專利名稱：一種生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和代謝工程，具體地說，本發(fā)明涉及利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建基因工程甲醇利用型酵母新菌株，并用該新菌株來生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的方法。
SAM的含量，在一般的生物細(xì)胞內(nèi)都很低，但在某些微生物尤其是酵母Saccharomyces屬的一些菌株，能夠在含有甲硫氨酸的生長(zhǎng)時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)積累較高濃度的SAM(Shiozaki S et al.Agric Biol Chem，1984，482293-2300)，從而能夠通過對(duì)它們的發(fā)酵，方便地獲得SAM。細(xì)胞內(nèi)的SAM主要累積在細(xì)胞的液泡中(Svihla G，Schlenk F，JBacteriol 1960，79841)。
SAM的生產(chǎn)一直以釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的發(fā)酵為主(Shiozaki S，Yamada H et al.，US4562149，1985；Shiozaki S，Yamada H et al.Arig Biol Chem，1989，533269-3274)。早期的SAM生產(chǎn)菌都是通過大規(guī)模地篩選不同種屬的野生菌分離得到的，Shiozaki通過篩選300多株不同種屬的菌株，分離到一株Saccharomyces sake K-6菌(Shiozaki S et al.，Agric Biol Chem，1984，48(9)2293-2300)，在10ml培養(yǎng)基小量發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)出1.55g/L的SAM，細(xì)胞內(nèi)SAM的含量達(dá)0.153g/g干細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，該菌在10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)7天后的SAM產(chǎn)量高達(dá)10.8g/L(菌體達(dá)到53克)(Shiozaki S et al.Journal ofBiotechnology，1986，4345-354)。這是目前從各種專利和期刊上所查到的最高的產(chǎn)量。
Pajares Maria Angeles等(Pajares Maria Angeles，1995，EP0647712)通過在細(xì)菌中表達(dá)大鼠肝臟來源的SAM合成酶，使得細(xì)胞內(nèi)的SAM含量大大提高，但其單位發(fā)酵體積中的SAM產(chǎn)量仍然很低，只有28nmol/ml發(fā)酵液，按照SAM鹽酸鹽的分子量來計(jì)算，只有0.012克/升發(fā)酵液。這樣低的發(fā)酵產(chǎn)量，一方面會(huì)增加發(fā)酵成本，另一方面會(huì)使得后期的純化很麻煩。
SAM這類中間代謝物的生產(chǎn)成本，取決于三方面的因素1.目的產(chǎn)物在生產(chǎn)菌中的含量，即產(chǎn)物占細(xì)胞干重的百分比；2.單位發(fā)酵體積中生產(chǎn)菌的生物累積量，即單位發(fā)酵體積的菌體量；3.生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成本。近年來在生物工程領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的甲醇利用型酵母(methylotrophicyeast)，包括Hansenula，Candida，Pichia和Torulopsis屬的酵母，是一類能夠利用甲醇作為單一碳源來生長(zhǎng)的酵母，相比較于傳統(tǒng)的釀酒酵母具有培養(yǎng)基成本低、生物累積量高的特點(diǎn)，大規(guī)模發(fā)酵可得到極高的細(xì)胞密度(＞130g/L的細(xì)胞干重)和生物轉(zhuǎn)化率(12g干細(xì)胞/L·hour)(Wegner G H，F(xiàn)EMSMicrobiol Rev，1990，279-284)。這個(gè)特性使得它具備以極低的價(jià)格生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物的潛力。然而野生型的甲醇利用型酵母其細(xì)胞內(nèi)的SAM含量極低，我們實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的巴斯德畢赤酵母GS115菌株的SAM含量只有0.0039克/克干細(xì)胞，即只有0.39％的含量。
SAM的生物合成是由底物L(fēng)—甲硫氨酸(Met)和ATP經(jīng)SAM合成酶[EC2.5.1.6]酶促合成。釀酒酵母細(xì)胞中有兩種SAM合成酶的同功酶SAM合成酶1和SAM合成酶2，兩者的氨基酸序列的一致序列高達(dá)92％。SAM合成酶1負(fù)責(zé)合成細(xì)胞內(nèi)的大部分SAM，但SAM合成酶1表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，而SAM合成酶2則沒有。Thomas等發(fā)現(xiàn)SAM合成酶1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式同其他參與含硫氨基酸和SAM代謝的基因一樣，在過量甲硫氨酸存在下，它的轉(zhuǎn)錄受到抑制；而SAM合成酶2則表現(xiàn)出不同的調(diào)控方式，它的轉(zhuǎn)錄不受甲硫氨酸的抑制，并隨生長(zhǎng)曲線增長(zhǎng)(Thomas，D.et al.，1991，Mol.Gen.Genet.226，224-232)。
