶核苷(脫T)的寡核苷酸。在某些情況下，脫T序列是天然存在的，在另外一些情況下，它們可以通過將不想要的核苷酸(A)用另一種缺乏其不想要的活性的核苷酸代替而得到。本文中，這通常通過將A用本領(lǐng)域已知的“通用或替代的堿基”代替來完成。
靶蛋白的mRNA序列可以從表達(dá)蛋白的基因的核苷酸序列得到，無論是已經(jīng)存在的靶點(diǎn)或是可能在將來發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)。許多不同系統(tǒng)的靶基因的序列是已知的。參見GenBank數(shù)據(jù)庫，NIH，其所有的序列均引入本文作為參考。對于那些序列仍然未知的基因的序列，可以通過用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離靶點(diǎn)部分來獲得。一旦基因序列、其RNA和/或蛋白成為已知的，就可以按照以上描述生產(chǎn)反義寡核苷酸并用于通過體內(nèi)施用并按照常規(guī)技術(shù)檢測靶蛋白生產(chǎn)的減少和特定功能的下降來確認(rèn)靶有效。在本發(fā)明的一個(gè)方面，反義寡核苷酸具有可與編碼與特定系統(tǒng)例如CNS、呼吸、肺、運(yùn)動(dòng)、感覺、激素調(diào)節(jié)、心臟、腎、免疫、血液、癌基因等的疾病或病癥有關(guān)的蛋白的mRNA分子的部分或片段特異性結(jié)合的序列。這種結(jié)合的效果之一是減少甚至防止相應(yīng)的mRNA的翻譯，由此減少靶蛋白在個(gè)體肺中的含量。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯殘基是修飾或取代的。特別優(yōu)選可以增加寡核苷酸體內(nèi)穩(wěn)定性的帶有修飾或取代的磷酸二酯殘基的寡核苷酸的化學(xué)類似物，例如修飾成甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯。寡核苷酸的天然磷酸二酯鍵容易被細(xì)胞的核酸酶引起一定程度的降解。與此相反，本文所提出的許多殘基對于核酸酶的降解是高耐受性的。參見Milligan等，和Cohen，J.S.D.，同上。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過加入“3′-末端的帽”來防止寡核苷酸的降解，其中，用耐核酸酶的鍵代替寡核苷酸3′末端的磷酸二酯鍵。參見，Tidd，D.M.和Warenius，H.M.，Be.J.Cancer 60343-350(1989)；Shaw，J.P.等，Nucleic Acids Res.19747-750(1991)，其相關(guān)的部分全文引入本文作為參考。氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯鍵均可以以該方式同樣地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。對磷酸二酯骨架修飾得越多，所形成的物質(zhì)越穩(wěn)定，在許多情況下它們的RNA親和性和細(xì)胞通透性越高。參見Milligan，等，同上。因此，可被修飾或取代的殘基的數(shù)量將根據(jù)需要、靶點(diǎn)、給藥途徑而改變，可以是從1至所有殘基之間的任何數(shù)量。已知有許多不同的用新的鍵代替整個(gè)磷酸二酯骨架的方法。參見Millikan等，同上。堿基、核苷酸間的鍵或糖的優(yōu)選的殘基類似物包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、thioformacetal、二硫代磷酸酯、氨基磺酸酯、formacetal、硼雜磷酸酯、3′-thioformacetal、5′-硫醚、碳酸酯、5′-N-氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磺酰胺、砜、亞硫酸酯、2-O-甲基、亞砜、硫化物、羥基胺、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)、亞甲基(甲基亞氨基)(MMI)和亞甲基氧基(甲基亞氨基)(MOMI)殘基。特別優(yōu)選硫代磷酸酯和甲基膦酸酯，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^自動(dòng)寡核苷酸合成得到。參見，Millikan等，同上。如果適當(dāng)?shù)脑?，可將本發(fā)明的物質(zhì)以可藥用鹽的形式或以反義寡核苷酸和鹽的混合物的形式給藥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將不同反義寡核苷酸或其可藥用鹽的混合物進(jìn)行給藥。本發(fā)明的物質(zhì)可以減少一種靶mRNA的表達(dá)和/或增強(qiáng)或減弱一種途徑的活性。例如，本發(fā)明的方法可用于在靶mRNA或基因中鑒定所有可能的約7或更多個(gè)單核苷酸、優(yōu)選最多約60個(gè)單核苷酸、更優(yōu)選約10至約36個(gè)單核苷酸、仍更優(yōu)選約12至約21個(gè)單核苷酸的胸腺嘧啶核苷(T)含量低的脫氧核糖核苷酸部分或腺苷(A)含量低的脫氧核苷酸部分。這可以通過在靶序列中尋找7個(gè)或更多單核苷酸長的胸腺嘧啶核苷(與腺苷互補(bǔ)的核苷酸)含量低或缺乏胸腺嘧啶核苷的單核苷酸部分(RNA)或腺苷含量低的單核苷酸部分(基因)來完成。在大部分情況下，這種尋找通常產(chǎn)生約10至30個(gè)這樣的序列，即天然缺乏或腺苷含量低于約40％的序列，具有平均長度、即約1800個(gè)核苷酸長的典型靶mRNA的不同長度的反義寡核苷酸。具有高T或A含量的序列可以通過用通用或替代的堿基代替一個(gè)或單個(gè)A來固定。
本發(fā)明的物質(zhì)可以具有任何適宜的長度，包括但不僅限于約7至約60個(gè)核苷酸長，優(yōu)選約12至約45，更優(yōu)選最多約30個(gè)核苷酸長，仍更優(yōu)選最多約21個(gè)，但它們也可以是其它的長度，這取決于具體的靶點(diǎn)和輸送的方式。本發(fā)明的物質(zhì)可以針對任何及所有的靶RNA。一組優(yōu)選的物質(zhì)包括針對在內(nèi)含子和外顯子之間含有接點(diǎn)的mRNA區(qū)域。當(dāng)該物質(zhì)針對內(nèi)含子/外顯子接點(diǎn)時(shí)，它可以完全疊在接點(diǎn)之上，或者可以與接點(diǎn)足夠接近以抑制插入的外顯子在將前體mRNA加工成成熟mRNA的過程中被剪切掉，例如，使反義寡核苷酸的3′或5′末端位于例如內(nèi)含子/外顯子接點(diǎn)的約2至10、優(yōu)選約3至5個(gè)核苷酸之間。還優(yōu)選覆蓋了起始密碼子以及那些靠近編碼區(qū)域的5′和3′末端的反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可以具有約0、約3％、約5％、約7％至約8％、約10％、約12％、約15％的腺苷含量，以及任何中間的腺苷含量的數(shù)量和范圍。在本發(fā)明的方法中，可以有一個(gè)或多個(gè)或全部的A被通用或替代的堿基所代替，例如可與胸腺嘧啶核苷結(jié)合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受體具有小于約0.5、約0.3％、約0.1％的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑活性的雜芳族堿基或在腺苷A2a受體沒有活性的雜芳族堿基。替代的堿基可以是3-硝基吡咯-2′-脫氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脫氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脫氧肌苷、2′-脫氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮或2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤等。寡核苷酸可以用甲基化的胞嘧啶(mC)來代替CpG二核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)或全部未甲基化的C，如果后者在寡核苷酸中存在的話。本發(fā)明還可以采用對嘧啶的其它C5修飾，例如C5丙炔等。適用于本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)或全部寡核苷酸連接殘基可以是甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼雜磷酸酯、formacetal、thioformacetal、硫醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、砜、亞硫酸酯、亞砜、硫化物、羥基胺、亞甲基(甲基亞氨基)、(MMI)、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)、亞甲基氧基(甲基亞氨基)(MOMA)、甲氧基甲基(MOM)、2′-O-甲基、氨基磷酸酯和C-5取代的(C-5丙炔)殘基及其組合。用于本發(fā)明的寡核苷酸可與載體相連，例如原核或真核的載體，載體的許多例子是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的方法指定了施用一定量的可以有效降低mRNA的生產(chǎn)或利用度或增加其降解或減少肺中多肽含量的反義寡核苷酸。給藥優(yōu)選在原位進(jìn)行，例如，對于呼吸和肺靶點(diǎn)，可以通過吸入或應(yīng)用于個(gè)體的肺而直接向呼吸系統(tǒng)或鼻通道內(nèi)給藥。反義寡核苷酸可以通過注射、立體定位插入或在體外直接向腦、心臟、腎、腫瘤、睪丸、眼、耳道、子宮頸、鼻通道、頭皮、口腔、肌肉、咽、食管、腸、直腸、滑膜組織、卵巢和其它定位的組織給藥。此外，當(dāng)靶點(diǎn)是循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的一部分時(shí)，還可將寡核苷酸向血液中給藥。在后一種情況下，當(dāng)疾病或病癥與免疫機(jī)能障礙有關(guān)時(shí)，靶點(diǎn)可以是免疫球蛋白、抗體受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、編碼它們的基因和相應(yīng)的mRNA、基因和mRNA側(cè)翼區(qū)以及外顯子和內(nèi)含子邊界等。當(dāng)疾病或病癥與惡性腫瘤或癌癥有關(guān)時(shí)，靶點(diǎn)可以選自生長調(diào)節(jié)相關(guān)性的酶和其它蛋白，免疫球蛋白和抗體受體、編碼它們的基因和mRNA、與癌基因有關(guān)的基因和mRNA、以及基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子邊界。此外，與癌癥過程有關(guān)的某些正常細(xì)胞的基因例如血管生成因子、粘著分子和與癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白酶等也是本發(fā)明的一部分。例如，該方法可以通過將組合物體外施用、口服、腔內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、肛門內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、子宮內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、肺部施用、腎內(nèi)施用、節(jié)內(nèi)(intranodularly)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、intraotically施用、淋巴內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、頰內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用、腫瘤內(nèi)施用、腺內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、器官內(nèi)施用、血管內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、通過植入、吸入施用、真皮內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、耳內(nèi)施用、心臟內(nèi)施用、通過緩釋、持續(xù)釋放或通過泵施用來完成。