專利名稱：用于樣品制備和分析的集成式生物芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對樣品的分析，尤其是在芯片上處理和分析樣品。具體地說，本發(fā)明是使用一個集成式的芯片系統(tǒng)來處理和分析樣品。該系統(tǒng)包含一個或多個芯片；在芯片上，樣品，例如生物細胞或是生物分子，可以使用外加的物理作用力進行處理和操縱。
背景技術(shù)：
對微粒(特別是對生物材料)的操縱可以為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究帶來便利。其中對單個癌細胞進行操縱的技術(shù)相當(dāng)重要，它能使研究者在精心控制的環(huán)境中研究單個癌細胞或一組癌細胞與被選擇藥物之間的相互作用。有多種不同的力可以用以操縱微粒，包括光學(xué)力、超聲力、機械力和流體力。例如人們已經(jīng)成功的利用流式細胞儀來對細胞進行分類和鑒定。另一個例子就是在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)實驗室中，離心技術(shù)被廣泛使用，以處理生物樣品。
目前在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中的趨勢是生物分析設(shè)備和器件的自動化與微型化?；谏镄酒奈⒘黧w技術(shù)的研究開發(fā)受到了特別的關(guān)注。生物芯片是指一塊固體基片，在其表面上可進行生物/生化/化學(xué)反應(yīng)和處理過程?；且黄梢詾椴煌螤睿缇匦?、圓形、橢圓形或其它形狀的薄片?？梢栽诨霞苫蛑谱鞒霾煌慕Y(jié)構(gòu)(如管道、槽、電極元件等)以進行生物/生化/化學(xué)反應(yīng)或處理。生物芯片和微流體領(lǐng)域研究者的一個重要目標(biāo)就是開發(fā)出完全自動化、集成化的設(shè)備，以實現(xiàn)一系列的生物/生化反應(yīng)和步驟。最佳情況是，這種集成器件能處理天然的、原初的生物樣品(如血液、尿液)以分離靶微?；蛏镂⒘?如血液中的癌細胞、孕婦血液中的胎兒成核細胞、尿液中的某種細菌)；分離后的靶微?？梢越?jīng)過進一步處理得到細胞組分(如靶細胞經(jīng)胞解釋放出生物分子，如DNA、mRNA、蛋白質(zhì)分子等)；然后感興趣的細胞組分再被分離、處理(如對分離出的DNA分子中的目標(biāo)序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR進行擴增)；最后，對反應(yīng)產(chǎn)物進行一定形式的檢測/測量/定量(如對PCR擴增的DNA片段進行雜交反應(yīng)，用熒光法檢測雜交結(jié)果)。很明顯，在生物芯片上處理和操縱微?；旌衔镏胁煌N類的微粒(包括細胞和細胞組分)的方法對開發(fā)基于生物芯片的器件而言有著非常重要的意義。
目前有關(guān)在芯片上對微?；蛏镂⒘＿M行操縱的方法已經(jīng)有了一定的進展。電子雜交技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來，即在電子芯片上操縱、輸運帶電荷的DNA分子(見“Rapid Determination of Single Base Mismatch Mutations in DNAHybrids by Direct Electric Field Control”，Sosnowski，R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Volume 94，pages 1119-1123，1997；“Electric Field DirectedNucleic Acid Hybridization on Microchips”，Edman，C.，Nucl.Acids Res.，25pages 4907-4914，1998)；還有電泵和電分離技術(shù)，即利用基于電滲和電泳的動力學(xué)效應(yīng)來輸運、操縱、分離生物分子或其它微粒(“Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-basedchemical analysis system on a chip”，Harrison，D.J.et al，Science，Volume261，pages895-896，1993；“High-speed separation of antisenseofligonucleotides on a micromachined capillary electrophoresis device”，Effenhauser，C.S.et al.，Anal.Chem.Volume 66，pages2949-2953，1994)。總體而言，目前處理微粒的操縱技術(shù)應(yīng)用有限，且只能用于特定的實例。因此，需要性能更好的能夠操縱微粒的裝置。
發(fā)明概述分析技術(shù)可以用于醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)鑒定、遺傳診斷、疾病預(yù)防和藥物基因組學(xué)，這些研究通常都需要準(zhǔn)備大量的復(fù)雜的生物樣品。生物樣品，例如血液樣品的制備通常需要多個步驟完成，例如包括離心、過濾、破胞、溫育、酶切、對核酸或蛋白進行凝膠純化。這些步驟費時費力，難以標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明提出一個能夠進行樣品制備和分析的自動化集成式系統(tǒng)，并且使從樣品到結(jié)果的過程標(biāo)準(zhǔn)化、流程化。因為“芯片實驗室”盡可能的減少了人工的干預(yù)，并且可以同時分析多個樣品，從而避免了多次重復(fù)取樣。
使用外加的物理作用力對微粒(例如細胞和與樣品組分連接的微顆粒)進行操縱可以使得對樣品的處理和分析的過程自動化和流程化。
首先，本發(fā)明所述的集成式生物芯片系統(tǒng)帶有一個芯片，芯片可以進行至少兩個順序的任務(wù)，而且其中至少一個任務(wù)的目的是進行樣品處理。最好，至少一個任務(wù)是部分的通過制作在芯片上的微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的物理力實現(xiàn)的。而且，至少一個任務(wù)是通過操縱與樣品中的實體分子連接的結(jié)合物來實現(xiàn)。集成式生物芯片系統(tǒng)最好是自動化的。