本發(fā)明利用甲醇利用型酵母為宿主，通過克隆已知的SAM合成酶基因，本發(fā)明實(shí)施例利用的是來源于釀酒酵母的SAM合成酶2，但不限于此酶，也可以是其他生物來源的SAM合成酶，或是人工合成的SAM合成酶的突變體。將此酶裝配入甲醇利用型酵母的表達(dá)載體，并置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下，這個(gè)載體的啟動(dòng)子可以是AOX1也可以是GAP啟動(dòng)子或者是其它任何可以在甲醇利用型酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動(dòng)子。
此質(zhì)粒經(jīng)過線性化后，通過原生質(zhì)體或電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化入甲醇利用型酵母細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明方法所需的基因工程菌株。本發(fā)明實(shí)施例提供了一種新的菌株，即甲醇利用型的巴斯德畢赤酵母，它的種屬為Pichiapastoris。(菌種保藏號(hào)為CGMCC，NO.0648，日期2001年10月29日，保藏地北京，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏條件為低溫冷凍保藏，以甘油或DMSO作為保護(hù)劑。)這樣該質(zhì)粒通過同源重組的方式被整合入細(xì)胞的染色體DNA，從而使得外源的SAM合成酶能夠在重組細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地得到表達(dá)。這種整合于染色體的重組表達(dá)方式比單獨(dú)復(fù)制的質(zhì)粒表達(dá)形式的穩(wěn)定性強(qiáng)，Hideyuki Ohi的實(shí)驗(yàn)表明此類重組菌即便經(jīng)過83代的連續(xù)傳代后，染色體組型和蛋白表達(dá)量都沒有明顯的變化(HideyukiOhi，1998，yeast，14895-903)。
在不少情況下，外源基因整合的拷貝數(shù)高的菌株蛋白表達(dá)量大于低拷貝或單拷貝的菌株(Clare JJ et al.，1991，Gene，105205-212)。因此在甲醇利用型酵母中外源蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)化，常常包括分離含有多拷貝基因的菌株。利用帶有G418的抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒，如pPIC3.5K，可以方便的篩選多拷貝重組菌株，因?yàn)橹亟M菌對(duì)G418的抗性程度大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。故而在一系列不同濃度的G418平板上進(jìn)行抗性篩選后，我們得到幾百株多拷貝的菌株，并通過dot-blot法確定了它們的拷貝數(shù)。
在含有適量的甲硫氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)該工程菌，細(xì)胞可以利用培養(yǎng)基中的甲硫氨酸做底物在SAM合成酶的催化下，合成大量的SAM。通過比較培養(yǎng)基中沒有甲醇和添加甲醇的不同情況下，細(xì)胞內(nèi)的SAM產(chǎn)量，可以確證外源SAM合成酶在重組細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)SAM產(chǎn)量的提高在沒有加入甲醇誘導(dǎo)的條件下，細(xì)胞內(nèi)外源SAM合成酶基本不表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的SAM產(chǎn)量和野生宿主細(xì)胞相比，也無明顯地變化；但當(dāng)培養(yǎng)基中加入甲醇做碳源后，細(xì)胞內(nèi)的SAM合成酶活力和SAM產(chǎn)量都有了較大的提高。
另外細(xì)胞內(nèi)的SAM含量不僅與SAM合成酶活力有關(guān)，還和培養(yǎng)基中的碳源有關(guān)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中不僅補(bǔ)充甲醇作為碳源及誘導(dǎo)劑的同時(shí)，還加入甘油這種對(duì)甲醇利用型酵母來說是快速利用的碳源時(shí)，SAM的產(chǎn)量會(huì)有一定的提高。這可以理解為細(xì)胞利用這些碳源合成了足量的ATP來供給SAM合成所需。
本發(fā)明的效果本發(fā)明克服了現(xiàn)有的生產(chǎn)SAM的方法中，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SAM含量很高但單位發(fā)酵體積中菌種含量低的缺點(diǎn)，利用甲醇利用型酵母具有的培養(yǎng)基成本低、生物積累量高，大規(guī)模發(fā)酵可得到極高的細(xì)胞密度和生物轉(zhuǎn)化率的特點(diǎn)，運(yùn)用在甲醇利用型酵母的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)來源于釀酒酵母的SAM合成酶的技術(shù)路線，通過將其置于強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，使細(xì)胞內(nèi)能夠產(chǎn)生出大量SAM合成酶，從而使細(xì)胞內(nèi)合成大量的SAM。通過篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，我們得到了比野生菌細(xì)胞內(nèi)SAM合成酶活力提高了10～40倍，其細(xì)胞內(nèi)的SAM含量也相應(yīng)提高了10～40多倍的重組菌。在優(yōu)化了試管培養(yǎng)條件后，該菌的SAM產(chǎn)量最高達(dá)到1.3-2.1克/升，SAM含量達(dá)到0.10-0.20克/克干細(xì)胞。