靶點(diǎn)的其它例子是編碼多肽的基因和mRNA，所述的肽選自轉(zhuǎn)錄因子、刺激和活化因子、細(xì)胞因子及其受體、白介素、白介素受體、趨化因子、趨化因子受體、內(nèi)源性產(chǎn)生的特異性和非特異性酶、免疫球蛋白、抗體受體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)受體、CNS和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)肽遞質(zhì)、粘著分子、防衛(wèi)素、生長因子、血管活性肽、肽受體和結(jié)合蛋白、對應(yīng)于癌基因的基因和mRNA、G蛋白偶聯(lián)受體等。反義寡核苷酸可以通過如下方法來生產(chǎn)從與影響肺氣道的疾病和病癥例如呼吸活動(dòng)困難和惡性腫瘤、表面活性劑的分泌增加或減少等有關(guān)的肽、編碼它們的基因和RNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界選擇靶點(diǎn)；獲得mRNA序列，所述mRNA選自對應(yīng)于靶基因的mRNA和編碼靶多肽的mRNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界；選擇至少一種mRNA的片段；合成一種或多種對選定的mRNA的片段反義的寡核苷酸；以及，如需要，用一種能夠與胸腺嘧啶核苷(T)雜交但在腺苷受體的激動(dòng)劑能力較低或者沒有激動(dòng)劑能力(無或降低的腺苷受體激活)的替代堿基代替一個(gè)或多個(gè)A以使寡核苷酸中A的含量降低至整個(gè)核苷酸的最多約15％。正如以上所指出的，適宜的靶點(diǎn)是靶蛋白、編碼多肽的基因和mRNA(所述的肽選自轉(zhuǎn)錄因子、刺激和活化因子、白介素、白介素受體、趨化因子、趨化因子受體、內(nèi)源性產(chǎn)生的特異性和非特異性酶、免疫球蛋白、抗體受體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)受體、CNS和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)肽遞質(zhì)及其受體、粘著分子、防衛(wèi)素、生長因子、血管活性肽及其受體以及結(jié)合蛋白)、對應(yīng)于癌基因的靶基因和mRNA、及其側(cè)翼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子邊界。編碼的多肽可以選自NfκB轉(zhuǎn)錄因子、白介素-8受體(IL-8R)、白介素5受體(IL-5R)、白介素4受體(IL-4R)、白介素3受體(IL-3R)、白介素-1β(IL-1β)、白介素1β受體(IL-1βR)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、類胰蛋白酶、主要堿性蛋白、β2-腎上腺素受體激酶、內(nèi)皮縮血管肽受體A、內(nèi)皮縮血管肽受體B、前內(nèi)皮縮血管肽原、緩激肽B2受體、IgE高親和性受體、白介素1(IL-1)、白介素1受體(IL-1R)、白介素9(IL-9)、白介素-9受體(IL-9R)、白介素11(IL-11)、白介素-11受體(IL-11R)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶(COX)、細(xì)胞內(nèi)粘著分子1(ICAM-1)血管細(xì)胞粘著分子(VCAM)、Rantes、內(nèi)皮白細(xì)胞粘著分子(ELAM-1)、單核細(xì)胞活化因子、嗜中性白細(xì)胞趨化因子、嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、防衛(wèi)素1、2和3、毒蕈鹼乙酰膽堿受體、血小板活化因子、腫瘤壞死因子α、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶IV、P物質(zhì)、P物質(zhì)受體、組胺受體、胃促胰酶、CCR-1 CC趨化因子受體、CCR-2 CC趨化因子受體、CCR-3 CC趨化因子受體、CCR-4 CC趨化因子受體、CCR-5 CC趨化因子受體、前列腺素類受體、GATA-3轉(zhuǎn)錄因子、嗜中性白細(xì)胞粘著受體、MAP激酶、白介素-9(IL-9)、NFAT轉(zhuǎn)錄因子、STAT 4、MIP-1α、MCP-2、MCP-3、MCP-4、親環(huán)蛋白、磷脂酶A2、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、金屬蛋白酶、CSBP/p38 MAP激酶、胰蛋白 受體、PDG2、白介素-3(IL-3)、白介素-1β(IL-1β)、環(huán)孢菌素A-結(jié)合蛋白、FK5-結(jié)合蛋白、α4β1選擇蛋白、纖連蛋白、α4β7選擇蛋白、Mad CAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、PECAM-1、LFA-1選擇蛋白、C3bi、PSGL-1、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、CD-34、L-選擇蛋白、p150，95、Mac-1(CD11b/CD18)、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、VLA-4、CD-18/CD11a、CD11b/CD18、ICAM2和ICAM3、C5a、CCR3(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子受體)、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、LTB-4、AP-1轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶C、半胱氨酰白三烯受體、Tachychinnen受體(tach R)、IκB激酶1&2、STAT 6、c-mas和NF-白介素-6(NF-IL-6)、其側(cè)翼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子邊界。但是，本發(fā)明主要是用于無法在公共數(shù)據(jù)庫中得到的新發(fā)現(xiàn)的基因。因?yàn)閷τ谶@組基因而言靶確認(rèn)是非常重要的，否則它們在疾病中的作用將仍然是未知的。
下表3簡單地列出了本發(fā)明的物質(zhì)可以有效應(yīng)用的靶點(diǎn)。這僅僅是舉例性的。該方法可用于其中的靶確認(rèn)將依賴于在寡核苷酸降解過程中生物活性的腺苷的釋放來討論的任何系統(tǒng)。這很重要，因?yàn)橄佘帐强寡讋?，它的釋放將?huì)使癌癥靶點(diǎn)的確認(rèn)結(jié)果變得難以解釋。
表3 癌癥靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化癌基因 治療靶點(diǎn)ras 胸苷酸合成酶src 胸苷酸合成酶myc 二氫葉酸還原酶bcl-2 胸腺嘧啶核苷激酶脫氧胞苷激酶核糖核苷酸還原酶血管生成因子 粘著分子癌基因 葉酸途徑的酶DNA修復(fù)基因 (一碳庫)端粒末端轉(zhuǎn)移酶HMG CoA還原酶法尼基轉(zhuǎn)移酶葡萄糖-6-磷酸酯轉(zhuǎn)移酶一組優(yōu)選的用于確認(rèn)癌癥靶點(diǎn)有效的靶點(diǎn)是與不同類型的癌癥有關(guān)的基因，或那些通常認(rèn)為與惡性腫瘤有關(guān)的靶點(diǎn)，無論它們是調(diào)節(jié)或是參與RNA和/或蛋白的生產(chǎn)。其例子是轉(zhuǎn)化癌基因，即上表3中所示的靶點(diǎn)等。本發(fā)明的癌癥靶確認(rèn)物質(zhì)所針對的其它靶點(diǎn)是各種酶，主要是(但不僅限于)胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、胸腺嘧啶核苷激酶、脫氧胞苷激酶、核糖核苷酸還原酶、在癌癥細(xì)胞中含量比在正常細(xì)胞中豐富的其它基因產(chǎn)物等。本發(fā)明的技術(shù)特別適用于確認(rèn)癌癥靶基因有效/無效，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的癌癥療法不能有效地選擇性地殺死癌細(xì)胞并同時(shí)防止由于化療、放療等的治療所引起的對正?；罴?xì)胞的毀滅性的影響。也就是說，現(xiàn)有的癌癥療法不能選擇性地靶向于惡性腫瘤細(xì)胞。用本發(fā)明的方法確認(rèn)的任何靶點(diǎn)都能夠選擇性地弱化所需的基因產(chǎn)物并弱化或增強(qiáng)功能及其途徑。該方法明顯優(yōu)于常規(guī)的癌癥療法，因?yàn)樗试S選擇一個(gè)系統(tǒng)，并且在系統(tǒng)內(nèi)選擇一種包括多個(gè)靶點(diǎn)(例如第一、第二以及可能的第三靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)一般不會(huì)在正常的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá))的途徑并將它們分別和共同確認(rèn)。因此，本發(fā)明的方法將會(huì)提供用于治療的靶點(diǎn)。一旦通過本發(fā)明的方法確認(rèn)靶點(diǎn)有效，就可以向個(gè)體施用作用于該靶點(diǎn)的選擇性的物質(zhì)以引起在例如表達(dá)三個(gè)靶點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的毒性選擇性的增加，而僅表達(dá)一個(gè)或兩個(gè)靶點(diǎn)的正常細(xì)胞受到的影響將明顯較小甚至不受影響。本發(fā)明的方法所施用的物質(zhì)優(yōu)選設(shè)計(jì)為對與待給藥的物種有關(guān)的靶基因和/或mRNA反義的物質(zhì)。當(dāng)用于在人類中確認(rèn)靶點(diǎn)有效時(shí)，所述物質(zhì)優(yōu)選設(shè)計(jì)為對人類基因或RNA是反義的。本發(fā)明的物質(zhì)包括對天然DNA和/或RNA序列或其長度最多為比靶序列少一個(gè)堿基、優(yōu)選至少約7個(gè)核苷酸長的片段反義的寡核苷酸，含有僅約0.1％、約1％、約4％至約5％、約10％、約15％、約30％或不含腺苷的寡核苷酸，以及其中的一個(gè)或多個(gè)腺苷核苷酸被可與胸腺嘧啶核苷核苷酸配對但基本不能激活腺苷受體活性的所謂通用或替代的堿基代替了的寡核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸的人類序列和片段的例子是如下片段以及所述片段和編碼序列、外顯子和內(nèi)含子-外顯子接點(diǎn)的完整基因或mRNA的更短的部分，優(yōu)選在每個(gè)序列中含有7、10、15、18至21、24、27、30、n-1個(gè)核苷酸，其中n是序列的核苷酸總數(shù)。這些片段可以選自長寡核苷酸的任何部分，例如中部、5′-末端、3′-末端，或從原始序列的任何其它位點(diǎn)開始。特別重要的是低腺苷核苷酸含量的片段，即那些含有低于或約30％、優(yōu)選低于或約15％、更優(yōu)選低于或約10％、仍更優(yōu)選低于或約5％、首選不含腺苷核苷酸的片段，可以通過選擇或按照本發(fā)明用通用或替代的堿基代替。本發(fā)明的物質(zhì)首選包括其中有一個(gè)或多個(gè)存在于序列中的腺苷被本文所例舉的通用或替代的堿基(B)代替了的序列及其片段。同樣，本發(fā)明還包括設(shè)計(jì)用B代替序列中所含的腺苷(A)的含B片段、其片段或部分的所有更短的片段，參見以上的描述。
