專(zhuān)利名稱：抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，特別是一種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病(IBD)是一種呈現(xiàn)世界性流行的烈性傳染病，其病毒(IBDV)主要侵害雞體的免疫器官，造成免疫抑制，已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的三大主要疫病之一。90年代初，由于該病大流行，死亡率從原來(lái)15％左右突然上升到30-50％，導(dǎo)致大批雞場(chǎng)關(guān)閉，損失嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外對(duì)IBD的診斷、免疫預(yù)防進(jìn)行了一定的研究，但由于多方面的原因，在推廣應(yīng)用上均具有一定的難度。而近年來(lái)，由于超強(qiáng)毒株或變異株的出現(xiàn)，又使本病的發(fā)生和流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的疫苗不能提供足夠的保護(hù)，加重了對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害，給診斷、預(yù)防和治療帶來(lái)了新的困難。經(jīng)對(duì)背景技術(shù)的文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)楊艷艷等發(fā)表了“高親和力抗IBDV單克隆抗體的產(chǎn)生與免疫學(xué)鑒定”一文，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2000，16(7)384-386。其單克隆抗體的制作方法仍沿用經(jīng)典的長(zhǎng)程免疫方法，沒(méi)作改進(jìn)，即應(yīng)用IBDV抗原免疫8周齡Balb/c小鼠，經(jīng)多次加強(qiáng)免疫，約90天后將免疫脾細(xì)胞與NSO瘤細(xì)胞融合，通過(guò)對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)和鑒定，篩選出分泌高親和力單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤21株，其中4株YNZ-1、YNZ-12、YNZ-8和YNZ-26親和力高。其單抗的生產(chǎn)，也應(yīng)用傳統(tǒng)的小鼠腹水生產(chǎn)法，關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)尚未從體內(nèi)轉(zhuǎn)到體外。進(jìn)一步文獻(xiàn)檢索中均未見(jiàn)有應(yīng)用細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)抗IBDV單克隆抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先確立以分離純化的超強(qiáng)毒，應(yīng)用短程免疫及細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建分泌抗病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并建立以Fibra-Cel為載體，進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞、高效表達(dá)單抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件、系統(tǒng)參數(shù)及灌注培養(yǎng)模式，最后確定單克隆抗體規(guī)模純化的具體參數(shù)。本發(fā)明中所涉及工藝的具體方法進(jìn)一步描述如下1、純化病毒，收集含病毒的相應(yīng)條帶，用0.01M的TNE(pH7.2)透析，用福林-酚法測(cè)定病毒含量，用電鏡觀察病毒形態(tài)。將從上海地區(qū)發(fā)病雞場(chǎng)分離、鑒定的一株雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒，測(cè)定其半數(shù)雞胚感染量(EID50)，然后采用105EID50的病毒經(jīng)口服和滴鼻感染4周齡的SPF雞，攻擊后3天，撲殺雞群，無(wú)菌采取雞法氏囊，凍于-70℃，取法氏囊，稱重，按1/5(W/V)加入0.01M的TNE(pH7.2)，勻漿。凍融三次，12000RPM，4℃離心30分鐘，取上清，將上清以35000RPM，4℃離心3小時(shí)，將沉淀用0.01M的TNE(pH7.2)懸浮后，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，45000RPM，4℃離心3小時(shí)。
2、構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞，將純化的病毒采用脾臟直接免疫法免疫10周齡Balb/c小鼠，首先將小鼠采用乙醚麻醉，用碘酊等消毒創(chuàng)口，手術(shù)后牽引出脾臟，縱向注入IBDV約20μg，將脾臟復(fù)位，縫合傷口，一周后，取出脾臟，制備脾臟細(xì)胞，取脾臟細(xì)胞與SP2-0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用HAT、HT及ELISA進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定，并采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。獲得數(shù)株高表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行染色體鑒定、抗體亞型測(cè)定、抗體的特異性測(cè)定、抗體的親和力測(cè)定以及中和抗體的鑒定與中和指數(shù)測(cè)定等，經(jīng)傳30代穩(wěn)定后，作為細(xì)胞株保存。
