專利名稱：轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及防腐和保鮮技術，特別是轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑。
食品工業(yè)中食物的防腐處理是一個關鍵性技術。傳統(tǒng)的防腐手段，有兩種一種是是物理防腐方法，通過高溫高壓，低溫冷藏冷凍，添加窒息性氣體等抑制微生物的活性達到防腐效果；另一種是化學防腐方法，通過添加防腐藥劑抑制微生物的生長繁殖，達到防腐的目的。物理方法會改變物料的結構和口味，其應用受到許多限制。而化學防腐藥劑因為其本身的毒性而被嚴格限制。
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術不足提供一種轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑，取代化學制劑的使用，采取生物技術手段，保證人們在飲食過程中的安全與健康。
蒼蠅的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以成為新一代不會在人體內形成抗藥性的超級抗生素藥物。
現(xiàn)代研究證實，抗菌肽廣泛存在于動物(昆早)，植物和微生物中，采用純化方法難以獲得大量的抗菌肽。
抗菌肽即將成為一代新的抗菌、抗病毒、抗真菌、抗癌藥物。但天然抗菌肽的來源少，成本高，無法滿足實際應用的需要。因此我們通過DNA重組技術實現(xiàn)轉基因抗菌肽蠅蛆繁育家蠅收集蠅蛆獲得大量抗菌肽已成為現(xiàn)實。
一、轉基因蠅蛆抗菌肽工藝流程抗菌肽基因工程家蠅的構建-→擴大工程蠅繁育-→收集蠅蛆-→蠅蛆滅菌技術處理-→蠅蛆抗菌肽含量測試-→低溫深凍、貯存原料-→低溫粉碎制成超微勻漿-→抽提去除雜質-→濃縮-→分離干燥-→鑒定各項指標-→調配不同規(guī)格制品-→成品分裝-→用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑。
該工藝具有如下顯著特點工藝過程簡便；技術穩(wěn)定，具有很高的可重復性；表達效率高，抗菌肽的收率可達到0.60mg/ml；規(guī)模靈活，改變工藝規(guī)模時不需要重新通過中試校驗工藝參數(shù)；抗菌肽工程家蠅繁殖快、含量高，原料供應豐富并且價格低廉。
二、基因抗菌肽用于防腐保鮮劑的現(xiàn)代理論基礎抗菌肽是一種有35個氨基酸組成的多肽化合物，其分子量為3835道爾頓，等電點大約為10左右，具有優(yōu)良的耐熱性，對極端的pH值環(huán)境和離子強度環(huán)境也具有優(yōu)良的抗性，同時，抗菌肽對胃蛋白酶具有一定程度的耐受性。
抗菌肽N端富含賴氨酸和精氨酸等陽離子型氨基酸，C端富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸并且酰胺化，其中間部分則富含脯氨酸。通過對抗菌肽的圓二色性分析表明抗菌肽能夠在一定條件下形成α-螺旋和β-折疊。抗菌肽的α-螺旋具有近科完美的兩親性，被普遍認為是抗菌肽活性的結構基礎。
大量的研究證明抗菌肽具有廣譜高效的抗菌活性，對大多數(shù)細菌的致死濃度為0.1-0.5Umol/L。在昆蟲體液免疫防衛(wèi)系統(tǒng)中，參與抗菌作用的物質一共有三大類。第一類是凝聚素，它是在昆蟲被免疫后，省先出現(xiàn)在昆蟲血液中的免疫物質。這些物質被認為可能參與了對外源物質的識別，并可能進一步參與下一步免疫反應的動員。第二類物質就是抗菌肽類抗菌蛋白，第三類是溶菌酶。以往的研究表明，抗菌肽的抗菌作用是非特異性的抗菌肽除了表現(xiàn)出對細菌具有強大的殺傷作用外，還表現(xiàn)出了對腫瘤細胞和真菌以及部分病毒的強大殺傷作用。
一般認為抗菌肽在細菌胞質膜上穿孔而形成離子通道，造成細菌細胞膜結J的破壞，引起細胞內容物質大量滲出，導致細菌死亡。在這個過程中，抗菌肽的分子結構是其按照上述機理發(fā)生作用的基礎?？咕耐ㄟ^其兩親螺旋上的正電荷與細菌細胞膜磷脂分子的負電荷通過靜電吸引而結合在細菌的細胞膜上。接下來，抗菌肽分了中的疏水結構借助于分了中的連接結構的柔性相繼插入到質膜中。之后，抗菌肽分子兩親螺旋也插入到質膜中。這樣就破壞了細菌細胞膜的化學勢，質膜維持細胞內外滲透平衡的作用被子破壞而導致細菌的死亡。原來結合在細菌原生質膜上的抗菌肽分子在經(jīng)菌菌體崩解后脫落，繼續(xù)攻擊其他細菌細胞。