其次，本發(fā)明所述的集成式生物芯片系統(tǒng)也可以包含兩個或多個芯片。至少能進行兩個順序的任務(wù)，而且，至少其中的一塊芯片可以進行樣品制備中的至少一個任務(wù)。最好，這種包含兩個或兩個以上芯片的集成式生物芯片系統(tǒng)是自動化的，系統(tǒng)中至少有兩個芯片可以進行相互的流體交換。樣品組分從系統(tǒng)中的一塊芯片轉(zhuǎn)移到另一塊芯片上適宜使用機械作用而不是流體作用，最好是使用外加的物理作用力。最好，至少一個任務(wù)是部分的通過制作在芯片上的微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的物理力實現(xiàn)的。而且，至少一個任務(wù)是通過操縱與樣品中的實體分子連接的結(jié)合物來實現(xiàn)。
再次，本發(fā)明還包括使用集成式芯片系統(tǒng)進行樣品制備和分析的方法。這種方式包括將樣品引入系統(tǒng)和在樣品制備及分析(非必須)中進行至少兩個順序的任務(wù)。至少一個樣品處理的任務(wù)可以通過制作在芯片上的微結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的物理作用力完成，最好但不是必須的，處理過程能夠包括對與微粒連接的樣品中的實體分子進行操縱的步驟。


圖1A是包括了一個可以用于本系統(tǒng)的多力芯片的腔體三維立體圖；腔體有入口和出口，一個多力芯片位于腔體的底部；腔體的頂部是一片玻璃片(未顯示)；這個腔體與其它三個腔體相連(未顯示)，用于分析和檢測DNA、蛋白質(zhì)和mRNA，以及其它小分子。多力芯片上集成了聲場層、磁力層、微粒開關(guān)層、DEP電極電極層和頂層。
圖1B是多力芯片頂層的三維立體圖，在這里頂層可以由BSA(牛血清白蛋白)或其它分子包被以減少細胞或樣品的其它成分與芯片的非特異性吸附。頂層也可以是一薄層SiO2或其它絕緣材料。
圖1C是多力芯片的DEP電極層的DEP電極的三維立體圖，矩形的DEP電極可以和外加信號源(未顯示)相連。
圖1D是多力芯片的微粒開關(guān)層的微粒開關(guān)電極的三維立體圖。
圖1E是多力芯片的磁力層上的電磁元件的三維立體圖。
圖1F是多力芯片聲場層的聲學(xué)元件的三維立體圖。
圖2A是樣品被引入腔體的示意圖，樣品含有待分析的靶細胞、非靶細胞和表面包被了特異結(jié)合物的磁珠；磁珠表面包被的特異結(jié)合物可以與靶細胞結(jié)合，從而使得磁珠和靶細胞相連。
圖2B是樣品已經(jīng)被引入腔體后的示意圖，被引入的樣品包含靶細胞、非靶細胞和磁珠。
圖3是樣品在腔體中在聲場力的作用下混合，從而促使磁珠與靶細胞結(jié)合的示意圖(選通的聲場層用粗線表示)。
圖4是樣品在腔體中，在聲場力的作用下混合之后，進行磁力捕獲之前，靶細胞已經(jīng)和磁珠結(jié)合的示意圖。
圖5A是樣品中靶細胞已經(jīng)和磁珠結(jié)合，電磁元件被選通的示意圖(選通的電磁層用粗線表示)。產(chǎn)生的磁場可以使靶細胞-磁珠復(fù)合體向磁極聚集。
圖5B是腔體中磁珠-細胞復(fù)合體或磁珠被選通的電磁元件捕獲后的示意圖(選通的電磁層用粗線表示)。在圖中為了表示磁珠已被吸附在磁極附近，磁極被畫出來，但是其實在試驗中它們從腔體的頂部是看不見的。
圖5C是腔體中非靶細胞被流體清洗，而與磁珠結(jié)合的靶細胞仍舊被磁極捕獲的示意圖。
圖6是腔體中靶細胞從磁珠上洗脫下來，由于磁極仍然被選通，所以磁珠仍然聚集在磁極附近的示意圖。
圖7A是帶有DEP電極陣列的腔體的三維示意圖，DEP電極陣列上施加了交流信號(選通的電極層用粗線表示)。
圖7B顯示，靶細胞在腔體中的DEP電極陣列產(chǎn)生的非勻強電場的作用下，受到正向介電電泳力的作用，被電極捕獲，因為介電電泳力對磁珠的作用力很小或是使得磁珠受到負向介電電泳力，而使得磁珠被沖走。
圖8顯示了含有四種不同類型的磁珠的溶液被引入腔體。它們分別是1型、2型、3型和4型磁珠，分別用以結(jié)合靶mRNA、靶蛋白、靶DNA和目標(biāo)小分子。
圖9A顯示腔體中的靶細胞被裂解以釋放其內(nèi)容物。
圖9B是含有靶細胞釋放的內(nèi)容物的腔體的示意圖。
圖10顯示腔體中的聲場元件被選通，產(chǎn)生聲場混合，促使目標(biāo)分子與相應(yīng)的磁珠連接(被選通的聲場層用粗線表示)。
圖11顯示腔體中靶分子分別與相應(yīng)的磁珠連接。目標(biāo)蛋白分子、DNA分子、mRNA分子、小分子分別連接磁珠2、3、1、4型。
圖12A顯示腔體中分子-磁珠復(fù)合體被選通的DEP電極產(chǎn)生的介電電泳力捕獲在腔體底面(被選通的DEP電極層用粗線表示)。
圖12B顯示腔體中的分子-磁珠復(fù)合體被DEP電極產(chǎn)生的行波介電電泳力聚集在腔體底面中心區(qū)域。
圖13A是腔體中微粒開關(guān)層電極通電后的俯視圖。
圖13B是微粒開關(guān)層的俯視圖，顯示微粒開關(guān)電極施加相位不同的電信號后，四種分子-磁珠復(fù)合體在微粒開關(guān)的三個通道末端得到分離。
圖13C顯示四種類型的分子-磁珠復(fù)合體在腔體的三個末端得到分離。
圖14A是DNA分析腔體的三維立體圖，顯示了DNA探針層。
圖14B是DNA分析腔體的三維立體圖，顯示了行波介電電泳電極(TW-DEP)層。TW-DEP電極與信號源的詳細連接方法圖中沒有給出。信號源可以產(chǎn)生至少三個頻率相同但是相位不同的信號。
圖14C是DNA分析腔體的三維立體圖，顯示了磁力傳感器層。其中字母“S”表示“傳感器”。
圖14D是DNA分析腔體的三維立體圖，顯示了行波介電電泳層通電后，行波介電電泳電極推動DNA-磁珠復(fù)合體進入分析腔體(通電的電極層用粗線表示)。DNA分析腔體含有一個芯片，芯片上有DNA探針層(頂層)，一個行波DEP層和一個磁力傳感器層。
圖14E是DNA分析腔體的三維立體圖。顯示了DNA-磁珠復(fù)合體進入腔體后，與磁珠連接的DNA分子同時與芯片上的探針雜交。
圖14F是DNA分析腔體的三維立體圖。顯示了DNA-磁珠復(fù)合體上靶DNA分子單鏈部分與芯片上的DNA探針雜交，這些探針固定在磁力傳感器上。磁珠的有無和磁珠的數(shù)量可以通過磁力傳感器進行檢測(通電的磁力傳感器層用粗線表示)。為了表明磁力傳感器對磁珠有響應(yīng)，單個磁力傳感器被表示出來，盡管在實際的試驗中它們從腔體的頂部是看不到的。