本發(fā)明的方法可以將這些物質(zhì)單獨(dú)使用或?qū)⑵湟院幸陨纤龅目梢杂行p少靶蛋白表達(dá)的量的反義寡核苷酸的藥物組合物的形式使用。反義寡核苷酸必須先通過細(xì)胞膜才能與編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白的mRNA特異性地結(jié)合并阻止它的翻譯。該組合物存在于適宜的可藥用載體中，例如無菌無熱原的鹽水溶液。本發(fā)明的物質(zhì)可以用能夠通過細(xì)胞膜的疏水性載體來配制，例如在脂質(zhì)體中配制，所述脂質(zhì)體處于可藥用含水載體中，并且選擇性地含有表面活性劑或脂質(zhì)。此外，還可將寡核苷酸與能夠滅活mRNA的物質(zhì)例如核酶偶聯(lián)，以更完全地抑制翻譯。藥物制劑還可以含有嵌合的分子，其中，反義寡核苷酸與已知可以被細(xì)胞內(nèi)化的分子連接。這些寡核苷酸軛合物利用細(xì)胞攝取途徑來增加寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)濃度。以該方式應(yīng)用的分子的例子是大分子，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白(與寡核苷酸通過多溶素連接)和鏈霉抗生物素以及本領(lǐng)域已知的其它大分子。本發(fā)明的方法還使用在藥物制劑中的反義化合物，例如在脂質(zhì)顆?；蚰覂?nèi)，例如脂質(zhì)體或微晶。顆粒可以是任何適宜的結(jié)構(gòu)，例如單層的或多層的結(jié)構(gòu)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在脂質(zhì)體內(nèi)。對于這些顆粒和囊，特別優(yōu)選帶正電荷的脂質(zhì)，例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨甲基硫酸鹽，或稱為“DOTAP”。但是，其它的脂質(zhì)也是適合的，并且事實(shí)上可能更加適合。所述脂質(zhì)顆粒的制備是公知的。參見，例如，美國專利4,880,635(授予Janoff等)、4,906,477(授予Kurono等)、4,911,928(授予Wallach)、4,917,951(授予Wallach)、4,920,016(授予Allen等)、4,921,757(授予Wheatley等)，其相關(guān)的部分全文引入本文作為參考。本發(fā)明的方法可以通過任何方法來施用反義寡核苷酸，優(yōu)選可以使輸送最少的方法，例如在腦、肺、腎、心臟、睪丸等原位給藥。
向肺施用物質(zhì)可以通過任何適宜的方法來完成，但優(yōu)選以可吸入制劑的形式通過呼吸系統(tǒng)給藥，更優(yōu)選以含有可吸入顆粒的氣霧劑的形式給藥，所述可吸入顆粒含有用于由患者吸入的物質(zhì)?？晌腩w粒可以是氣體、液體或固體形式的，它們可以選擇性地含有其它治療成分和制劑成分。本發(fā)明的顆粒優(yōu)選是可吸入大小的顆粒，優(yōu)選足夠小從而可以在吸入時(shí)通過口腔和喉并進(jìn)入到肺部的支氣管和肺泡。通常，約0.5至10微米范圍內(nèi)的顆粒是可吸入的。但是，其它的尺寸也是適宜的。包含在可吸入制劑中的直徑較大的不可吸入尺寸大小的顆粒有可能沉積在喉道并且可能被吞下。因此，最好將氣霧劑中不可吸入顆粒的量減至最少。對于經(jīng)鼻給藥，優(yōu)選10-500μm范圍內(nèi)的顆粒以確保它們能夠停留在鼻腔內(nèi)。含有所述物質(zhì)的液體顆粒的氣霧劑可以通過任何適宜的方法產(chǎn)生，例如使用吹入器或霧化器。參見，例如美國專利號4,501,729。適宜的拋射劑包括溶劑，例如某些氯氟化碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和/或它們的混合物。其它拋射劑也是適合的，并且當(dāng)其更適于具體的應(yīng)用時(shí)，它們可能是優(yōu)選的。制劑還可以含有一種或多種助溶劑例如乙醇；表面活性劑例如油酸或脫水山梨醇三油酸酯；抗氧劑和適宜的矯味劑。反義寡核苷酸可以通過立體定位的方法或通過向CNS的靶隔離區(qū)域注射向腦給藥，所有這些方法均是本領(lǐng)域已知的?；蛘?，可以將寡核苷酸以本領(lǐng)域已知的可以通過血腦屏障的制劑形式給藥，例如，可以用鏈霉抗生物素和抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體的軛合物作為向腦輸送單生物素化的肽、反義寡核苷酸(磷酸二酯的3′-生物素化或其它衍生物)和肽-寡核苷酸的通用載體。參見，例如，Levy，R.M.等，J.Neuroviral 3Suppl574-75(1997)；Wu-Pong和Gewirtz，BioPharm，pp.32-38(Jan.1999)；Boado，R.J.，等，J.Pharm.Sci.87(11)1308-1315(1998)。向心臟、肝和腎以及其它器管給藥可以通過原位給藥技術(shù)來進(jìn)行，例如導(dǎo)管插入、注射和局部擴(kuò)散，所有這些均是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Lewis，K.J.等，J.Drug Target，5(4)291(1998)；Ayrin，M.A.等，Cathet.Cardiovasc.Diagn，41(3)232-240(1997)；Luft，F(xiàn).C.，J.Molec.Med.76(2)75(1998)。這些給藥通常用所述物質(zhì)的液體、固體或氣體藥物組合物來進(jìn)行，這些藥物組合物可以通過將反義寡核苷酸與適宜的溶媒或載體如無菌無熱原的水、脂質(zhì)和/或其它藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體混合來制備。還可以含有其它治療化合物以及本領(lǐng)域已知的其它制劑成分。含有本發(fā)明的微粉化的物質(zhì)的干燥顆粒的固體顆粒組合物可以通過如下方法制備將干燥的反義化合物用研缽和研棒研磨，然后將研磨的微粉化的組合物過篩(例如400目篩)以破碎或分離顆粒的大塊。含有反義化合物的固體顆粒組合物還可以選擇性地含有分散劑和其它已知的物質(zhì)，其作用是有助于形成霧或氣霧劑。適宜的分散劑是乳糖，它可以與反義化合物以任何適宜的比例混合，約為1∶1w/w。也可以使用其它比例，并且還可以含有其它治療劑和制劑成分。本專利中引用的參考文獻(xiàn)的相關(guān)部分均引入本文作為參考，特別是那些有助于實(shí)現(xiàn)和書面描述本發(fā)明各方面的出版物和專利。
反義化合物的給藥劑量通常隨著靶點(diǎn)、功能及其放大作用、所研究的疾病、個(gè)體的條件、具體的制劑、給藥的途徑和部位、給藥時(shí)間等。通常，優(yōu)選獲得0.05至50μM、或更優(yōu)選0.2至5μM的寡核苷酸細(xì)胞內(nèi)濃度。但是，優(yōu)選測定劑量-反應(yīng)曲線以便確定適宜的劑量來觀察明確的反應(yīng)。所用的劑量可以改變，例如，通常采用約0.001、約0.01、約1mg/kg至約50、約100和約150mg/kg的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，對于特殊應(yīng)用，也可以采用更高和更低的劑量。這些劑量可以給藥一次或根據(jù)需要在一段時(shí)間內(nèi)(例如每24小時(shí))給藥，但也可以采用其它的給藥方案。用以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，不應(yīng)將這些實(shí)施例看作是對本發(fā)明的限定。在這些實(shí)施例中，μM表示微摩爾，mL表示毫升，μm表示微米，mm表示毫米，cm表示厘米，℃表示攝氏度，μg表示微克，mg表示毫克，g表示克，kg表示千克，M表示摩爾，hrs表示小時(shí)。實(shí)施例實(shí)施例1反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成針對靶受體的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)可能需要了解靶受體mRNA的復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。在得到該結(jié)構(gòu)之后，設(shè)計(jì)靶向mRNA區(qū)域的反義核苷酸，所述區(qū)域可被認(rèn)為賦予mRNA功能活性或穩(wěn)定性，且最好可與起始密碼子重疊。其他靶位點(diǎn)是易于使用的。作為反義作用的特異性的實(shí)證，其他不完全與靶mRNA互補(bǔ)但在w/w基礎(chǔ)上含有相同核苷酸組成的寡核苷酸，作為對照包含在反義實(shí)驗(yàn)中。例如，分析腺苷A1受體的mRNA二級結(jié)構(gòu)，并如上述將其用于設(shè)計(jì)硫代磷酸反義寡核苷酸。合成的反義寡核苷酸被命名為HAdA1AS，具有如下序列5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO1)。作為對照，合成錯(cuò)配的硫代磷酸反義核苷酸，其被命名為HAdA1MM1，具有如下序列5′-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3′(SEQ IDNO2)。各寡核苷酸具有相同的堿基含量和通用的序列結(jié)構(gòu)。在GENBANK(釋放85.0)和EMBL(釋放40.0)中進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示，反義寡核苷酸特異性針對人和兔的腺苷A1受體基因，且錯(cuò)配的對照不是用任何已知基因序列進(jìn)行的雜交的候選物。腺苷A3受體mRNA的二級結(jié)構(gòu)類似地進(jìn)行分析，并如上述用于設(shè)計(jì)二硫代磷酸反義寡核苷酸。合成的第一個(gè)反義寡核苷酸(HAdA3AS1)具有如下序列5′-GTT GTT GGG CAT CTT GCC-3′(SEQ ID NO3)。作為對照，合成一錯(cuò)配的硫代磷酸反義寡核苷酸(HAdA3MM1)，具有如下序列5′-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3′(SEQ ID NO4)。還設(shè)計(jì)并合成了第二個(gè)硫代磷酸反義寡核苷酸(HAdA3AS2)，其具有如下序列5′-GTGGGC CTA GCT CTC GCC-3′(SEQ ID NO5)。其對照寡核苷酸(HAdA3MM2)具有序列5′-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3′(SEQ IDNO6)。硫代磷酸寡核苷酸用Applied Biosystems 396型寡核苷酸合成儀合成，并利用NENSORB層析(DuPont，MD)進(jìn)行純化。實(shí)施例2腺苷A1受體反義寡核苷酸的體內(nèi)測定利用肺腺癌細(xì)胞HTB-54，測定上述針對人A1受體的反義寡核苷酸(SEQ ID NO1)在體外模型中的功效。利用標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡方法和在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和合成的受體探針，證實(shí)HTB-54肺腺癌細(xì)胞表達(dá)A1腺苷受體。將HTB-54人肺腺癌細(xì)胞(106/100mm的組織培養(yǎng)皿)暴露于5.0μM HAdA1AS或HAdA1MM1 24小時(shí)，在溫育后12小時(shí)更換新鮮的培養(yǎng)基和寡核苷酸。在暴露于寡核苷酸24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)方法提取其RNA。合成對應(yīng)于由反義序列(并因此具有與所述反義序列相同的序列，但不是硫代磷酸化的)靶向的mRNA區(qū)域的A 21-聚探針，并將其用于探查RNA的RNA印跡，所述RNA從經(jīng)HAdA1AS處理、HAdA1MM1處理和非處理的HTB-54細(xì)胞制備得到。這些印跡清楚地顯示，HAdA1AS而不是HAdA1MM1有效地減少＞50％的人腺苷受體mRNA。