2、常規(guī)分子生物學(xué)操作釀酒酵母基因組DNA的抽提，酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，基因克隆，斑點(diǎn)雜交法按Ausubel等的方法(Ausubel，F(xiàn).M.et al，1992，Short protocols in MolecularBiology，2nd edition，P13-43)進(jìn)行。
實(shí)施例1重組表達(dá)SAM合成酶質(zhì)粒pPIC3.5K-SAM的構(gòu)建(參見

圖1)1、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae染色體DNA的抽提按照Ausubel等的方法(Ausubel，F(xiàn).M.et al，1992，Short protocols inMolecular Biology，2nd edition，P13-43)，抽提釀酒酵母染色體DNA。接種釀酒酵母菌株YPH499于5ml YPD培養(yǎng)基(10克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖)，28-30℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。5000rpm/min離心5min，收集菌體。菌體沉淀用0.5ml冷無菌水洗滌后，重懸于0.5ml山梨醇溶液(0.9M山梨醇、0.1M Tris-Cl，ph8.0、0.1MEDTA)，加入50ul的0.3mg/ml的Zymolase和50ul的0.28M的2-巰基乙醇，混勻后37℃反應(yīng)1小時(shí)。5000rpm離心5min，收集菌體，用0.5ml Tris/EDTA溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)20ml)冷無菌水和20ml 1mol/L的冷山梨醇各洗一次。每次洗后均在5000rpm離心5min并收集菌體。加入50ul 10％SDS，混勻后65℃溫育20min。隨后加入200ul 5M的醋酸鉀，顛倒混勻后，冰上放置30min以上。室溫離心3min。將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入1ml的無水乙醇室溫離心5min，吸去上清，真空抽干DNA沉淀。加入300ul TE緩沖液重新溶解DNA沉淀。用適量的RNase消化RNA后，加入0.5ml的100％異丙醇，混合溶液直至DNA沉淀析出。將沉淀轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管，并溶于125ul TE緩沖液中。
2、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)根據(jù)GenBank中的Saccharomyces cerevisiae來源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶2(SAM合成酶2)基因(登錄號(hào)為M23368)，設(shè)計(jì)兩條PCR引物引物1 5’CAGGATCCACCATGGCCAAGAGCAAACT3’引物2 5’GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA3’在設(shè)計(jì)基因5’端引物(引物1)包含了核糖體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)引入了一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)?；?’端引物(引物2)包含了終止密碼子TAG附近的序列，并引入了一個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)。
以釀酒酵母染色體DNA為模板，加入一定量的引物1、引物2、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，PCR反應(yīng)條件如下94℃，30sec 5個(gè)循環(huán)94℃，30sec 30個(gè)循環(huán)94℃ 5min→→40℃，30sec→→→→50℃，30sec →→→→72℃，10min72℃，75sec72℃，75sec3、PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后，采用PromegaDNA回收試劑盒回收1.2kb大小的PCR擴(kuò)增片段?；厥盏腜CR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后，與BamHI/EcoRI雙酶切的pUC18相連。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素板篩選陽(yáng)性克隆。采用Promega質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒用酶切鑒定。
得到的質(zhì)粒pUC-SAM，經(jīng)測(cè)序確證與GenBank中發(fā)表的SAM合成酶2的基因完全相同。為了篩選高拷貝的方便，選用pPIC3.5K質(zhì)粒作為巴斯德畢赤酵母中胞內(nèi)表達(dá)SAM合成酶2的載體，這樣使得轉(zhuǎn)化了該質(zhì)粒的菌株具有劑量依賴的G418抗性，以BamHI和EcoRI將SAM合成酶2基因切出，裝配入pPIC3.5K中。