圖15A是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖，腔體中包含一個帶有核酸/抗體探針層的芯片。
圖15B是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖，顯示了芯片上的行波-介電電泳電極層。TW-DEP電極與信號源的詳細連接方法圖中沒有給出。信號源可以產(chǎn)生至少三個頻率相同但是相位不同的信號。
圖15C是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖，顯示了蛋白質(zhì)-磁珠復(fù)合體和mRNA分子-磁珠復(fù)合體在行波介電電泳力的作用下進入腔體(選通的電極層用粗線表示)。
圖15D是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖。顯示了蛋白質(zhì)分子和mRNA分子從磁珠上解離下來，和芯片表面的特異結(jié)合物進行結(jié)合。
圖15E是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖。顯示了蛋白質(zhì)分子和mRNA分子分別與芯片表面的抗體和核酸探針結(jié)合。帶有可檢測標(biāo)記結(jié)合分子從一個端口引入分析腔體。磁珠可以在通電的DEP電極(圖中沒有顯示)產(chǎn)生的行波介電電泳力的作用下移出分析腔體或離開腔體的檢測區(qū)，或者在引入帶有可檢測標(biāo)記(熒光標(biāo)記)的結(jié)合分子(圖中沒有顯示)時用流體洗去。
圖15F是蛋白質(zhì)/mRNA分析腔體的三維立體圖。顯示了帶有熒光標(biāo)記的結(jié)合分子與結(jié)合在芯片表面的蛋白質(zhì)分子及核酸分子結(jié)合。
圖16A和B是小分子分析腔體的三維立體圖。腔體的底部包含一塊芯片，該芯片包括流體通道層(A)、行波DEP層(B)。TW-DEP電極與信號源的詳細連接方法(圖中沒有給出)。信號源可以產(chǎn)生至少三個頻率相同但是相位不同的信號。
圖16C是小分子分析腔體的三維立體圖。顯示了小分子-磁珠復(fù)合體在行波介電電泳力的作用下移到通道中心區(qū)域(選通的電極層用粗線表示)。
圖16D是小分子分析腔體的三維立體圖。顯示了小分子從磁珠上解離下來。磁珠在行波介電電泳力的作用下離開分析腔體(圖中未顯示)。其中小分子進行了熒光標(biāo)記(圖中未顯示)。
圖16E是小分子分析腔體的三維立體圖。顯示了小分子在電泳力或電滲力作用下通過通道。
圖16F是小分子分析腔體的三維立體圖。顯示了小分子通過通道，被芯片外的熒光檢測器檢測。
圖17是單芯片的集成式生物芯片系統(tǒng)。其中芯片是腔體的一部分，腔體蓋片上有用于引入樣品和試劑的入口，以及用于廢物流出的出口。芯片上這些分立的區(qū)域用于樣品制備(A和B)和分析(C)，并且每個區(qū)域有不同的功能區(qū)。
圖18是單芯片的集成式生物芯片系統(tǒng)。其中芯片是腔體的一部分，腔體蓋片上有用于引入樣品和試劑的入口，以及用于廢物流出的出口。芯片上有一個微粒開關(guān)，可以使樣品組分進入不同的區(qū)域以進行進一步的制備和分析。
圖19A是多力芯片俯視圖，芯片上層的交錯電極可以產(chǎn)生介電電泳力，下層的電磁元件可以產(chǎn)生電磁力。
圖19B是包含多力芯片的腔體俯視圖。顯示稀釋了的血液樣品被引入腔體。
圖19C是包含多力芯片的腔體俯視圖。顯示白細胞在正向介電電泳力的作用下聚集在交錯式的微電極陣列的邊緣。
圖19D是包含多力芯片的腔體俯視圖。顯示引入表面包被有oligo-(dT)25的磁珠的裂解緩沖液。
圖19E是包含多力芯片的腔體俯視圖。顯示通電的磁極捕獲磁珠的情況。
圖19F是被捕獲的磁珠上的mRNA的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果照片。
詳細描述定義除非另加定義，否則本文所用的科技術(shù)語都按照它所屬領(lǐng)域的一般定義理解。一般的，本文的命名法和以下描述的制造及實驗過程都很通用，并且在這一技術(shù)領(lǐng)域常常被引用。這些過程都使用傳統(tǒng)方法，同這一技術(shù)和通常文獻中提到的一樣。方向術(shù)語比如“上”、“下”、“上面的”、“下面的”和類似的一些術(shù)語指裝置在應(yīng)用時各部分的方向。本文的命名法很通用，并且在這一技術(shù)領(lǐng)域常常被使用。術(shù)語和定義與文獻中統(tǒng)一的術(shù)語和定義有差異的地方應(yīng)使用本文中的定義。本發(fā)明中的以下術(shù)語，如果沒有其它說明都應(yīng)該按照下面的解釋理解。
“集成式芯片系統(tǒng)”、“集成式生物芯片系統(tǒng)”和“系統(tǒng)”是指至少一塊這樣的芯片，它能夠完成樣品制備和分析過程中至少兩個順序的任務(wù)，其中至少一個任務(wù)是對樣品進行處理。
“任務(wù)”是指樣品制備和分析過程中的一個功能。一個任務(wù)可以包括多個步驟。例如，一個分離任務(wù)可以包括有利于分離的混合步驟和結(jié)合步驟。
本發(fā)明所述的系統(tǒng)中的芯片實現(xiàn)的“功能”可以是一個任務(wù)本身，例如一個處理或是分析的任務(wù)；也可以發(fā)生在兩個任務(wù)之間，或是作為一個任務(wù)的一部分。一個非任務(wù)功能的例子是混合功能，例如在芯片上通過聲場作用力促進樣品組分的分散或是結(jié)合。另一個非任務(wù)的功能的例子是通過電泳力、介電電泳力、行波介電電泳力、行波磁致電泳力等作用力將實體分子從一塊芯片上轉(zhuǎn)移到另一塊芯片上或從芯片的某一區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一區(qū)域。
“處理任務(wù)”是樣品處理的一個過程(樣品處理即樣品制備)。一般而言，制備任務(wù)是指對樣品組分的分離、轉(zhuǎn)移、聚集、捕獲、隔離、濃縮或富集，至少是樣品的部分純化，或是樣品組分的分裂或是結(jié)構(gòu)變化(比如，破胞、變性、化學(xué)修飾、與其它試劑的結(jié)合)。一個制備步驟是釋放、修飾一種樣品組分，或是產(chǎn)生另一種能用于下一步制備或分析的樣品組分。例如，一個細胞可以經(jīng)過一個處理步驟進行裂解，釋放出的核酸可以在進一步的制備任務(wù)中被分離，或在隨后的分析任務(wù)中被檢測。結(jié)合或是偶聯(lián)可以是處理任務(wù)中的一步，尤其是在樣品組分與結(jié)合物(例如微顆粒)的結(jié)合可以促進分離、轉(zhuǎn)移、捕獲、隔離、聚集、濃縮、富集、結(jié)構(gòu)變化，或者至少是樣品的一個組分的部分純化的場合。在可以促進結(jié)合、分離、轉(zhuǎn)移、富集、結(jié)構(gòu)變化，或者至少是樣品的一個組分的部分純化的場合，混合也能成為處理任務(wù)中的一步。