該結(jié)果顯示，HAdA1AS是抗哮喘藥的一個(gè)良好的候選物，因?yàn)樗鼌T乏針對參與哮喘的腺苷A1受體的細(xì)胞內(nèi)mRNA。實(shí)施例3腺苷A1受體反義寡核苷酸的體內(nèi)功效在與起始密碼子重疊的腺苷A1基因內(nèi)，兔和人DNA序列的偶然同源性使硫代磷酸反義寡核苷酸能夠使用，所述硫代磷酸反義寡核苷酸最初是被設(shè)計(jì)用于在兔模型中對抗人腺苷A1受體。用混有10％高嶺土的312抗原單位/ml的屋塵螨(D.farinae)提取物(BerkeleyBiologicals，Berkeley，CA)，在出生后的24小時(shí)內(nèi)對無巴斯德氏菌屬的新生新西蘭白兔進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫。在第一個(gè)月，每周重復(fù)免疫一次，然后在接下來的2個(gè)月，隔周免疫一次。用氯胺酮鹽酸鹽(44mg/kg)和乙酰丙嗪馬來酸鹽(0.4mg/kg)的混合物，經(jīng)肌肉內(nèi)給藥，使8只3-4個(gè)月大的已致敏的兔麻醉和松弛。然后，將兔以一舒適的姿勢面朝上放置在一個(gè)小的模塑填塞型動(dòng)物板上，把4.0-mm的氣管內(nèi)導(dǎo)管(Mallinkrodt，Inc.，Glens Falls，NY)插入。將一連有乳膠球的外經(jīng)2.4mm的聚乙烯導(dǎo)管插入到食道中，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中和嘴部保持相同的距離(大約16cm)。將氣管內(nèi)導(dǎo)管與開啟的Fleisch呼吸速度描記器(尺寸00；DOM Medical，Richmond，VA)相連，并利用由Gould載波放大器(11-4113型；Gould Electronic，Cleveland，OH)驅(qū)動(dòng)的Validyne壓差傳感器(DP-45161927型；Validyne Engineering Corp.，Northridge，CA)來測量氣流量。將食道球與壓差傳感器的一側(cè)相連，并將氣管內(nèi)導(dǎo)管的流出口連接到壓力傳感器的另一側(cè)，以允許記錄肺與肺內(nèi)腔之間的壓差。綜合氣流量，給出一連續(xù)的定時(shí)漲落量，并利用自動(dòng)呼吸分析儀(6型；Buxco，Sharon，CT)分別在等容和氣流零點(diǎn)計(jì)算總肺阻力(RL)和動(dòng)態(tài)伸縮率(Cdyn)的測量值。隨機(jī)選擇動(dòng)物，獲得針對氣霧劑化腺苷的處理前第1天PC50值。反義(HAdA1AS)或錯(cuò)配的對照(HAdA1MM)寡核苷酸溶于無菌生理鹽水中，濃度為5000μg(5mg)/1.0ml。隨后經(jīng)氣管內(nèi)導(dǎo)管向動(dòng)物給予氣霧劑化的反義或錯(cuò)配寡核苷酸(大約5000μg，體積為1.0ml)，每天兩次，共兩天。通過超聲霧化器(DeVilbiss，Somerset，PA)生成鹽水、腺苷或者反義或錯(cuò)配寡核苷酸的氣霧劑，產(chǎn)生氣霧劑液滴，其中80％的直徑小于5μm。在第一批實(shí)驗(yàn)中，向4只隨機(jī)選擇的變態(tài)反應(yīng)兔給予反義寡核苷酸，向另4只給予錯(cuò)配的對照寡核苷酸。在第三天的早晨，獲得PC50值(將支氣管導(dǎo)管的動(dòng)態(tài)伸縮率從基線值降低50％所必需的氣霧劑化腺苷濃度，mg/ml)，并與在暴露于寡核苷酸前這些動(dòng)物的PC50值相比較。在間隔1周后，對動(dòng)物交換給藥，向那些先前給予錯(cuò)配對照寡核苷酸的動(dòng)物現(xiàn)在給予反義寡核苷酸，向那些先前給予反義寡核苷酸的動(dòng)物現(xiàn)在給予錯(cuò)配對照寡核苷酸。處理方法和測量和在第一批實(shí)驗(yàn)中所使用的相同。應(yīng)注意到，在至多達(dá)到腺苷的溶解度極限20mg/ml下，在8只用反義寡核苷酸處理的動(dòng)物中有6只不能產(chǎn)生由腺苷介導(dǎo)的支氣管收縮。出于計(jì)算的目的，這些動(dòng)物的PC50值被設(shè)定為20mg/ml。因此，給出的這些值代表了反義效果的最小值。實(shí)際的效果更高。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于下表4中。
表4腺苷A1受體反義寡核苷酸對哮喘兔中的PC50值的影響錯(cuò)配對照A1受體反義寡核苷酸
結(jié)果表示為平均值(n＝8)±SEM。
通過偏差的重復(fù)分析(ANOVA)和Tukey氏保護(hù)實(shí)驗(yàn)，確定顯著性。
**和其他所有組有顯著性差異，p＜0.01。
在兩批實(shí)驗(yàn)中，接受反義寡核苷酸的動(dòng)物表現(xiàn)出使肺動(dòng)態(tài)伸縮率降低50％所需的氣霧劑化腺苷劑量大大增加。沒有觀察到錯(cuò)配的對照寡核苷酸對PC50值的影響。在接受反義或吸入對照寡核苷酸的動(dòng)物中，沒有觀察到毒性。這些結(jié)果清楚地表明，在肺病中，肺具有作為反義寡核苷酸基治療性干預(yù)的靶的異常潛能。它們還表明，在與人哮喘非常類似的模型系統(tǒng)中，下調(diào)腺苷A1受體，大大消除哮喘氣道中由腺苷介導(dǎo)的支氣管收縮。人哮喘的變態(tài)反應(yīng)兔模型中，支氣管超常反應(yīng)是極好的反義干預(yù)終末點(diǎn)，這是因?yàn)閰⑴c該反應(yīng)的組織位于氣霧劑化寡核苷酸接觸點(diǎn)的附近，且該模型精密地模仿一重要的人類疾病。實(shí)施例4A1-腺苷受體反義寡核苷酸的特異性在上述實(shí)施例3的交換實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，定量分析所有兔的氣道平滑肌的腺苷A1受體數(shù)。作為反義寡核苷酸的特異性的對照，本不應(yīng)受影響的腺苷A2受體也被量化。從各兔中切下氣道平滑肌組織，按照Kleinstein等的方法(Kleinstein，J.和Glossmann，H.，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.305191-200(1978))并加以少數(shù)修改來制備膜級分，該文獻(xiàn)的相關(guān)部分由此以全文引入本文作參考。粗制的質(zhì)膜制品保存在70℃直至測定。用Bradford的方法(M.Bradford，Anal.Biochem.72，240-254(1976)，該文獻(xiàn)的相關(guān)部分由此以全文引入本文作參考)確定蛋白含量。冷凍的質(zhì)膜在室溫下解凍，并與0.2U/ml腺苷脫氨酶在37℃溫育30分鐘，以移去內(nèi)源性腺苷。[3H]DPCPX(A1受體特異性的)或[3H]CGS-21680(A1受體特異性的)的結(jié)合，如上所述利用Ali等的方法(Ali，S.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.268，Am.J.Physiol266，L271-277(1994)進(jìn)行測量，該文獻(xiàn)的相關(guān)部分由此以全文引入本文作參考)。與對照相比，在交換實(shí)驗(yàn)中用腺苷A1反義寡核苷酸處理的動(dòng)物在A1受體數(shù)上減少約75％，正如利用A1-特異性拮抗劑DPCPX的特異性結(jié)合所測得的。腺苷A2受體數(shù)并沒有改變，正如利用A2受體-特異性激動(dòng)劑2-[對(2-羧乙基)-苯乙基氨基]-5′-(N-乙基羧酰氨基)腺苷(CGS-21680)的特異性結(jié)合所測得的。該結(jié)果列于下表5中。下面的結(jié)果說明反義寡核苷酸治療氣道疾病的效果。由于上述反義寡核苷酸消除對由腺苷介導(dǎo)的支氣管收縮起作用的受體系統(tǒng)，因此從其中消除腺苷可能不十分必要。但是，優(yōu)選在這些寡核苷酸中消除腺苷，以減少獲得類似作用所需的劑量。靶向參與炎癥的蛋白的mRNA的其他反義寡核苷酸如上所述。從其所含的核苷酸中消除腺苷，以防止其在降解過程中釋放。
表5腺苷A1受體反義寡核苷酸作用的特異性錯(cuò)配對照 A1反義寡核苷酸 寡核苷酸
結(jié)果表示為平均值(n＝8)±SEM。
通過偏差的重復(fù)分析(ANOVA)和Tukey氏保護(hù)實(shí)驗(yàn)，確定顯著性。
**和錯(cuò)配對照有顯著性差異，p＜0.01。
實(shí)施例5指向其他靶核酸的反義寡核苷酸進(jìn)行本工作是為了證明本發(fā)明廣泛適用于對核酸靶廣泛特異的反義寡核苷酸(“寡核苷酸”)。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究是為了顯示本發(fā)明的方法廣泛適用于如本申請所述和所設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸一起使用，并靶向任何腺苷受體mRNA。出于此目的，針對腺苷受體mRNA如腺苷A1、A2b和A3受體mRNA制備了多種反義寡核苷酸。反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)如上所述。其他的5種反義硫代磷酸寡核苷酸如上述設(shè)計(jì)并合成。
1-寡核苷酸II(SEQ ID NO7)也靶向腺苷A1受體，但和寡核苷酸I靶向不同的區(qū)域。
2-寡核苷酸V(SEQ ID NO10)靶向腺苷A2b受體。
3-寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和IV(SEQ ID NO9)靶向腺苷A3受體的不同區(qū)域。
4-寡核苷酸I-PD(SEQ ID NO11)(具有和寡核苷酸I相同的序列的磷酸二酯寡核苷酸)。
這些反義寡核苷酸被設(shè)計(jì)用于治療選定的物種，并對該物種普遍特異，除非其他物種的靶mRNA的節(jié)段碰巧含有相似的序列。如下所述制備所有反義寡核苷酸，并在兔模型中體內(nèi)測定其對支氣管收縮、炎癥和變態(tài)反應(yīng)的效果，其造成呼吸困難且肺氣道受阻，作為哮喘等病例，正如上述申請中所述。實(shí)施例6其他反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和序列研究了6種寡核苷酸及其在兔模型的作用，這些研究的結(jié)果如下報(bào)告并討論。選擇這些寡核苷酸中的5種用于本研究，以補(bǔ)充上述實(shí)施例1至4中提供的寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的數(shù)據(jù)。該寡核苷酸對腺苷A1受體mRNA的一個(gè)區(qū)域是反義的。所測的寡核苷酸被命名為靶向腺苷A1受體mRNA不同區(qū)域的反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)和II(SEQ ID NO7)，靶向腺苷A2b受體的mRNA的寡核苷酸V(SEQ IDNO8)，和靶向腺苷A3受體mRNA的兩個(gè)不同區(qū)域的反義寡核苷酸III和IV(SEQ ID NO9和10)。第6種寡核苷酸(寡核苷酸I-PD)是寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的磷酸二酯形式。按照上述實(shí)施例1，進(jìn)行這些反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成。
(I)反義寡核苷酸I上述實(shí)施例1至4所述的反義寡核苷酸I靶向人A1腺苷受體mRNA(EPI 2010)。反義寡核苷酸I長21個(gè)核苷酸，與起始密碼子重疊，并具有以下序列5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3′(SEQID NO1)。寡核苷酸I先前顯示出抑制變態(tài)反應(yīng)兔中由腺苷誘發(fā)的支氣管收縮，并降低由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的氣道阻塞和支氣管超常反應(yīng)(BHR)，正如上述和由Nyce，J.W.& Metzger，W.J.，Nature，385721(1977)所述，該文獻(xiàn)的相關(guān)部分以全文引入本文作參考。