細菌感染是長期困擾人類的難題材。即便是在科學技術高度發(fā)達的今天，人們仍然無法徹底解決細菌對人類健康的危害。雖然在本世紀三十年代發(fā)明了以青霉素為代表的抗生素，使得人類可以在一定程度上控制細菌感染對人類健康造成的災難性影響，但是隨著傳統(tǒng)抗生素長期廣泛的應用，越來越多的耐藥菌株的出現(xiàn)，卻令人們束手無策?？咕囊元毺刈饔脵C理和廣譜高效的抗菌活性具在明顯的優(yōu)勢。食品中防腐保鮮，關鍵是應用抗菌肽的廣譜抗菌作用。抗菌肽的殺菌活性使得它能夠在抗微生物領域內得到廣泛的應用。與以往的抗生素不同的是，傳統(tǒng)抗生素是通過代謝阻斷、代謝競爭等方式干擾微生物的代謝不定期程，在到抑制微生物生長繁殖的目的。而抗菌肽直接作用于微生物體，破壞微生物體的亞顯微結構，殺滅細菌?？咕目朔藗鹘y(tǒng)抗生素容易產(chǎn)生耐藥性的弊端，同傳統(tǒng)抗生素比較具有以下優(yōu)點(1)無耐藥菌株。
(2)無致敏效應?？咕挠捎谄浞肿恿康?，因此不能作為抗原被人體免疫系統(tǒng)識別而引發(fā)速發(fā)(或者遲發(fā))型超敏反應。
(3)耐酸堿，耐熱，理化性質穩(wěn)定。
(4)抗菌譜廣泛。經(jīng)證實抗菌肽對大多數(shù)革蘭氏陰性和陽性致病細菌都具有強烈的殺菌活性。
(5)對病毒具有一定的殺滅作用。
三、抗菌肽防腐保鮮的實用價值。
抗菌肽作為一種新型的生物防腐手段，與傳統(tǒng)防腐方法比較具有以下顯著優(yōu)點(1)安全無毒抗菌肽的化學本質同是一種小分子量的蛋白質，其本身對人體健康沒有任何損害，并且添加在食物中可以作為一種營養(yǎng)成分被人體吸收。
(2)廣譜殺菌化學防腐劑只能對特定種類的微生物有抑殺作用，抗菌肽可以對絕大多數(shù)與腐敗有關的微生物產(chǎn)生殺滅作用。
(3)穩(wěn)定長效化學主腐劑大多數(shù)是一些無機或者有機化合物，能夠與食物或者空氣中的化學成分發(fā)生反應，失掉防腐效力抗菌肽化學性質非常穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定持久地發(fā)揮防腐功能。
(4)保持口味抗菌肽主要含有組氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷胱胺、軟氨酸、脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和甲狀腺素等。本身幾乎沒有異味，并且添加量少(一般只有百萬分之幾)，在此對食物原來的質量和口味沒有影劇院響。
由于抗菌肽具在廣譜殺菌的特殊生理活性，因此抗菌肽是一種性能優(yōu)良的食品防腐劑和保鮮劑。這種抗菌肽的特殊性質，作為食品防腐劑和保鮮劑的抗菌肽特別適宜應用于果汁、乳品和保健飲料的防腐和蔬菜、水果的保鮮。
果汁、乳品保健飲料和蔬菜、水果富含氨基酸、果糖、乳糖、蛋白質、維生素、微量元素和其他營養(yǎng)物質，這些特別適宜細菌滋生和繁殖，容易腐敗變質，但是卻不能象普通食品飲料那樣使用化學防腐劑。因為化學防腐劑都是有機或無機鹽，使用化學防腐劑不僅會影響飲品體系的穩(wěn)定，使飲品發(fā)生絮凝而破壞飲品的感官指標，而且會與飲品中的硼、鎂、鈣、鍶等微量元素結合形成不溶性沉淀而失去防腐作用，破壞飲品的營養(yǎng)成分，同時由于化學防腐劑的毒性也限制了它們的應用。
抗菌肽的特殊生物生化性質使得它在果汁、乳品、保健飲料的防腐和蔬菜、水果和保鮮應用方面避免了上述缺陷，具有得天獨厚的性能優(yōu)勢。
四、抗菌肽與化學防腐劑的比較
通過上述比較不難發(fā)現(xiàn)，在與具有代表性的化學防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀的比較中，抗菌肽抗菌的使用成本基本與山梨酸鉀相同，其他指標全面超過化學防腐劑。就目前被廣泛應用的化學防腐劑山梨酸鉀而言，本項目產(chǎn)品有僅在使用成本上堪與之一較高下，在抗菌譜、理化性能和代謝性能等指標方面也是山梨酸鉀所不能比擬的。特別值得稱道的是，在化學防腐劑無法應用的領域，抗菌肽卻可以一展身手。本項目之所以把目標市場定位于果汁、鮮奶和保健飲料防腐劑市場，就是針結化學防腐劑的致命弱點-毒性，與物料組分發(fā)生化學反應和破壞物料體系穩(wěn)定等，抗菌肽對蔬菜、水果保鮮也有應用價值。實驗結果證明抗菌肽對水果也是一種良好的保鮮劑。
抗菌肽對草莓不同條件保存情況