“分析任務(wù)”是決定樣品制備和分析過程的結(jié)果的任務(wù)，可以是結(jié)合分析、生化分析、細胞分析、遺傳分析等等。通常而言，分析任務(wù)決定樣品組分的有無、含量以及活性。在結(jié)合或偶聯(lián)可以促進至少一種樣品組分的分析或檢測的場合，結(jié)合或偶聯(lián)可以是分析任務(wù)的一步。在混合可以促進至少一種樣品組分的分析或檢測的場合，混合可以是分析任務(wù)的一步。
“順序”是指遵守一定的次序，比如在需要遵守一定的次序來獲得所希望的最終結(jié)果的場合。本發(fā)明的集成式生物芯片系統(tǒng)中為了獲得最終結(jié)果，任務(wù)都是順序進行。當(dāng)兩個任務(wù)順序進行時第二個任務(wù)使用第一個任務(wù)的一個或多個產(chǎn)物，此處“產(chǎn)物”可以是指被分離的樣品組分，至少在第一步中被部分純化或濃縮，也可以是上一步變性或細胞裂解的產(chǎn)物。本文中，“第一”、“第二”不是指它們在全分析系統(tǒng)中的絕對順序，而是指它們的相對順序，比如第二個芯片上的處理過程發(fā)生在第一塊芯片上的處理過程之后。
“芯片”是指在可以進行其上至少一種處理或操縱的表面。比如轉(zhuǎn)移、分離、聚集、富集、濃縮、物理破碎、混合、結(jié)合、分析等等。芯片可以由固體或半固體制成，材料可以是多孔的或者致密的。特定過程可以在其上進行，比如物理的、化學(xué)的、生物的、生物物理的、或者生物化學(xué)的過程。一個可以實現(xiàn)多種功能的芯片可以連接一個或多個不同的功能元件比如特異結(jié)合物、基底、反應(yīng)物、或者在反應(yīng)過程中可以產(chǎn)生不同物理作用力的不同類型的微結(jié)構(gòu)。芯片可以是多力芯片，不同的功能元件可以集成在同一表面上，或者集成在結(jié)構(gòu)相連的不同基底或?qū)由?此處，層是用以支持基底、微結(jié)構(gòu)和用以實體分子操縱的表面)。關(guān)于多力芯片的描述，見美國專利“Apparatuses Containing Multipie Active Force Generating Elements andUses Thereof”(申請?zhí)?9/679,024，2000年10月4日遞交)。
芯片上制有或集成有諸如槽、通道、電極單元和壓電傳感器等等微加工結(jié)構(gòu)，在其上可以進行物理的、生物物理的、生物的、化學(xué)的反應(yīng)或是處理。芯片是一塊薄片。對芯片的表面積大小的要求并不苛刻，比如從1mm2到0.25m2都可以。最好所用的芯片的表面積從4mm2到25cm2左右。芯片可以具有不同形狀，規(guī)則的形狀如矩形、圓形、橢圓形，也可以是其它不規(guī)則的形狀。芯片表面可以是平的，也可以是不平的。具有不平的表面的芯片在表面上應(yīng)包括通過在芯片表面進行加工或是蝕刻而得的槽、腔體等結(jié)構(gòu)。
“微結(jié)構(gòu)”是集成在芯片或腔體內(nèi)部或與之接觸的結(jié)構(gòu)，具有特征的，用于微流體系統(tǒng)的尺寸，大約是在0.1微米到20毫米范圍內(nèi)。微結(jié)構(gòu)的例子是孔、通道、支架、電極、電磁元件、壓電傳感器、金屬線或者薄膜、帕爾帖元件、微泵、微閥、毛細管或是光學(xué)元件。見美國專利“ApparatusesContaining Multiple Active Force Generating Elements and Uses Thereof”(申請?zhí)?9/679,024，2000年10月4日遞交)。微結(jié)構(gòu)被選通時(比如提供一個電信號)可以產(chǎn)生物理力。可以認為時“物理作用力產(chǎn)生元件”、“物理力元件”、“主動力元件”或者“主動元件”。
“基底”指可以對實體分子進行操縱和滯留的芯片表面?；卓梢允鞘杷部梢允怯H水的或者是二者的結(jié)合，可以包含硅、橡膠、玻璃、一種或多種陶瓷、塑料、聚合物、共聚物等原料?；卓梢允枪腆w或半固體，可以包含一個或多個通道或孔，可以支持微結(jié)構(gòu)和功能元件比如特異結(jié)合物、底物、反應(yīng)物、催化劑。
“電極”是一種由高導(dǎo)電材料制成的結(jié)構(gòu)單元。這里所謂的高導(dǎo)電材料是指材料的導(dǎo)電率遠大于周圍介質(zhì)或材料。高導(dǎo)電材料包括金屬，如金、鉻、鉑、鋁等等，也可以是非金屬，如石墨、導(dǎo)電聚合物。電極可以制成各種形狀，如矩形、圓形、城堡形等等。電極材料中也可以包括摻雜半導(dǎo)體，如硅片上摻磷。
“腔體”是能夠容納液體樣品的結(jié)構(gòu)，更適合的是包括至少一塊芯片的一部分。
“端口”是指腔體的開口，液體樣品可通過它進出腔體。端口可以是任何大小的，但適宜的是可允許樣品借助物理作用力或是由吸液管，注射器，導(dǎo)管或其它加樣方式加入腔體的形狀和尺寸。
“導(dǎo)管”在本專利中是用以將液體由容器轉(zhuǎn)移到腔體的一種方式。導(dǎo)管適宜應(yīng)用于腔體的端口。導(dǎo)管可由任何允許液體通過的材料組成。比較適宜的導(dǎo)管是管狀結(jié)構(gòu)，比如橡膠管、聚四氟乙烯管、或聚乙烯管。導(dǎo)管可以是任意尺寸的，但適宜的是內(nèi)徑在10微米到5毫米之間。
“孔”是芯片上的結(jié)構(gòu)單元，具有一個較低的表面和一個或多個從底面以一定角度延伸出來的側(cè)面。側(cè)面的參數(shù)很隨意，例如可以具有S形的或是彎曲的或是具有多個角度的側(cè)面。孔的底面可以低于、高于或是和芯片上表面水平。側(cè)面的材料應(yīng)和芯片的下表面的材料不同。例如，芯片下表面可以由一層能被電場力(包括介電電泳力、行波介電電泳力和電磁力)穿透的物質(zhì)構(gòu)成，而孔的側(cè)面由其它物質(zhì)組成，如絕緣材料，可以阻礙電場力的穿透?？椎膫?cè)面或是芯片上的通道可以由任意適當(dāng)?shù)牟牧现瞥桑绻?、玻璃、橡膠、多聚物、塑料、陶瓷、金屬等等。