(II)反義寡核苷酸II按照本發(fā)明設(shè)計(jì)一硫代磷酸反義寡核苷酸(SEQ ID NO7)，其靶向兔腺苷A1受體mRNA區(qū)+936至+956，相對于起始密碼子(起點(diǎn))。反義寡核苷酸II長21個(gè)核苷酸，并具有以下序列5′-CTC GTC GCCGTC GCC GGC GGG-3′(SEQ ID NO7)。
(III)反義寡核苷酸III按照本發(fā)明設(shè)計(jì)一不同于上述實(shí)施例1中所提供的(SEQ ID NO8)的硫代磷酸反義寡核苷酸，其靶向反義A3受體mRNA區(qū)+3至+22，相對于起始密碼子起點(diǎn)。反義寡核苷酸III長20個(gè)核苷酸，并具有以下序列5′-GGG TGG TGC TAT TGT CGG GC-3′(SEQ ID NO8)。
(IV)反義寡核苷酸IV按照本發(fā)明設(shè)計(jì)另一硫代磷酸反義寡核苷酸(SEQ ID NO9)，其靶向腺苷A3受體mRNA區(qū)+386至+401，相對于起始密碼子(起點(diǎn))。反義寡核苷酸IV長15個(gè)核苷酸，并具有如下序列5′-GGC CCA GGGCCA GCC-3′(SEQ ID NO9)。
(V)反義寡核苷酸V按照本發(fā)明設(shè)計(jì)一硫代磷酸反義寡核苷酸(SEQ ID NO10)，其靶向腺苷A2b受體mRNA區(qū)-21至-1，相對于起始密碼子(起點(diǎn))。反義寡核苷酸V長21個(gè)核苷酸，并具有如下序列5′-GGC CGG GCCAGC CGG GCC CGG-3′(SEQ ID NO10)。
(VI)A1錯(cuò)配寡核苷酸兩種具有如下序列的不同的錯(cuò)配寡核苷酸用作上面實(shí)施例5所述的反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的對照A1MM2 5′-GTA GGT GGCGGG CAA GGC GGG-3′(SEQ ID NO12)和A1MM3 5′-GAT GGA GGCGGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO13)。反義寡核苷酸I和兩種錯(cuò)配反義寡核苷酸具有相同的堿基組成和通用的序列結(jié)構(gòu)。在GENBANK(釋放85.0)和EMBL(釋放40.0)中進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明反義寡核苷酸I不僅對人腺苷A1受體基因特異，而且對兔腺苷A1受體基因也特異，錯(cuò)配的對照不是用于和任何已知人類或動(dòng)物基因序列雜交的候選物。
(VII)反義寡核苷酸A1-PD(寡核苷酸VI)如上述申請所公開的，設(shè)計(jì)和寡核苷酸I具有相同序列的磷酸二酯反義寡核苷酸(寡核苷酸VI；SEQ ID NO11)。反義寡核苷酸I-PD長21個(gè)核苷酸，與起始密碼子重疊，并具有如下序列5′-GAT GGAGGG CGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO11)。
(VIII)對照按照與給予(II)、(III)和(IV)中的反義寡核苷酸相同的方案，向各兔給予5.0mL氣霧劑化無菌鹽水。以上是作為G蛋白偶聯(lián)受體的例子給出。但是，減少腺苷含量的方法普遍適用于任何基因和任何靶確認(rèn)系統(tǒng)，其中生物活性腺苷的釋放可使用于真實(shí)體現(xiàn)腺苷受體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變得不清楚。實(shí)施例7反義寡核苷酸的合成利用Applied Biosystems 396型寡核苷酸合成儀，合成具有上面(a)中所述的序列的硫代磷酸反義寡核苷酸，并利用NENSORB層析(DuPont，DE)進(jìn)行純化。在合成過程中，將TETD(二硫化四乙基秋蘭姆)用作硫化劑。用該方法，分別合成并純化反義寡核苷酸II(SEQ IDNO7)、反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和反義寡核苷酸IV(SEQ IDNO9)。實(shí)施例8制備變態(tài)反應(yīng)兔如前所述(Metzger，W.J.，in Late Phase Allergic Reactions，Dorsch，W.，Ed.，CRC Handbook，pp.347-362，CRC Press，BocaRaton(1990)；Ali，S.，Metzger，W.J.和Mustafa，S.J.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.149908(1994))，在出生24小時(shí)內(nèi)，用混有10％高嶺土的0.5mL 312抗原單位/ml的屋塵螨(D.farinae)提取物(BerkeleyBiologicals，Berkeley，CA)對無巴斯德菌的新生新西蘭白兔進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，所述文獻(xiàn)的相關(guān)部分由此以全文引入本文作參考。在第一個(gè)月，每周重復(fù)免疫一次，然后隔周免疫一次直至4個(gè)月大。這些兔擇優(yōu)地產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)原特異性IgE抗體，其一般對氣源性變態(tài)反應(yīng)原產(chǎn)生應(yīng)答，對抗早期和晚期哮喘反應(yīng)，并顯示出支氣管超常反應(yīng)(BHR)。每月經(jīng)腹膜內(nèi)給予變態(tài)反應(yīng)原(312單位塵螨變態(tài)反應(yīng)原，如上所述)，這持續(xù)刺激并維持變態(tài)反應(yīng)原特異性IgE抗體和BHR。如Ali等所述(Ali，S.，Metzger，W.J.和Mustafa，S.J.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.149(1994))，制備4個(gè)月大的致敏兔用于氣霧劑給藥，所述文獻(xiàn)的相關(guān)部分以全文引入本文作參考。劑量-反應(yīng)研究
(2)反義寡核苷酸I削弱由腺苷誘發(fā)的支氣管收縮和由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的支氣管收縮。
(3)寡核苷酸I削弱支氣管超常反應(yīng)，如用PC50組胺所測得的，其為評價(jià)支氣管超常反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測量法。該結(jié)果清楚地證明反義寡核苷酸I的抗炎活性，如表4、5和6中所示。
(4)正如所料，由于它被設(shè)計(jì)用于靶向目標(biāo)，因此反義寡核苷酸I是對腺苷A1受體完全特異的，且在任何劑量下對緊密相關(guān)的腺苷A2受體或相關(guān)的緩激肽B2受體沒有任何作用。參見下表6。
(5)與寡核苷酸I的上述作用不同，錯(cuò)配對照分子MM2和MM3(SEQ ID NO12和SEQ ID NO13)具有相同的堿基組成和分子量但分別因6和2個(gè)錯(cuò)配而不同于反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)。這些錯(cuò)配在仍保留相同堿基組成的情況下具有最小的可能性，它們對任何被靶向的受體(A1、A2或B2)絕對沒有影響。
在完全沒有有關(guān)反義寡核苷酸，例如靶向腺苷A1受體的寡核苷酸I應(yīng)用的現(xiàn)有技術(shù)情況下，這些結(jié)果是未預(yù)料到的結(jié)果。在本專利中公開的結(jié)果清楚地賦予并證明應(yīng)用藥物并靶向基因或mRNA的有效方法在預(yù)期用途上的功效，所述基因或mRNA與和肺部功能如氣道阻塞、支氣管收縮、肺炎和變態(tài)反應(yīng)等相關(guān)的一個(gè)功能或終末點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。實(shí)施例20寡核苷酸I顯著降低對腺苷的反應(yīng)在上面的實(shí)施例12中描述了受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示于下表6中，該表顯示了從經(jīng)A1腺苷受體和B2緩激肽受體反義和錯(cuò)配處理變態(tài)反應(yīng)兔的氣道平滑肌中分離的膜中的腺苷A1選擇性配體[3H]DPCPX和緩激肽B2選擇性配體[3H]NPC 17731的結(jié)合特性。
表6三種反義寡核苷酸的結(jié)合特性處理1A1受體 B2受體Kd BmaxKd Bmax腺苷A1受體20mg 0.36±0.029nM 19±1.52fmoles*0.39±0.031nM 14.8±0.99fmoles2mg0.38±0.030nM 32±2.56fmoles*0.41±0.028nM 15.5±1.08fmoles0.2mg0.37±0.030nM 49±3.43fmoles 0.34±0.024nM 15.0±1.06fmolesA1MM1(對照)20mg 0.34±0.027nM 52.0±3.64fmoles 0.35±0.024nM 14.0±1.0fmoles2mg 0.37±0.033nM 51.8±3.88fmoles 0.38±0.028nM 14.6±1.02fmolesB2A(緩激肽受體)20mg 0.36±0.028nM 45.0±3.15fmoles 0.38±0.027nM 8.7±0.62fmoles*2mg 0.39±0.035nM 44.3±2.90fmoles 0.34±0.024nM 11.9±0.76fmoles**0.2mg0.40±0.028nM 47.0±3.76fmoles 0.35±0.028nM 15.1±1.05fmolesB2MM(對照)20mg 0.39±0.031nM 42.0±2.94fmoles 0.41±0.029nM 14.0±0.98fmoles2mg 0.41±0.035nM 40.0±3.20fmoles 0.37±0.030nM 14.8±0.99fmoles0.2mg0.37±0.029nM 43.0±3.14fmoles 0.36±0.025nM 15.1±1.35fmoles鹽水 0.37±0.041 46.0±5.21 0.39±0.047nM 14.2±1.35fmoles對照1是指在48小時(shí)內(nèi)分4次給予的總寡核苷酸。如方法中所述，進(jìn)行處理和分析。利用對偏差進(jìn)行的重復(fù)測量分析(ANOVA)和Tukey氏保護(hù)t檢驗(yàn)，確定顯著性。對于所有組，n＝4-6。
*與錯(cuò)配對照-和鹽水處理組有顯著性差異，p＜0.001；**與錯(cuò)配對照-和鹽水處理組有顯著性差異，p＜0.05。實(shí)施例21寡核苷酸I劑量-反應(yīng)作用如下表7中所示，在所測的劑量范圍內(nèi)，反義寡核苷酸I(SEQ IDNO1)被發(fā)現(xiàn)以劑量依賴性方式降低給予動(dòng)物的腺苷的作用。
表7針對反義寡核苷酸I的劑量-反應(yīng)作用總劑量 PC50腺苷(mg) (mg腺苷)反義寡核苷酸I0.28.32″7.22.014.0″7.220 19.5″0.34A1MM2寡核苷酸(對照)0.22.51±0.462.03.13±0.7120 3.25±0.34上述結(jié)果用斯氏成對t檢驗(yàn)進(jìn)行研究，并被發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＝0.05寡核苷酸I(SEQ ID NO1)是對抗腺苷A1受體的一種寡核苷酸，它特異性地與腺苷A1受體作用，但不與腺苷A2受體作用。如上面的實(shí)施例9和Nyce & Metzger(1997，同上)所述(4次劑量，每次5mg，間隔8-12小時(shí)，經(jīng)氣管內(nèi)導(dǎo)管經(jīng)霧化器給藥)，用反義寡核苷酸I(SEQID NO1)或錯(cuò)配對照寡核苷酸(SEQ ID NO12；A1MM2)處理兔，切下支氣管平滑肌組織并如Nyce & Metzger(1997，同上)所述確定腺苷A1和腺苷A2受體的數(shù)目，進(jìn)而得到以上結(jié)果。實(shí)施例22寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對靶基因產(chǎn)物的特異性寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對腺苷A1受體是特異性，而其錯(cuò)配對照則沒有活性。