五、抗菌肽用于食品防腐劑和蔬菜、水果保鮮劑的技術性能指標抗菌肽是由一類由三十多個氨基酸組成的具有廣譜殺菌活性的多肽化合物。人畜食用后易被體內蛋白酶水解消化而對人體無毒付作用。實驗表明抗菌肽對與食品腐敗有關的多種革蘭氏陽性及陰性細菌均有較強的殺滅作用。在酸性條件下，其抗菌活性很強，適于大多數(shù)酸性食品的防病腐。其溶解性及穩(wěn)定性較好，尤其是在高溫條件下仍能保持很高的活性。其作用機理不同于一般化學防腐敗劑的抑菌作用，而是殺菌作用，是一種對人畜無毒副作用的極有前途的新型食品防腐劑和蔬菜、水果保鮮劑。主要技術性能(一)、技術要求1、感官指標白色或稍帶黃粉末，基本無臭味，易潮解。
2、分子量3.3KD(3300道爾頓)3、活性標準≥3000Umg4、可溶性蛋白15％5、耐熱性100℃,15磅10分(1.2kg/cm)6、使用量0.5％(二)注意事項1、抗菌肽為酸型防腐劑，在酸性條件下最有效，一般PH值調至5-6為好。
2、抗菌肽溶解通常只要10-20℃的水溶液即可，一般不要加熱溶解。
3、抗菌肽使用時可采用固體混合，溶液浸泡等方法直接加入食品。
4、抗菌肽具有殺菌能力，對細菌有效，而對霉菌和酵母菌作用的。
5、抗菌肽在空氣中易潮解、貯存時應放置在密封容器中，注意避光、防潮。
目前國際國內防腐劑市場上大多數(shù)是化學合成制品，作為生物防腐敗劑，特別是利用轉基因蠅蛆抗菌肽作為食品防腐劑的應用在國內外均屬首創(chuàng)，實驗結果表明有論是抗菌肽的在本性質、抗菌范圍以及作用機制都表現(xiàn)出作為一種新型防腐劑應用的良好前景。特別是采用基因工程手段，建立轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆生產(chǎn)抗菌肽、實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)就可以大大降低成本，提高產(chǎn)率，無論在表達載體系統(tǒng)上還是應用研究上都具有獨到之處。抗菌肽作為新型食品防腐劑投入市場將會對食品行業(yè)產(chǎn)生積極的影響和良好的社會及經(jīng)濟效益。
實施例1取牛奶、或果汁、或保健飲料100公斤，按每公斤加入轉基因蠅蛆提取的純品基因抗菌肽5000活性單位進行均勻混合即可達到防腐效果。各項指揮可達到國家規(guī)定的質控標準。而且這種高活性特殊生物防腐劑，不存在殘留問題，無毒副作用。
實施例2摘取9成熟的鮮荔枝100公斤，放入每公斤按5000活單位基因抗菌肽水深液浸泡1-2分鐘，取出裝入內襯0.03-0.06毫料厚聚乙烯薄膜的包裝箱中并及時預冷至1-5℃扎緊內襯袋口，勿使漏氣，打好包裝箱入入貯藏車內，貯藏溫度控制在1±0.5℃，相對溫度控制在85度以上。本法工藝簡便，貯藏時間長，保鮮效果好，無腐爛損耗，色香味無改變。就是常溫保存，也能持續(xù)10天。
權利要求
1.轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬水果保鮮劑，是從轉達基因抗菌肽蠅蛆中提取的基因抗菌肽，具備(1)、感官指標白色或稍帶黃粉末，基本無臭味，易潮解(2)、分子量3.3KD(3300道爾頓)(3)、活性標準≥3000Umg(4)、可溶性蛋白15％(5)、耐熱性100℃(,15磅10分(1.2kg/cm)(6)、使用量0.5％。
2.轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑，含從轉基因抗菌肽蠅蛆中提取的基因抗菌肽和用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑可接受的載體。
全文摘要
從轉基因抗菌肽蠅蛆中提取基因抗菌肽,用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑。取代化學防腐和保鮮劑,解除化學藥品在食品和蔬菜水果中的殘留問題,無抗藥性和無毒副作用,而且分子量小,無過敏原,能耐熱,性能穩(wěn)定,用量小,以微克計算,無疑是對人類健康和環(huán)境保護有著現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N15/09GK1319356SQ0110636
公開日2001年10月31日 申請日期2001年3月26日 優(yōu)先權日2001年3月26日
發(fā)明者茍仕金, 茍鴻鷹, 王成余 申請人:遼寧天成生物制藥研究所