“通道”是一種芯片上的結(jié)構(gòu)單元，具有一個較低的底面和至少兩個從底面延伸上來的側(cè)面，側(cè)面的長度比側(cè)面之間的距離要大的多，液體可以從底面和側(cè)面形成的腔體的內(nèi)部流過。通道可以封閉也可以是開放的。
“主動芯片”是在其內(nèi)部或上面具有制作的微結(jié)構(gòu)的芯片。當(dāng)外界供能時產(chǎn)生至少一種物理作用力，能完成一項制備步驟或任務(wù)或者分析步驟或任務(wù)，例如，但不僅僅限于混合、轉(zhuǎn)移、聚集、分離、濃縮、捕獲、隔離、富集。主動芯片利用外加的物理作用力激發(fā)、增強或促進所需的生化反應(yīng)，制備步驟或任務(wù)，分析步驟或任務(wù)的進行。對于主動芯片，“外加的物理作用力”是當(dāng)外界提供能量時，由芯片上的微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的物理作用力。
“被動式芯片”不利用外加的物理力操縱或控制化學(xué)、生化和生物反應(yīng)中的分子或微粒。而是利用分子或微粒的熱擴散或本身受到的力比如地球的重力。
“電磁芯片”是至少有一個電磁單元(例如一個微電磁單元)的芯片。電磁元件可以制作在芯片的表面，也可以集成在或是至少部分集成在芯片的內(nèi)部。例如電磁元件可以在芯片的表面上，也可以嵌入芯片內(nèi)部?；蛘撸姶旁梢圆糠智度胄酒瑑?nèi)部。電磁芯片可以參見美國專利申請“l(fā)ndividually Addressable Micro-Electromagnetic Unit Array Chips”(申請?zhí)?9/399,299，1999年9月17日遞交)和美國專利申請“l(fā)ndividuallyAddressable Micro-Electromagnetic Unit Array Chips in HorizontalConfigurations”(申請?zhí)?9/685,410，2000年10月10日遞交)。
“微粒開關(guān)芯片”包括至少三套相互獨立的電極，可以用行波介電電泳力或行波電泳力移動微粒，當(dāng)電極上施加不同相位的電信號時，可以沿連接在同一節(jié)點處的不同支路移動微粒。可以參見美國專利申請“Apparatus forSwitching and Manipulating Particles and Methods of Use Thereof”(申請?zhí)?9/678,263，2000年10月3日遞交)。
“多力芯片”是可以產(chǎn)生多種物理作用力的芯片，至少含有兩部分內(nèi)部結(jié)構(gòu)，每一部分施加外界信號后都可以產(chǎn)生一種類型的物理作用力。關(guān)于多力芯片的全面描述見美國專利申請“Apparatuses Containing MultipieActive Force Generating Elements and Uses Thereof”(申請?zhí)?9/679,024，2000年10月4日遞交)。
“混合”在本文中是指用物理作用力使微粒在樣品、溶液、混合物(比如樣品和樣品溶液的混合液，實體分子和結(jié)合物的混合物)中運動?；蛘咭鹎惑w中樣品、溶液、混合物的運動，進而引起其中組分的運動。本發(fā)明用聲場力和對流進行混合。
“破壞”在本文中指改變樣品組分的結(jié)構(gòu)。比如細胞溶解，蛋白質(zhì)變性和復(fù)合物(如核糖體)上亞基的解離?？梢越柚锢碜饔昧Ρ热绺邏弘妶龌蚵晥鲎饔昧?，或者使用試劑例如變性劑、螯合劑、表面活性劑和酶等等。
“壓電傳感器”是在電信號作用下能產(chǎn)生聲場的結(jié)構(gòu)。較常用的壓電傳感器是壓電陶瓷片或兩面都用金屬層覆蓋的壓電薄層。
“電磁單元”是在通電時能產(chǎn)生磁場，使得磁珠受到磁力作用的結(jié)構(gòu)。電磁單元一般包括一個磁性或可磁化的磁心，以及一個在磁心周圍傳導(dǎo)電流導(dǎo)電線圈。
“流體”是電泳力或機械力推動的液體流，機械力可以是壓力或是熱對流力等。
“自動的”指不需人工干預(yù)，比如吸液或其它手動轉(zhuǎn)移液體或試劑，倒轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)試管，把試管放進離心機或恒溫箱。一個自動系統(tǒng)需要人為向系統(tǒng)引進樣品(吸液或注射)，或人為取走過多的樣品(從腔體中吸出或收集在一個管子里)。一個自動系統(tǒng)可以需要或者不需要熟練人員來控制能量驅(qū)動系統(tǒng)或者流體系統(tǒng)，在集成式芯片系統(tǒng)操縱過程中控制能量驅(qū)動系統(tǒng)產(chǎn)生物理作用力來完成制備和分析任務(wù)，樣品移動和其它過程。自動系統(tǒng)比如自動式集成芯片系統(tǒng)最好但不是必須可編程。
“物理場”，其它的說法還有“在一定空間范圍內(nèi)的物理場”或“在一定空間范圍內(nèi)產(chǎn)生的物理場”是指一個具有如下特征的空間范圍。當(dāng)一個具有適當(dāng)性質(zhì)的實體分子被放入這一空間中(也就是進入物理場中)，作為這一實體分子和場相互作用的結(jié)果，實體分子受到了力的作用。實體分子在場中通過場在其上施加的力被操縱。典型的場包括電場、磁場、聲場、光場和速度場。在本發(fā)明中，物理場總是存在于一定空間范圍內(nèi)的介質(zhì)中，這些被操縱的實體分子通常是懸浮、或溶解，或更一般的是被放在介質(zhì)中。典型的介質(zhì)是液體如水或非水液體，或是氣體。根據(jù)場的性質(zhì)，電場可以對帶電實體分子施加電泳力，或?qū)щ娀蛑行詫嶓w分子施加常規(guī)介電電泳力和/或行波介電電泳力。磁場可以對磁性實體分子施加磁場力；聲場可以對實體分子施加聲場輻射力；光場可以對實體分子施加光場輻射力。在一定空間范圍內(nèi)的介質(zhì)中的速度場是指在這一空間范圍內(nèi)介質(zhì)移動的速度分布。各種不同的機制可以引起介質(zhì)的移動并且在不同位置的介質(zhì)表現(xiàn)出不同的速度，所以產(chǎn)生了一個速度場。速度場可以對實體分子施加機械力。