圖1顯示從交換實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果，所述交換實(shí)驗(yàn)述于上面的實(shí)施例10和Nyce & Metzger(1997，同上)中。兩個(gè)錯(cuò)配對照(SEQ ID NO12和SEQ ID NO13)對PC50腺苷值沒有影響。相反，給予反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)則顯示出PC50腺苷值增加7倍。結(jié)果清楚地說明，當(dāng)與鹽水對照進(jìn)行比較時(shí)，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)降低對外源給藥的腺苷的反應(yīng)(削弱敏感性)。上表6中所示的結(jié)果清楚地說明，反義寡核苷酸I的作用是劑量依賴性的(參見表6的第3列)。寡核苷酸I還顯示出對腺苷A1受體完全特異(參見表6的前3行)，沒有對緊密相關(guān)的腺苷A2受體或緩激肽B2受體的任何活性(參見上表6第8-10行)。此外，表6所示的結(jié)果說明，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)以劑量依賴性方式降低對腺苷的敏感性，且它是以反義寡核苷酸依賴性方式來發(fā)揮此作用的，因?yàn)閮蓚€(gè)錯(cuò)配對照寡核苷酸(A1MM2SEQID NO12和A1MM3SEQ ID NO13)中無一顯示出對PC50腺苷值有任何的影響或減少腺苷A1受體數(shù)。實(shí)施例23對由氣源性變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的支氣管收縮和炎癥的影響在兔模型中，當(dāng)與錯(cuò)配寡核苷酸進(jìn)行比較時(shí)，寡核苷酸I(SEQ IDNO1)顯示出顯著降低由組胺誘導(dǎo)的作用。在變態(tài)反應(yīng)兔中評價(jià)反義寡核苷酸I(SEQ ID No1)和錯(cuò)配寡核苷酸(A1MM2，SEQ ID NO12和A1MM3，SEQ ID NO12)對由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的氣道阻塞和支氣管超常反應(yīng)的作用。評價(jià)了反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的氣道阻塞的作用。正如從標(biāo)繪的曲線下的區(qū)域計(jì)算出的，當(dāng)與錯(cuò)配的對照進(jìn)行比較時(shí)，反義寡核苷酸I顯著抑制由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的氣道阻塞(55％，p＜0.05；重復(fù)測量ANOVA和Tukey氏t檢驗(yàn))。錯(cuò)配寡核苷酸A1MM2(對照)對由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的氣道阻塞完全無效。如上確定了反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的BHR的作用。正如從PC50組胺值計(jì)算出的，當(dāng)與錯(cuò)配的對照進(jìn)行比較時(shí)，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)顯著抑制變態(tài)反應(yīng)兔中由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的BHR(61％，p＜0.05；重復(fù)測量ANOVA，Tukey氏t檢驗(yàn))。觀察到A1MM錯(cuò)配對照對由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的BHR完全無效。結(jié)果表明，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對于防止由氣源性變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的支氣管收縮(屋塵螨)是有效的。此外，還發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)由塵螨誘發(fā)的支氣管超常反應(yīng)的強(qiáng)抑制劑，如其對組胺敏感性的影響所示，所述組胺敏感性表明反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的抗炎活性。結(jié)果表明，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO 1)對于防止由氣源性變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的支氣管收縮(屋塵螨)是有效的。此外，還發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸I(SEQ ID NO 1)是由塵螨誘發(fā)的支氣管超常反應(yīng)的強(qiáng)抑制劑，如其對組胺敏感性的影響所示，所述組胺敏感性表明反義寡核苷酸I(SEQID NO1)的抗炎活性。實(shí)施例24低A含量的反義寡核苷酸I沒有有害的副作用寡核苷酸I(SEQ ID NO1)顯示出沒有可能對受體有毒性的副作用。在給予2.0或20mg寡核苷酸I(SEQ ID NO1)后，沒有觀察到動(dòng)脈血壓、心臟輸出、心搏量、心率、總外周阻力或心臟收縮性(dPdT)發(fā)生變化。此外，對用CardiomaxJ儀器(Columbus Instruments，Ohio)測量的心臟輸出(CO)、心搏量(SV)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)、總外周阻力(TPR)和收縮性(dPdT)結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。這些結(jié)果證明，寡核苷酸I(SEQ ID NO1)對關(guān)鍵的心血管參數(shù)沒有有害的影響。更具體而言，該寡核苷酸不會(huì)引起低血壓。此發(fā)現(xiàn)特別重要，因?yàn)槠渌虼姿岱戳x寡核苷酸在過去一直顯示出在一些模型系統(tǒng)中誘發(fā)低血壓。此外，腺苷A1受體在心臟內(nèi)的竇房傳導(dǎo)中起著重要的作用。因此，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)減少腺苷A1受體，預(yù)期可能導(dǎo)致隨受體的下調(diào)出現(xiàn)有害的肺外活性。這并非如此。反義寡核苷酸I(SEQ IDNO1)不產(chǎn)生任何有害的肺內(nèi)作用，它使本發(fā)明反義寡核苷酸的低劑量給藥不產(chǎn)生預(yù)料之外的、不希望的副作用。這證明，當(dāng)寡核苷酸I(SEQID NO1)直接給藥到肺時(shí)，它不會(huì)以有效引起有害作用的量到達(dá)心臟。這與傳統(tǒng)的腺苷受體拮抗劑如茶堿相反，傳統(tǒng)的腺苷受體拮抗劑離開肺并可在肺引起有害的、甚至是威脅生命的作用。實(shí)施例25寡核苷酸I的持久作用寡核苷酸I(SEQ ID NO1)證明了一種持久作用，正如在腺苷攻擊前給予寡核苷酸I的情況下獲得的PC50和阻力值所證明的。當(dāng)如上所述以4次等劑量、每次5mg經(jīng)氣管內(nèi)導(dǎo)管利用霧化器給藥時(shí)，針對腺苷反義寡核苷酸I的PC50，測量作用的持久性。在給藥后第1-8天，該物質(zhì)作用顯著。當(dāng)反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的作用消失時(shí)，向動(dòng)物給予鹽水氣霧劑(對照)，再次測量所有動(dòng)物的PC50腺苷值。經(jīng)鹽水處理的動(dòng)物顯示出基線PC50腺苷值(n＝6)。測量如上所述給予了20mg反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)的6只變態(tài)反應(yīng)兔中作用的持久性(針對阻力)，也如上所述測量針對氣道阻力的作用持久性。針對PC50腺苷(p＜0.05)和阻力(p＜0.05)計(jì)算出的作用持久性中值均為8.3天。這些結(jié)果表明，反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)具有極長的作用持久性，這是完全沒有料到的。實(shí)施例26無腺苷反義寡核苷酸II優(yōu)于反義寡核苷酸I反義寡核苷酸II靶向腺苷A1受體mRNA的不同區(qū)域，發(fā)現(xiàn)它具有高度的活性來對抗由腺苷A1介導(dǎo)的作用。實(shí)驗(yàn)測量了當(dāng)如上所述將20mg反義寡核苷酸II或鹽水(對照)給予兩組變態(tài)反應(yīng)兔時(shí)，反義寡核苷酸II(SEQ ID NO7)給藥對伸縮率和阻力值的影響。如上面實(shí)施例13中所述給予腺苷或鹽水之后，測量伸縮率和阻力值。本發(fā)明反義寡核苷酸的作用以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式與對照相區(qū)別，對于伸縮率，利用成對t-檢驗(yàn)時(shí)p＜0.05；對于阻力，p＜0.01。結(jié)果表明，靶向腺苷A1受體且不含腺苷的反義寡核苷酸II(SEQ ID NO7)，在腺苷攻擊的情況下有效地維持伸縮率并減小阻力。事實(shí)上，無腺苷的反義寡核苷酸II比低腺苷的反義寡核苷酸I(SEQ ID NO1)更強(qiáng)。因?yàn)樗缓佘?，所以它在降解過程中不釋放出腺苷，因此它不促進(jìn)對腺苷受體的激活。實(shí)施例27反義寡核苷酸III和IV
事實(shí)上，在如上所述分別向變態(tài)反應(yīng)兔給予20mg反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和IV(SEQ ID NO9)的情況下，寡核苷酸III(SEQ IDNO8)和IV(SEQ ID NO9)通過其對減少炎癥和存在的炎癥細(xì)胞數(shù)的作用，顯示出特異性地靶向腺苷A3受體。3小時(shí)后，通過計(jì)數(shù)在其支氣管灌洗液中確定炎癥細(xì)胞數(shù)，每次灌洗至少100個(gè)活細(xì)胞。在暴露于塵螨變態(tài)反應(yīng)原后，評價(jià)反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和IV(SEQID NO9)對支氣管灌洗中的粒細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果表明，對于暴露于塵螨變態(tài)反應(yīng)原后的哮喘性肺部，反義寡核苷酸IV(SEQ IDNO9)和反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)是非常強(qiáng)的抗炎劑。正如本領(lǐng)域所公知的，粒細(xì)胞，特別是嗜曙紅細(xì)胞，是哮喘的初級炎癥細(xì)胞，并且，給予反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和IV(SEQ ID NO9)，分別使其數(shù)目減少40％和66％。此外，反義寡核苷酸IV(SEQ ID NO9)和III(SEQ ID NO8)還分別使支氣管灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)減少40％和80％。這也是本發(fā)明抗腺苷A3物質(zhì)抗炎活性的重要指征。已知炎癥是支氣管超常反應(yīng)和哮喘中由變態(tài)反應(yīng)原誘發(fā)的支氣管收縮的原因。靶向腺苷A3受體的反義寡核苷酸III(SEQ ID NO8)和IV(SEQ ID NO9)，均代表一類重要的新抗炎藥，它們可被設(shè)計(jì)用于特異性地靶向各種物種的肺部受體。實(shí)施例28反義寡核苷酸V靶向腺苷A2b腺苷受體mRNA的反義寡核苷酸V(SEQ ID NO10)，顯示出對于對抗由腺苷A2b介導(dǎo)的作用和對于將存在的腺苷A2b受體數(shù)減少到少于50％是高度有效的。實(shí)施例29磷酸二酯殘基被替換的寡核苷酸I-DS(SEQ ID NO11)的出乎意料的優(yōu)越性分別如上所述將寡核苷酸I(SEQ ID NO1)和I-DS(SEQ ID NO11)給予變態(tài)反應(yīng)兔，然后用腺苷來攻擊兔。在對抗腺苷的作用中，磷酸二酯寡核苷酸I-DS(SEQ ID NO11)的有效性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著較差，而寡核苷酸I(SEQ ID NO1)顯示出較高的有效性，并證明PC50腺苷為20mg。實(shí)施例30含單核苷酸的腺苷具有腺苷受體活性此實(shí)施例證明，反義寡核苷酸的體內(nèi)降解產(chǎn)物例如核糖核苷單磷酸，例如dAMP，作用在腺苷受體上。當(dāng)腺苷和腺苷單磷酸(dAMP)以至多達(dá)10mg/ml的不同劑量分別給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，兩個(gè)化合物在降低％伸縮率方面具有相似的作用，如