實(shí)施例2 表達(dá)外源SAM合成酶的重組細(xì)胞的構(gòu)建1、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的制備接種巴斯德畢赤酵母菌株GS115于500ml YPD培養(yǎng)基(1克/升酵母膏、2克/升蛋白胨、2克/升葡萄糖)，28-30℃培養(yǎng)至OD600為1.3-1.5，5000rpm/min離心5min，菌體沉淀分別用100ml冷凍無菌水、20ml冷凍無菌水和20ml1mol/L的冷凍山梨醇各洗一次，每次洗后均5000rpm/min離心5min并收集菌體，最后將離心的菌體細(xì)胞用200μl 1M冰凍的山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細(xì)胞。
2、重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-SAM電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-SAM約10μg用SalI酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于10μl無菌水中，同時(shí)將空載pPIC3.5K質(zhì)粒相同酶切線性化并回收作為對(duì)照。將上述線性化DNA分別與80μl GS115電轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合，采用GIBCOL BRL電轉(zhuǎn)化儀CELL-PORATOR電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容50μF電阻4KΩ。立即向電轉(zhuǎn)化杯中加入0.5ml 1mol/L冰浴預(yù)冷的山梨醇，并將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到一無菌微量離心管中，取200-600μl涂布于MD(13.4g/LYNB，4×10-4g/L生物素，10g/L葡萄糖，15g/L瓊脂糖)平板。30℃培養(yǎng)直到出現(xiàn)單菌落。
3、高拷貝菌株的篩選在生長(zhǎng)出電轉(zhuǎn)化細(xì)胞的MD平板上，加入1ml無菌水，用涂布棒耙下菌體。重懸菌液，離心。傾去上清，0.5ml無菌水再重懸。適當(dāng)稀釋后取100μl涂布含有G418(0，0.25，0.5，1.0mg/ml)的YPD平板。30℃培養(yǎng)4-6天。將篩選出的G418抗性菌株，接種于96孔板中的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2天。抽提總DNA，定量后調(diào)整各樣品濃度相同后，將DNA樣品點(diǎn)在尼龍膜上，用P32標(biāo)記的SAM合成酶2做探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)來確定SAM合成酶2的基因的拷貝數(shù)。
實(shí)施例3小量快速抽提細(xì)胞內(nèi)SAM已知細(xì)胞濃度的發(fā)酵液離心收集菌體，加入與原始發(fā)酵液等體積的10％三氯乙酸于4℃抽提一小時(shí)以上，12,000g離心10分鐘后，將上清用0.2μm的濾膜過濾后，從中取20微升，上樣HPLC定量SAM。
實(shí)施例4 SAM的高效液相色譜(HPLC)法定量SAM分子中的硫原子帶有正電荷，它的這個(gè)特性使它可以用離子交換柱來分析檢測(cè)。強(qiáng)陽(yáng)離子型離子交換柱Hypercil 10 SCX(4.6×250mm)，流動(dòng)相為0.5M甲酸銨(pH4.0)，流速2.0ml/min，檢測(cè)254nm的光密度。SAM保留時(shí)間為25.4分鐘，由于室溫和pH的輕微波動(dòng)，前后偏差1分鐘左右。采用外標(biāo)法，根據(jù)不同濃度的SAM標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。
實(shí)施例5 SAM合成酶活力的測(cè)定在28℃培養(yǎng)5天后，離心收集菌體(3,000g×10min，4℃)，并用裂解緩沖液——含有50mM pH7.4的磷酸鉀緩沖液，5％甘油(V/V)，5mM的巰基乙醇和1mM的EDTA(加入1mM的苯甲咪和1mM的PMSF作為蛋白酶抑制劑)，清洗一次。加入菌體一倍體積的酸洗玻璃珠和4倍體積的裂解緩沖液，用超聲波(在最大輸出，50％的工作周期)于0～4℃處理10分鐘，裂解細(xì)胞。玻璃珠和細(xì)胞殘片離心10000g×15分鐘除去。粗抽提液經(jīng)12000g×30分鐘離心后，保留上清。
設(shè)定1ml的反應(yīng)混合物，其中含有20mM的L-甲硫氨酸，20mM的ATP，8mM的還原型谷胱甘肽，20mM的MgCl2，100mM的KCl，150mM的pH7.4的Tris-HCl和適量的細(xì)胞裂解液，在37℃溫育60分鐘。不加入L-甲硫氨酸的反應(yīng)作為空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.5ml的20％高氯酸溶液，離心除去沉淀。所得到的上清通過HPLC分析SAM的含量。
經(jīng)過5天的培養(yǎng)及誘導(dǎo)后，測(cè)定得到的宿主菌GS115的SAM合成酶活力為0.241μmol/hour/mg，而重組菌的酶活力可達(dá)8.87μmol/hour/mg，活力提高了30多倍，參見表1。在沒有甲醇誘導(dǎo)的條件下，重組菌中沒有外源SAM合成酶表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的SAM含量和宿主菌沒有顯著的差別；而當(dāng)培養(yǎng)基中加有甲醇時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的SAM合成酶活力與宿主菌相比提高了30多倍，細(xì)胞內(nèi)的SAM產(chǎn)量也提高了30倍左右。
表1野生型與重組菌的SAM產(chǎn)量和SAM合成酶活力的比較