“物理力”是指這樣一種用以使實體分子或是其連接物運動的力，它不與或是幾乎不與實體分子或是其連接物發(fā)生化學(xué)、生物反應(yīng)，不影響或是幾乎不影響實體分子或是其連接物的生物、化學(xué)性質(zhì)。術(shù)語“力”或“物理力”總是指作用在這些實體分子上的“力”或“物理力”，“力”或“物理力”是通過場的作用產(chǎn)生的，由實體分子本身的性質(zhì)決定。因此，當(dāng)給定了一個場或物理場，為了在實體分子上產(chǎn)生物理力，這些實體分子必須具有一定的性質(zhì)。某些類型的場可以在多種具有不同性質(zhì)的實體分子上都產(chǎn)生力的作用，而某些類型的場也許只可以對一些有限類型的實體分子施加力的作用。例如，磁場只能在磁性實體分子或具有一定磁性的實體分子上產(chǎn)生力或磁場力，而不適用于其它類型的微粒，如聚苯乙烯珠。而另一方面，一個非均一的電場可以在許多種不同類型的實體分子上施加物理力的作用，如聚苯乙烯珠、細胞，還有磁珠等等。
“電場力”是電場施加在實體分子上的作用力。
“電場模式”指電場的分布，它是電場的頻率、場強大小、電極形狀和頻率/場強調(diào)制的函數(shù)。
實體分子的“介電性質(zhì)”至少部分是由實體分子對電場的響應(yīng)決定的。實體分子的介電性質(zhì)包括實體分子的有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)。對于由相同或是相似結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合物，例如，聚苯乙烯珠體，它的有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)至少在很大的范圍內(nèi)(例如1赫茲到100兆赫茲)與電場頻率無關(guān)。具有均一成分的微粒具有表面凈電荷，當(dāng)這些帶電微粒懸浮在介質(zhì)中，在微粒/介質(zhì)的接觸面將形成電雙層。外加電場與該電雙層相互作用導(dǎo)致了微粒有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)的改變。外加電場與電雙層的相互作用通常是與頻率有關(guān)的，因此，微粒有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)也與頻率有關(guān)。對于由不同組分構(gòu)成的復(fù)合物，例如，細胞，它的有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)由兩部分組成，即細胞膜的有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)及細胞內(nèi)部的有效電導(dǎo)率和有效介電系數(shù)，并且和電場的頻率相關(guān)。此外，電場中實體分子所受的介電電泳力和實體分子的尺寸相關(guān)，這樣，實體分子的尺寸也應(yīng)被考慮在實體分子的介電性質(zhì)之中。對實體分子的介電性質(zhì)有貢獻的實體分子的性質(zhì)包括它所帶的凈電荷、它的組成(包括所帶的化學(xué)基團、其它實體分子等等)、它的尺寸、表面參數(shù)、表面所帶電荷。
“介電電泳力”是在非均勻幅值交流電場中極化微粒受到的力。這里，“介電電泳”指的是實體分子在介電力作用下的運動。
“介電電泳”是極化微粒在非均勻幅值電場中的運動。通常有兩種形式的介電電泳，正向介電電泳和負向介電電泳。在正向介電電泳中，微粒受介電電泳力的作用向強場區(qū)域運動。在負向介電電泳中，微粒受介電電泳力的作用向弱場區(qū)域運動。微粒作正向還是負向介電電泳，是由微粒和介質(zhì)的相對極化程度決定的。
“行波介電電泳力”是指在行波電場中的分子或微粒上受到的力。理想行波場的特征是，交流電場分量的相位值是微粒所處位置的線性函數(shù)。在排布在芯片上的微電極上施加合適的交流信號就可以產(chǎn)生行波電場。為了產(chǎn)生行波電場，至少在電極上應(yīng)施加三組不同相位值的電信號。一個行波電場的例子中，使用了四種不同相位值的電信號(分別為0、90、180、270度)，施加在四個線狀的排布在芯片表面的平行電極上，這樣的四個電極可以作為一個基本的重復(fù)單元用于芯片設(shè)計。根據(jù)應(yīng)用的需要，可以把兩個以上這樣的單元排列起來，從而在電極的上方或是附近產(chǎn)生行波電場。只要把電極單元在空間上按照一定的次序排列起來，外加的不同相位的信號就可以在電極附近區(qū)域產(chǎn)生行波電場。
“行波介電電泳”是指實體分子在行波電場中的相應(yīng)運動。
“磁場力”是指磁場作用于實體分子上的力。
“行波電磁力”指微?；蚍肿釉谛胁ù艌龌虼帕π胁ㄖ惺艿降牧Α?br> “行波磁泳”是指磁性微?；蚴强纱呕⒘Ｔ谟呻姶艈卧嚵挟a(chǎn)生的磁力行波作用下的運動。單個電磁單元根據(jù)它們之間特定的空間關(guān)系排列。例如，單個電磁單元可以具有長方形的外形和相同的尺寸，用微加工的手段相互平行地固定于芯片上，就像在美國專利申請“l(fā)ndividually AddressableMicro-Electromagnetic Unit Array Chips in Horizontal Configurations”(申請?zhí)?9/685,410，2000年10月10日遞交)中圖24B所描述的那樣。磁泳可以是同步的，也可以是連續(xù)的。在同步磁泳中，直流電可以按照一定的方向依次施加在電磁單元上，使得電磁單元依次產(chǎn)生磁場，形成磁力行波，這樣磁性微?；蚴强纱呕⒘＞涂梢匝刂@個方向運動。在連續(xù)磁泳中，施加在電磁單元上的交流電信號彼此相差一定的相位，例如每4個相鄰電磁單元相差90度的相位。這樣也可以形成磁力行波。
這里，“聲學(xué)力(或聲輻射力)是指由聲場產(chǎn)生的作用于實體分子上的力。
這里，“光學(xué)力(或光輻射力)是指由光場產(chǎn)生的作用于實體分子上的力。
“樣品”是指任何可以從中分離或分析出組分的流體。樣品可以有各種來源，可來自一個生物體，來自相同或不同種類的一群生物，也可以來自環(huán)境，如取自一水體或土壤，或者來自食物或工業(yè)材料。樣品可以是加工過的，也可以是未加工的。樣品可以是氣體，液體，半固體，也可以是溶液或懸濁液。樣品可以是一種提取物，如取自土壤或食物樣品的液體提取物，如咽喉或生殖器的提取物，或如取自排泄物樣品的提取物。
“血液樣品”在這是指加工過或未加工的血樣，比如說，但不僅僅限于，它可以是經(jīng)過離心、過濾、抽提或其他處理的血液樣品，還可以是加入了抗凝血劑，穩(wěn)定劑等一種或多種試劑的血液樣品。血液樣品可以是任意體積，來源任意，如動物或人類。首選的材料是來自人類。