3、單克隆抗體的生產(chǎn)方法，首先應(yīng)用細(xì)胞瓶進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞體外的小量培養(yǎng)，制備種子細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為含8％小牛血清的1640。然后轉(zhuǎn)入1.5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)一步增殖種子細(xì)胞，待其生長(zhǎng)到一定的密度，再轉(zhuǎn)入5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞反應(yīng)器經(jīng)過(guò)改良，應(yīng)用Fibra-cel載體進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，該載體為細(xì)胞定居和生長(zhǎng)提供了很大的空間。動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件和系統(tǒng)參數(shù)為接種濃度為3.0×108個(gè)/升、pH7.0、溶氧55、轉(zhuǎn)速50RPM、溫度37℃、葡萄糖濃度為4.5克/升，當(dāng)糖含量下降到2克/升濃度，進(jìn)行灌注生產(chǎn)，灌注速度通過(guò)測(cè)定罐中的葡萄糖的消耗水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，即可獲得較高滴度的單克隆抗體的粗制品。
4、單克隆抗體純化工藝，將粗制品經(jīng)2500rpm，4℃離心30分鐘，棄除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取一份上清加2份0.06M pH4.8醋酸緩沖液，加辛酸(33μl/ml上清)，室溫下邊加邊攪拌，加完后室溫下靜置30分鐘，15000rpm，4℃離心30分鐘，取上清于pH7.4，0.01M PBS中透析，透析后，加入等體積的飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，35000rpm，4℃離心20分鐘，用pH7.4，0.01M PBS懸浮沉淀，并用pH7.4，0.01M PBS透析，即獲得單克隆抗體的純品。
實(shí)施效果電鏡觀察獲得典型的雞傳染性法氏囊病病毒粒子檢測(cè)獲得4株高效表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)抗體亞型測(cè)定均為IgG亞類(lèi)；該抗體與其它禽類(lèi)病毒無(wú)反應(yīng)性，其特異性強(qiáng)；經(jīng)ELISA測(cè)定，抗體的親和力高；經(jīng)病毒中和試驗(yàn)證明，其均為中和性抗體。對(duì)細(xì)胞大量培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件進(jìn)行研究后，確定了最佳工藝模式和過(guò)程優(yōu)化方案，完成了細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模繁殖雜交瘤細(xì)胞、高效表達(dá)單抗的系統(tǒng)參數(shù)研究，研究發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞在接種濃度為3.0×108個(gè)/升、pH7.0、溶氧55、轉(zhuǎn)速50RPM、溫度37℃、葡萄糖濃度為4.5克/升等條件下生長(zhǎng)良好，抗體分泌旺盛。當(dāng)糖含量下降到一定濃度，可進(jìn)行灌注生產(chǎn)，每臺(tái)5升的細(xì)胞反應(yīng)器，每天可獲取高效價(jià)產(chǎn)物3升以上，一個(gè)反應(yīng)周期約3-4周。單抗制劑的凍干制劑，將大量的單抗經(jīng)超濾濃縮、脫鹽后，通過(guò)添加某保護(hù)劑，進(jìn)行凍干處理，凍干前后效價(jià)穩(wěn)定，凍干制品在常溫下可保存一年。在獲得大量單抗的基礎(chǔ)上，將其加工成單抗制劑，并采用飲水口服的治療方法，經(jīng)試驗(yàn)證明，應(yīng)用單抗制劑治療病雞，康復(fù)率達(dá)85％～100％，無(wú)不良反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1—雞傳染性法氏囊病毒的分離、純化工藝測(cè)定自行分離鑒定的雞傳染性法氏囊病毒的半數(shù)雞胚感染量(EID50)，然后采用105EID50的病毒經(jīng)口服和滴鼻感染4周齡的SPF雞，接種后3天，撲殺雞群，無(wú)菌采取雞法氏囊，凍于-70℃。取法氏囊，稱重，按1/5(W/V)加入0.01M的TNE(pH7.2)，勻漿。凍融三次，12000RPM，4℃離心30分鐘，取上清。將上清以35000RPM，4℃離心3小時(shí)，將沉淀用0.01M的TNE(pH7.2)懸浮后，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，45000RPM，4℃離心3小時(shí)。收集含病毒的相應(yīng)條帶，用0.01M的TNE(pH7.2)透析，用福林-酚法測(cè)定病毒含量。用電鏡觀察病毒形態(tài)。