圖1所示。兩種情況下的作用均隨劑量的增加而加強(qiáng)，而鹽水對照則沒有任何作用。這些結(jié)果表明腺苷核苷以及腺苷自身與腺苷受體相互作用。實(shí)施例31含腺苷核酸的分解產(chǎn)生腺苷受體活性作為另一測試，將隨機(jī)選擇的硫代磷酸反義寡核苷酸核苷給予兔，以確定它們是否在體內(nèi)降解并釋放出能與腺苷受體相互作用的腺苷核苷。向哮喘兔分別給予鹽水(對照)、含腺苷的隨機(jī)物(κ)和脫腺苷的隨機(jī)物(C)。所使用的隨機(jī)物是一不含腺苷的隨機(jī)物，其由鳥苷、胞苷和胸苷的隨機(jī)序列組成，和一含腺苷的隨機(jī)物，其由鳥苷、胞苷和腺苷組成。圖2中所示的結(jié)果清楚地表明，含腺苷的寡核苷酸在降解時(shí)釋放腺苷和/或腺苷核苷，腺苷化合物與腺苷受體相互作用，而不含腺苷的寡核苷酸則不。因此，當(dāng)評價(jià)反義剔除實(shí)驗(yàn)對于靶確認(rèn)的作用時(shí)，腺苷核苷作為反義寡核苷酸的降解產(chǎn)物釋放，將混淆實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)表明，在靶確認(rèn)研究中使用不含腺苷的反義(無A或低A)寡核苷酸的必要性。
以上實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明，而不是作為其限制。本發(fā)明由所附權(quán)利要求所限定。
權(quán)利要求
1.測定在疾病或病癥的功能與編碼據(jù)推測與疾病或病癥有關(guān)的靶多肽的基因或mRNA之間是否存在相關(guān)性的方法，該方法包括獲取含有最多約15％腺苷(A)并且對靶點(diǎn)反義的寡核苷酸，所述靶點(diǎn)選自靶基因及其相應(yīng)的mRNA、選自3′和5′內(nèi)含子-外顯子邊界以及編碼和非編碼區(qū)之間的并列部分的基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)，以及編碼與預(yù)先選定的疾病或病癥有關(guān)的多肽的所有mRNA片段；從所述寡核苷酸中選擇出一種在體外與靶mRNA雜交時(shí)明顯抑制或消除由mRNA所編碼的多肽表達(dá)的寡核苷酸；向個(gè)體施用可以有效地在體內(nèi)與靶mRNA雜交的量的選定的寡核苷酸；和評估在施用寡核苷酸前后與所述疾病或病癥有關(guān)的個(gè)體功能；其中，功能值的改變大于約70％表示正相關(guān)，在約40至約70％之間表示可能相關(guān)，低于約30％表示不相關(guān)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸通過如下方法來構(gòu)建選擇含有至少4個(gè)連續(xù)的選自G和C的核酸的靶片段并獲得4至60個(gè)核苷酸長的含有選定的片段并且C和G的含量為最多約15％的第一寡核苷酸，和/或選擇具有理想的活性類型和/或程度的靶片段。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括，當(dāng)所述反義片段含有至少一個(gè)A時(shí)，將至少一個(gè)A用選自與胸腺嘧啶核苷(T)結(jié)合但具有小于約0.3的A腺苷A1、A2a、A2b和A3受體激動(dòng)劑或拮抗劑活性的雜芳族堿基的替代堿基(B)替換。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的雜芳族堿基選自嘧啶和嘌呤化合物，其可以被O、鹵素、NH2、SH、SO、SO2、SO3、COOH以及支鏈和稠合的伯和仲氨基、烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、鏈烯氧基、酰基、環(huán)酰基、芳基酰基、鏈炔氧基、環(huán)烷氧基、芳?；?、芳硫基、芳基磺酰氧基、鹵代環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基、鏈烯基環(huán)烷基、鏈炔基環(huán)烷基、鹵代芳基、烷基芳基、鏈烯基芳基、鏈炔基芳基、芳基烷基、芳基鏈烯基、芳基鏈炔基、芳基環(huán)烷基所取代，以上所述基團(tuán)又可以被O、鹵素、NH2、伯、仲和叔胺、SH、SO、SO2、SO3、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基和雜芳基取代。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的嘧啶和嘌呤化合物在1、2、3、4、7和8位被取代。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的嘧啶和嘌呤化合物選自茶堿、咖啡因、二羥丙茶堿、乙羥茶堿、哌醋茶堿、巴米茶堿、恩丙茶堿和具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式的黃嘌呤 其中R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、鏈烯基或鏈炔基，R3是H、芳基、二環(huán)烷基、二環(huán)烯基、二環(huán)炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、O-環(huán)烷基、O-環(huán)烯基、O-環(huán)炔基、NH2-烷基氨基-酮氧基烷氧基-芳基和單和二烷基氨基烷基-N-烷基氨基-SO2芳基。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的反義寡核苷酸的腺苷含量為約0至約12％。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的寡核苷酸由最多至約5％的A組成。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的寡核苷酸不含A。
10.權(quán)利要求1的方法，其中有一個(gè)A被選自與胸腺嘧啶核苷結(jié)合但對腺苷A1、A2a、A2b和A3受體具有小于約0.5的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑活性的雜芳族堿基的替代堿基所替換。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所有的A均被選自與胸腺嘧啶核苷結(jié)合但對腺苷A1、A2a、A2b和A3受體具有小于約0.3的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑活性的雜芳族堿基的替代堿基所替換。
12.權(quán)利要求6的方法，其中所述的通用堿基選自3-硝基吡咯-2′-脫氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脫氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脫氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脫氧肌苷、2′-脫氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮或2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤。
13.權(quán)利要求1的方法，其中，如果在所述寡核苷酸中存在至少一個(gè)CpG二核苷酸的話，用甲基化的胞嘧啶(mC)替換至少一個(gè)CpG二核苷酸中的C。
14.權(quán)利要求1的方法，其中，所述反義寡核苷酸的至少一個(gè)核苷酸殘基選自甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼雜磷酸酯、formacetal、thioformacetal、硫醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、砜、亞硫酸酯、亞砜、硫化物、羥基胺、亞甲基(甲基亞氨基)、(MMI)、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)、亞甲基氧基(甲基亞氨基)(MOMA)、甲氧基甲基(MOM)、2′-O-甲基、氨基磷酸酯和C-5取代的殘基及其組合。
15.權(quán)利要求14的物質(zhì)，其中所有的核苷酸連接殘基均是取代了的。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述的反義寡核苷酸含有約7至60個(gè)單核苷酸。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的反義寡核苷酸與選自被細(xì)胞內(nèi)化或攝取的物質(zhì)和細(xì)胞靶向性物質(zhì)的物質(zhì)連接。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的被細(xì)胞內(nèi)化或攝取的物質(zhì)選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白和鏈霉抗生物素。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的核酸與載體連接。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的載體包括原核生物或真核生物載體。
21.權(quán)利要求1的方法，其中將所述反義寡核苷酸向肺、腦、心臟、腎、腫瘤、血液、皮膚、眼、頭皮、鼻通道、睪丸、子宮頸、口腔、咽、食道、小腸或大腸、滑膜組織、肌肉組織、卵巢、耳道給藥或體外給藥。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述的疾病或病癥是影響肺、腦、心臟、腎、腫瘤、血液、免疫系統(tǒng)、皮膚、眼、頭皮、鼻通道、睪丸、子宮頸、口腔、咽、食道、小腸或大腸、滑膜組織、肌肉組織、卵巢和耳道的疾病或病癥。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥是影響肺的疾病或病癥。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥與支氣管收縮、肺炎和/或變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥是影響腦或與腦活動(dòng)有關(guān)的疾病或病癥。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥與免疫機(jī)能障礙有關(guān)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的靶點(diǎn)選自免疫球蛋白、抗體受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、編碼它們的基因和相應(yīng)的mRNA、基因和mRNA側(cè)翼區(qū)以及外顯子和內(nèi)含子邊界。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥是影響心血管系統(tǒng)的疾病或病癥。