“對象”是指任何生物體，如動物或人類。動物可包括任何動物體，如野生動物，家養(yǎng)動物如貓或狗，農(nóng)用動物如豬或牛，或者是娛樂用動物如馬。
“白細胞”是指白血球，或是一類可以在動物血液中找到的既非網(wǎng)織紅細胞又非血小板的生血細胞。白血球可包括淋巴細胞，如B淋巴細胞或T淋巴細胞。白血球也可包括吞噬細胞，如單核細胞，巨噬細胞以及包含有嗜堿細胞，嗜曙紅細胞，嗜中性粒細胞的粒狀白細胞。白血球還包括肥大細胞。
“紅細胞”是指紅血球。
“腫瘤細胞”是指一類細胞增殖生長比正常細胞快得多的異常細胞，它甚至可以在受到導(dǎo)致新生長停滯的刺激后仍繼續(xù)生長。與正常組織相比，瘤細胞往往會部分或全部缺乏結(jié)構(gòu)組織和功能協(xié)調(diào)性，它既可能是良性的也可能是惡性的。
“惡性細胞”是指一類具有局部入侵性和破壞性生長及轉(zhuǎn)移的細胞。
“干細胞”是指一類未發(fā)生分化的細胞，它可通過一輪或多輪細胞分化引起生長，生成至少一種分化細胞。
“分化早期細胞”是指一類未發(fā)生分化但必然將引起生長的細胞，它通過一輪或多輪細胞分化引起生長，生成至少一種分化細胞。比較有代表性的是，一個干細胞對一個特別的刺激或一系列刺激作出響應(yīng)，通過一輪或多輪細胞分化生成一個分化早期細胞，然后由這個分化早期細胞對一個特別的刺激或一系列刺激作出響應(yīng)，生成一個或多個分化細胞。
“病原體”是指任何病原體，如可以感染生物的細菌、病毒、寄生蟲或朊蛋白。病原體可導(dǎo)致受其感染的生物出現(xiàn)癥兆或處于疾病狀態(tài)。人類病原體是指可以感染人類的病原體。人類病原體既可以是特異性針對人類的，如特異性人類病原體；又可以是可感染多種生物的，如混雜性人類病原體。
樣品的“組分”或“樣品組分”是指樣品的任何組成部分，可以是離子、分子、化合物、分子復(fù)合物、器官、病毒、細胞、聚合體、或任何類型的微粒，包括膠體、聚合體、微粒體、晶體、礦物體等。樣品的成分在樣品介質(zhì)或提供的樣品緩沖或樣品溶液中可以是可溶的也可是不可溶的。樣品的成分可以是氣體、液體、或固體形式的。樣品組分可以是實體分子，也可以不是實體分子。
“實體分子”或是“感興趣的實體分子”是指任何可以用介電電泳力、行波介電電泳力或是電磁力進行操縱的特定物質(zhì)分子。實體分子可以是固體，包括懸浮的固體，也可以以溶解狀態(tài)存在。實體分子可以是分子，可被操縱的分子包括，但不僅僅限于，無機分子(包括離子和無機化合物)，有機分子，包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、糖脂蛋白、脂、脂肪、固醇、糖、碳水化合物以及其它小分子或是復(fù)雜的有機分子。實體分子也可以是分子復(fù)合物，比如細胞器、一種或多種細胞(包括原核和真核細胞)、病原體(包括病毒、寄生蟲、朊蛋白或是這些物質(zhì)的一部分)；實體分子也可以是晶體、礦物質(zhì)、膠體、碎片等等，可以由一種或是多種無機物質(zhì)如聚合物、金屬、礦物、玻璃、陶瓷等等組成；實體分子也可以是分子聚集體、復(fù)合物、細胞、細胞器、病毒、病原體、晶體、膠體或是其它碎片。細胞可以是任何種類的細胞，包括原核和真核細胞。其中真核細胞也可以是任何類型。通常感興趣的細胞包括，但不僅僅限于，白細胞、惡性細胞、干細胞、分化早期細胞、胎兒細胞、被病原體感染的細胞、細菌細胞等等。實體分子也可以是人造微粒，例如聚苯乙烯微粒，其它材料的聚合物微粒，磁性微粒以及碳微粒等。
“細胞內(nèi)實體分子”是指位于細胞內(nèi)的實體分子，即位于細胞質(zhì)或細胞器基底中，附著在任何細胞內(nèi)膜上，位于質(zhì)膜(如果存在)上，或是位于細胞表面，即附著在細胞質(zhì)膜或細胞壁(如果存在)的外表面上。
“操縱”是指移動和處理這些實體分子，從而導(dǎo)致實體分子在芯片上(包括在單芯片上或多集成芯片上或其間，在基底上或在裝置中的多個基底之間)作一維、二維或三維方向上的運動?！安倏v”包括，但不僅僅限于，輸運、聚焦、富集、濃縮、聚集、捕獲、推斥、懸浮、分離、分餾、隔離、線性或是其它方向上的實體分子的移動。為了實現(xiàn)高效的操縱，待操縱的實體分子和施加于其上的物理力應(yīng)是協(xié)調(diào)的。例如，具有磁性的實體分子可以施加以磁力。相似的，具有電荷的實體分子可以施加以靜電力(即電泳力)。在操縱連接物-實體分子復(fù)合物的情況中，這些實體分子或相應(yīng)的連接物的性質(zhì)和用于操縱的物理力必須是協(xié)調(diào)的。例如，實體分子或它的連接物具有一定的介電性質(zhì)，可以被介電極化，可以使用介電電泳力。
“待操縱的實體分子與連接物的表面充分結(jié)合”是指一定百分比的待操縱的實體分子結(jié)合在連接物的表面并且可以用適當(dāng)?shù)奈锢砹νㄟ^操縱連接物實現(xiàn)對實體分子的操縱。通常，至少0.1％的待操縱的實體分子是結(jié)合在連接物的表面的。更適宜的是至少1％、5％、10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的實體分子是結(jié)合在連接物的表面的。
“待操縱的實體分子完全結(jié)合在連接物的表面上”是指至少90％的待操縱實體分子結(jié)合在連接物的表面上。更適宜的是，至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的待操縱實體分子結(jié)合在連接物的表面上。
“選擇性的修飾紅細胞的溶液”是指這種溶液可以改變無核紅細胞的性質(zhì)，使其不干擾血液樣品中的其它細胞或組分的介電分離，同時盡可能小的影響白細胞的完整性，或是不影響用介電電泳的方法將白細胞和血液樣品中的其它組分分開的過程。
“連接物”是指任何可以和實體分子以一定親和性和特異性相連的任何物質(zhì)，并且可以通過相應(yīng)的物理力進行操縱。連接物可以是，但不僅僅限于，細胞、細胞器、病毒、微粒、聚合體或復(fù)合體，或者分子的聚合體或復(fù)合體。
“微?！笔侵溉魏涡螤?，任何組成，具有任何復(fù)合結(jié)構(gòu)的微粒，可以通過相應(yīng)的物理力進行操縱。微粒尺寸可以從大約0.01微米到大約10厘米。更合適的是，在這種方法中的微粒的尺寸從大約0.1微米到大約幾千個微米。微?？梢杂筛鞣N合適的材料制成，例子包括，但不僅僅限于，玻璃、陶瓷、聚合物如尼龍、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、葡聚糖等等。微粒的例子包括，但不僅僅限于，塑料微粒、陶瓷微粒、碳微粒、聚苯乙烯珠體、玻璃珠、磁珠、中空玻璃珠、金屬微粒和微粒復(fù)合物、微加工形成的微顆粒。