實(shí)施例6重組菌的SAM生產(chǎn)發(fā)酵將篩選出的Pichia pastoris轉(zhuǎn)化子接種3ml YPD試管，30℃300r/min培養(yǎng)過夜，以1％接種量接入含10mL培養(yǎng)基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，0.05mol/l磷酸鉀緩沖液pH6.0，13.4g/L含有硫酸銨的酵母基本氮源，4×10-4g/L生物素，2g/L甘油，20g/L甲醇，7.5g/L的L-甲硫氨酸)的50mL離心管中。30℃300r/min培養(yǎng)。從第48小時(shí)開始每24h補(bǔ)加甲醇到0.5％，補(bǔ)加甘油到0.2％，連續(xù)培養(yǎng)6天后，SAM產(chǎn)量達(dá)到最高(參見圖2)。重組菌的SAM的產(chǎn)量達(dá)到1.58克/升，相比較于宿主菌的0.04克/升，產(chǎn)量提高了30多倍(參見表1)。在上述培養(yǎng)條件下，第6天補(bǔ)加0.15％的甲硫氨酸，該重組菌第8天的SAM產(chǎn)量達(dá)到1.72克/升。
同樣的重組菌在沒有甲醇誘導(dǎo)時(shí)，也就是說沒有重組的SAM合成酶2被誘導(dǎo)表達(dá)的情況下，SAM的量與宿主菌比較接近(參見表1)，這正說明正是由于外源SAM合成酶2的表達(dá)，直接促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)SAM累積量的大幅度提高。
需要說明的是，本實(shí)施例的巴斯德畢赤酵母在發(fā)酵時(shí)是個(gè)高消耗氧的過程，尤其是在以甲醇作為單一碳源的時(shí)候——甲醇的代謝是一個(gè)高耗氧的過程，在小試管中發(fā)酵并沒有完全發(fā)揮其高生物累積量的優(yōu)勢(shì)(其發(fā)酵罐中最高可超過130克/升干細(xì)胞)，在本實(shí)施例中，菌體干重最高只達(dá)到15克/升，因此將本發(fā)明的方法運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)中，基因工程菌的SAM產(chǎn)量還會(huì)大大的的增加。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，是用甲醇利用型酵母發(fā)酵來生產(chǎn)的，所述的甲醇利用型酵母為Hansenula，Candida，Pichia或Torulopsis等屬的酵母，由重組表達(dá)外源SAM合成酶的載體轉(zhuǎn)化后獲得，其細(xì)胞內(nèi)S-adenosyl-menthionine—腺苷甲硫氨酸累積量達(dá)到細(xì)胞干重的10％～20％。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該甲醇利用型酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris菌株。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體包含一個(gè)編碼S-adenosyl-menthionine合成酶的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體中的S-adenosyl-menthionine合成酶是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae來源的，尤其是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae來源的S-adenosyl-menthionine合成酶2。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列連接有可以在甲醇利用型酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用的啟動(dòng)子序列。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的啟動(dòng)子序列為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列為AOX1。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醇利用型酵母在發(fā)酵生產(chǎn)SAM時(shí)利用甲醇作碳源。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的甲醇利用型酵母在發(fā)酵生產(chǎn)SAM時(shí)補(bǔ)加一定量的甘油作碳源以提高S-adenosyl-menthionine產(chǎn)量。
10.一種新的菌株，其特征在于，所述的菌株為甲醇利用型的巴斯德畢赤酵母菌株，它的種屬為Pichia pastoris，通過將表達(dá)質(zhì)粒PIC3.5K-SAM轉(zhuǎn)化到甲醇酵母菌株GS115中到的保藏號(hào)為CGMCC No.0648的菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用甲醇利用型酵母,尤其是轉(zhuǎn)化了帶有外源SAM(S－adenosyl－menthionine)合成酶表達(dá)載體的重組菌,來生產(chǎn)SAM的方法和如何構(gòu)建這樣一種表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。具有該特性的重組菌在含有甲醇和適量甲硫氨酸和一定氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵,可以獲得高產(chǎn)量的SAM,細(xì)胞內(nèi)的SAM含量可達(dá)10～20%細(xì)胞干重。本發(fā)明還提供了一種新的甲醇利用型的巴斯德畢赤酵母菌株,它的種屬為Pichia pastoris,菌種保藏號(hào)為:CGMCC,NO.0648。
文檔編號(hào)C12P19/32GK1357630SQ01132379
公開日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者袁中一, 李東陽(yáng), 吉鑫松 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所