實(shí)施例2—抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的制備將純化的病毒采用脾臟直接免疫法免疫Balb/c小鼠。首先將小鼠采用乙醚麻醉，用碘酊等消毒創(chuàng)口，手術(shù)后牽引出脾臟，縱向注入IBDV，將脾臟復(fù)位，縫合傷口，一周后，取出脾臟，制備脾臟細(xì)胞。取脾臟細(xì)胞與SP2-0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用HAT、HT及ELISA進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定，并采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。結(jié)果獲得4株高效表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)抗體亞型測(cè)定均為IgG亞類(lèi)；該抗體與其它禽類(lèi)病毒無(wú)反應(yīng)性，其特異性強(qiáng)；經(jīng)ELISA測(cè)定，抗體的親和力高；經(jīng)病毒中和試驗(yàn)證明，其均為中和性抗體。經(jīng)傳30代穩(wěn)定后，作為細(xì)胞株保存。
實(shí)施例3—抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的規(guī)模生產(chǎn)工藝首先應(yīng)用細(xì)胞瓶進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞體外的小量培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入1.5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)一步增殖種子細(xì)胞，待其生長(zhǎng)到一定的密度，再轉(zhuǎn)入5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行規(guī)模培養(yǎng)，生產(chǎn)單克隆抗體。對(duì)細(xì)胞大量培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件進(jìn)行了研究，確定了最佳工藝模式和過(guò)程優(yōu)化方案，完成了細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模繁殖雜交瘤細(xì)胞、高效表達(dá)單抗的系統(tǒng)參數(shù)研究，研究發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞在接種濃度為3.0×108個(gè)/升、pH7.0、溶氧55、轉(zhuǎn)速50RPM、溫度37℃、葡萄糖濃度為4.5克/升等條件下生長(zhǎng)良好，抗體分泌旺盛。當(dāng)糖含量下降到一定濃度，可進(jìn)行灌注生產(chǎn)，每臺(tái)5升的細(xì)胞反應(yīng)器，每天可獲取高效價(jià)產(chǎn)物3升以上，一個(gè)反應(yīng)周期約3-4周。為了保證雜交瘤細(xì)胞的高效表達(dá)，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的代謝調(diào)控研究。研究能源和碳源物質(zhì)如葡萄糖、谷氨酰胺、多種氨基酸、維生素、乳酸、氨等對(duì)細(xì)胞繁殖和單抗表達(dá)的影響。找到了能反映細(xì)胞代謝狀況的最佳指標(biāo)，據(jù)此確定需補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)和水平。
實(shí)施例4—抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的臨床治療應(yīng)用用細(xì)胞反應(yīng)器生產(chǎn)的單克隆抗體，應(yīng)用超濾等技術(shù)初步純化后，制備成單克隆抗體治療制劑，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。制劑有兩種劑型，即凍干制劑和液體制劑。凍干制劑在常溫下可保存一年，液體制劑需-18℃低溫冷凍一年，抗體效價(jià)不會(huì)下降。臨床上應(yīng)用本制品進(jìn)行雞傳染性法氏囊病的治療時(shí)，首先將本制品用生理鹽水1∶10稀釋?zhuān)缓?，每只病雞口服1毫升/每次，重癥病雞可口服兩次。經(jīng)臨床治療試驗(yàn)證明，應(yīng)用單抗制劑治療病雞，康復(fù)率達(dá)85％～100％，無(wú)不良反應(yīng)，而對(duì)照組死亡率達(dá)25％-35％，產(chǎn)品受到養(yǎng)殖業(yè)的普遍歡迎。
權(quán)利要求