29.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥是與胃腸道系統(tǒng)有關(guān)的疾病或病癥。
30.權(quán)利要求22的方法，其中所述的疾病或病癥與惡性腫瘤或癌癥有關(guān)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的靶點(diǎn)選自免疫球蛋白和抗體受體、編碼它們的基因和mRNA、與癌基因有關(guān)的基因和mRNA、以及基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及外顯子和內(nèi)含子邊界。
32.權(quán)利要求1的方法，其中將所述組合物體外施用、口服、腔內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、肛門內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、子宮內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、肺部施用、腎內(nèi)施用、節(jié)內(nèi)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、intraotically施用、淋巴內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、頰內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用、腫瘤內(nèi)施用、腺內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、施用到器官內(nèi)、血管內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、通過植入施用、通過吸入施用、真皮內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、施用到耳內(nèi)、施用到心臟內(nèi)、通過緩釋、持續(xù)釋放或通過泵施用。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶選自編碼多肽的基因和mRNA，所述多肽選自轉(zhuǎn)錄因子、刺激和活化因子、細(xì)胞因子及其受體、白介素、白介素受體、趨化因子、趨化因子受體、內(nèi)源性產(chǎn)生的特異性和非特異性酶、免疫球蛋白、抗體受體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)受體、CNS和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)肽遞質(zhì)、粘著分子、防衛(wèi)素、生長因子、血管活性肽、肽受體和結(jié)合蛋白、對應(yīng)于癌基因的基因和mRNA。
34.權(quán)利要求1的方法，其中所述的反義寡核苷酸可以通過如下方法來產(chǎn)生從與影響肺氣道的疾病和病癥有關(guān)的多肽、編碼它們的基因和RNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界中選擇靶；獲得mRNA序列，所述mRNA選自對應(yīng)于靶基因的mRNA和編碼靶多肽的mRNA、基因組和mRNA側(cè)翼區(qū)以及基因和mRNA外顯子和內(nèi)含子邊界；選擇所述mRNA的至少一個(gè)片段；合成一種或多種對選定的mRNA片段反義的寡核苷酸；以及，如需要，用一種替代堿基代替一個(gè)或多個(gè)A以使寡核苷酸中A的含量降低至占全部核苷酸的最多約15％。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶基因選自編碼選自轉(zhuǎn)錄因子、刺激和活化因子、白介素、白介素受體、趨化因子、趨化因子受體、內(nèi)源性產(chǎn)生的特異性和非特異性酶、免疫球蛋白、抗體受體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)受體、CNS和外周神經(jīng)和非神經(jīng)系統(tǒng)肽遞質(zhì)及其受體、粘著分子、防衛(wèi)素、生長因子、血管活性肽及其受體以及結(jié)合蛋白的多肽的靶基因和mRNA、對應(yīng)于癌基因的靶基因和mRNA、其側(cè)翼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子邊界。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述被編碼的多肽選自NfκB轉(zhuǎn)錄因子、白介素-8受體(IL-8R)、白介素5受體(IL-5R)、白介素4受體(IL-4R)、白介素3受體(IL-3R)、白介素-1β(IL-1β)、白介素1β受體(IL-1βR)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、類胰蛋白酶、主要堿性蛋白、β2-腎上腺素受體激酶、內(nèi)皮縮血管肽受體A、內(nèi)皮縮血管肽受體B、前內(nèi)皮縮血管肽原、緩激肽B2受體、IgE高親和性受體、白介素1(IL-1)、白介素1受體(IL-1R)、白介素9(IL-9)、白介素-9受體(IL-9R)、白介素11(IL-11)、白介素-11受體(IL-11R)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶(COX)、細(xì)胞內(nèi)粘著分子1(ICAM-1)血管細(xì)胞粘著分子(VCAM)、Rantes、內(nèi)皮白細(xì)胞粘著分子(ELAM-1)、單核細(xì)胞活化因子、嗜中性白細(xì)胞趨化因子、嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、防衛(wèi)素1、2和3、毒蕈鹼乙酰膽堿受體、血小板活化因子、腫瘤壞死因子α、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶IV、P物質(zhì)、P物質(zhì)受體、組胺受體、胃促胰酶、CCR-1 CC趨化因子受體、CCR-2 CC趨化因子受體、CCR-3 CC趨化因子受體、CCR-4 CC趨化因子受體、CCR-5 CC趨化因子受體、前列腺素類受體、GATA-3轉(zhuǎn)錄因子、嗜中性白細(xì)胞粘著受體、MAP激酶、白介素-9(IL-9)、NFAT轉(zhuǎn)錄因子、STAT 4、MIP-1α、MCP-2、MCP-3、MCP-4、親環(huán)蛋白、磷脂酶A2、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、金屬蛋白酶、CSBP/p38 MAP激酶、胰蛋白 受體、PDG2、白介素-3(IL-3)、白介素-1β(IL-1β)、環(huán)孢菌素A-結(jié)合蛋白、FK5-結(jié)合蛋白、α4β1選擇蛋白、纖連蛋白、α4β7選擇蛋白、Mad CAM-1、LFA-1(CDlla/CDl8)、PECAM-1、LFA-1選擇蛋白、C3bi、PSGL-1、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、CD-34、L-選擇蛋白、p150，95、Mac-1(CDllb/CDl8)、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、VLA-4、CD-18/CDlla、CDllb/CD18、ICAM2和ICAM3、C5a、CCR3(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子受體)、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、LTB-4、AP-1轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶C、半胱氨酰白三烯受體、Tachychinnen受體(tach R)、IκB激酶1&2、STAT 6、c-mas和NF-白介素-6(NF-IL-6)及其側(cè)翼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子邊界。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶基因編碼G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體。
38.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶基因編碼鈣通道蛋白或受體、鈉通道蛋白或受體、鉀通道蛋白或受體或氯通道蛋白或受體。
39.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶基因編碼神經(jīng)遞質(zhì)受體或神經(jīng)激素受體。
40.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶基因編碼神經(jīng)肽或神經(jīng)肽受體。
41.權(quán)利要求1的方法，還包括通過另外地給予對據(jù)推測其功能與所述第一靶點(diǎn)有關(guān)的其它靶點(diǎn)反義的其它寡核苷酸來重復(fù)所有的步驟；通過共同給予靶向于第一靶點(diǎn)和其它靶點(diǎn)的寡核苷酸來重復(fù)給藥和評估的步驟；將對于每一靶點(diǎn)分別得到的結(jié)果進(jìn)行比較；其中，當(dāng)合并的寡核苷酸效果比各寡核苷酸的效果強(qiáng)約20％或更高時(shí)，可以認(rèn)為在第一寡核苷酸和其它寡核苷酸之間存在正相關(guān)，當(dāng)結(jié)果在單個(gè)寡核苷酸效果的約20％之內(nèi)時(shí)，可以認(rèn)為不相關(guān)，當(dāng)結(jié)果比單個(gè)寡核苷酸的效果低約20％時(shí)，可以認(rèn)為它們之間存在負(fù)相關(guān)。
全文摘要
一種測定在疾病或病癥的功能與編碼推測與疾病或病癥有關(guān)的靶多肽的基因或mRNA之間是否存在相關(guān)性的方法,該方法包括,獲取含有最多約15%腺苷(A)、優(yōu)選不含腺苷并且對靶點(diǎn)反義的寡核苷酸,所述靶點(diǎn)選自靶基因及其相應(yīng)的mRNA、選自3′和5′內(nèi)含子－外顯子邊界以及編碼和非編碼區(qū)之間的并列部分的基因組和mRNA側(cè)翼區(qū),以及編碼與預(yù)先選定的疾病或病癥有關(guān)的多肽的所有mRNA片段;從寡核苷酸中選擇出一種在體外與靶mRNA雜交時(shí)可以明顯抑制或消除由mRNA所編碼的多肽表達(dá)的寡核苷酸;向個(gè)體施用可以有效地在體內(nèi)與靶mRNA雜交的量的選定寡核苷酸;然后評估在施用寡核苷酸前后與疾病或病癥有關(guān)的個(gè)體功能;其中,功能值的改變大于約70%表示正相關(guān),在約40至約70%之間表示可能相關(guān),低于約30%表示不相關(guān)。本發(fā)明的方法優(yōu)選向靶點(diǎn)原位給藥寡核苷酸,例如,當(dāng)確認(rèn)與惡性和其它肺和呼吸功能有關(guān)的靶點(diǎn)有效時(shí),向個(gè)體的呼吸系統(tǒng)內(nèi)給藥,從而可以使物質(zhì)直接接近肺?；蛘?可將所述的脫腺苷寡核苷酸通過已知的輸送制劑的方法直接輸送到CNS或其它器官、組織或系統(tǒng)。
文檔編號C12Q1/68GK1348376SQ00806759
公開日2002年5月8日 申請日期2000年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月5日
發(fā)明者喬納森·W·尼斯 申請人:新生制藥公司