1.一種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征在于首先確立以分離純化的超強(qiáng)毒，應(yīng)用短程免疫技術(shù)及細(xì)胞雜交融合構(gòu)建分泌抗病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并建立以Fibra-Cel為載體，進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞、高效表達(dá)單抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件、系統(tǒng)參數(shù)及灌注培養(yǎng)模式，最后確定單克隆抗體規(guī)模純化的具體參數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征還在于該病毒，收集含病毒的相應(yīng)條帶，用0.01M的TNE(pH7.2)透析，用福林-酚法測(cè)定病毒含量，用電鏡觀察病毒形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征還在于構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞，獲得數(shù)株高表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行染色體鑒定、抗體亞型測(cè)定、抗體的特異性測(cè)定、抗體的親和力測(cè)定以及中和抗體的鑒定與中和指數(shù)測(cè)定等，經(jīng)傳30代穩(wěn)定后，作為細(xì)胞株保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征還在于單克隆抗體的規(guī)模生產(chǎn)，首先應(yīng)用細(xì)胞瓶進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞體外的小量培養(yǎng)，制備種子細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為含8％小牛血清的1640，然后轉(zhuǎn)入1.5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)一步增殖種子細(xì)胞，待其生長(zhǎng)到一定的密度，再轉(zhuǎn)入5升的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞反應(yīng)器經(jīng)過(guò)改良，應(yīng)用Fibra-cel載體進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，該載體為細(xì)胞定居和生長(zhǎng)提供了很大的空間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的這種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征還在于動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件和系統(tǒng)參數(shù)為接種濃度為3.0×108個(gè)/升、pH7.0、溶氧55、轉(zhuǎn)速50RPM、溫度37℃、葡萄糖濃度為4.5克/升，當(dāng)糖含量下降到2克/升濃度，進(jìn)行灌注生產(chǎn)，灌注速度通過(guò)測(cè)定罐中的葡萄糖的消耗水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，即可獲得較高滴度的單克隆抗體的粗制品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征還在于單克隆抗體純化工藝，將粗制品經(jīng)2500rpm，4℃離心30分鐘，棄除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取一份上清加2份0.06M pH4.8醋酸緩沖液，加33μl/ml上清的辛酸，室溫下邊加邊攪拌，加完后室溫下靜置30分鐘，15000rpm，4℃離心30分鐘，取上清于pH7.4，0.01M PBS中透析，透析后，加入等體積的飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，35000rpm，4℃離心20分鐘，用pH7.4，0.01M PBS懸浮沉淀，并用pH7.4，0.01M PBS透析，即獲得單克隆抗體的純品。
全文摘要
抗雞傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的生產(chǎn)工藝,首先確立以分離純化的超強(qiáng)毒,應(yīng)用短程免疫及細(xì)胞雜交融合技術(shù)構(gòu)建分泌抗病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并建立以Fibra－Cel為載體,進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞、高效表達(dá)單抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件、系統(tǒng)參數(shù)及灌注培養(yǎng)模式,最后確定單克隆抗體規(guī)模純化的具體參數(shù)。在獲得大量單抗的基礎(chǔ)上,將其加工成單抗制劑,并采用飲水口服的治療方法,經(jīng)試驗(yàn)證明,應(yīng)用單抗制劑治療病雞,康復(fù)率達(dá)85%～100%,無(wú)不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1332251SQ01126459
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期2001年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日
發(fā)明者陸蘋(píng), 孫建和, 胡志賢, 王欣 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)