“耦聯(lián)”即結(jié)合。例如，實體分子可以和其它微粒進行特異的或非特異的結(jié)合。結(jié)合可以是共價結(jié)合，也可以是非共價結(jié)合，可以是可逆結(jié)合也可以是非可逆結(jié)合。
“特異結(jié)合物”是指這樣的兩個不同分子中的一個，這樣分子的表面具有特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)可以特異性的和另一分子的空間或極性結(jié)構(gòu)互補結(jié)合。特異結(jié)合物可以是免疫家族中特異結(jié)合的兩種物質(zhì)中的一種，如抗原-抗體、生物素-親和素、生物素-鏈霉親和素、配體-受體、雙鏈核酸、IgG-蛋白A、DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等等。
“核酸分子”是指多聚核苷酸。核酸分子可以是DNA、RNA或兩者的組合。核酸分子也可以包括除了核糖和脫氧核糖外組成骨架鏈的的糖類，可以是DNA或RNA之外的核苷酸分子。核酸分子可以由自然存在的或非自然存在的核苷酸堿基組成，如黃嘌呤，核苷堿基的延伸物2-氨基酰嘌呤或類似物等。核酸分子可以是肽核酸分子。核酸分子可以是任意長度，可以是單鏈、雙鏈或是三鏈結(jié)構(gòu)，或者是它們的復(fù)合體。
“相同操縱”是指使用外加物理力對混合物中的微粒進行操縱，施加力場后混合物中所有的微粒對外加物理場的響應(yīng)一致。
“選擇性操縱”是指使用外加物理力對混合物中的微粒進行操縱，施加力場后混合物中不同的粒子對外加物理場具有不同的響應(yīng)。
“分離”是指將樣品中的一種或多種組分和另外的一種或多種組分在空間上相互分開的過程。分離過程可以這樣進行，一種或多種感興趣的實體分子被定位于分離器件中的某個或某些位置，至少部分樣品中的其它組分被定位于其它位置，或是從感興趣的實體分子所在的位置移開。或者，可以將樣品中的一種或多種組分定位在某些位置，而一種或多種感興趣實體分子從該位置處被移走，再進行收集。也可以將樣品中的一種或多種組分定位在某些位置，再將另外的一種或多種感興趣的實體分子定位到另外的位置。分離可以通過使用物理力、化學(xué)力、電場力或是磁場力等等實現(xiàn)，還可以使用重力場、流體、介電電泳力、行波介電電泳力和電磁力等等實現(xiàn)。
“捕獲”是指這樣一類分離方式，這種方式使一種或多種實體分子滯留在芯片的一個或多個區(qū)域內(nèi)，再施加物理力進行捕獲。
“分析”是對樣品或樣品的一個組分進行的測試。分析可檢測某組分的存在與否，某組分的數(shù)量或濃度，某組分的組成，以及某組分的活性等等。分析可與本發(fā)明的方法和器件、試劑一起使用，包括生物化學(xué)分析、結(jié)合分析、細胞分析以及基因分析。
“反應(yīng)”是指可改變一種或多種分子或化合物的化學(xué)或生化成分，或者改變一種或多種分子與另外一種或多種分子或化合物間相互關(guān)系的化學(xué)或生化過程。本發(fā)明中的反應(yīng)可以被酶催化，包括，但不僅僅限于，降解反應(yīng)，合成反應(yīng)，修飾反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)。
“結(jié)合分析”是一種分析方式，它通過將特定物質(zhì)分子與特異性結(jié)合物結(jié)合來檢測該特定物質(zhì)分子的存在或濃度，或者檢測一特定物質(zhì)分子與另一特定物質(zhì)分子的結(jié)合可能性，或者檢測一特定物質(zhì)分子與另一特定物質(zhì)分子的結(jié)合親和力。特定物質(zhì)分子可指一有機或無機分子，一個由有機、無機或一有機無機復(fù)合物，細胞器，病毒或細胞組成的分子混合物。結(jié)合分析可以使用可檢測的標(biāo)記或在結(jié)合特定物質(zhì)分子存在下可產(chǎn)生可檢測標(biāo)記的信號發(fā)生系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合分析包括依賴核酸雜交來檢測特殊的核酸序列，依賴抗體對特定物質(zhì)分子的結(jié)合，以及依賴配體對受體的結(jié)合。
“生化分析”是指對一種樣品的一個或多個組分的存在、濃度、或活性進行分析的方式。
“細胞分析”是指一種檢測細胞過程的分析方式，例如，但不僅僅限于，新陳代謝活性、分解代謝活性、離子通道活性、細胞間信號傳導(dǎo)活性、受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄活性、翻譯活性、或分泌活性等等。
“基因分析”是指一種檢測某遺傳單元的存在或序列的分析方式。此遺傳單元可指DNA或RNA的任意片斷，包括，但不僅僅限于，基因、重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座單元、調(diào)控單元、端粒、中心?；蚱渌哂鞋F(xiàn)在尚未知道功能的DNA或RNA片斷。基因分析的例子如(但不僅僅限于這些例子)，核酸雜交技術(shù)，包括核酸測序反應(yīng)，可以使用一種或多種聚合酶，例如基于PCR的基因分析。基因分析可以使用一種或多種可檢測的標(biāo)記，比如，但不僅僅限于，熒光素、放射性同位素或是信號發(fā)生系統(tǒng)。
“可被檢測的標(biāo)記”是一種可以被檢測的復(fù)合物或分子，它們可以產(chǎn)生輸出信號，如熒光、放射性、顏色、化學(xué)發(fā)光或技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有的或是今后發(fā)展出的能產(chǎn)生輸出信號的方法。輸出可以基于熒光，如通過熒光標(biāo)記物，例如Cy-3，Cy-5，藻紅蛋白，藻藍蛋白，別藻藍素，異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明，或鑭系元素等等，但不是僅僅限制于以上物質(zhì)；也可以通過熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)和它的變體，要基于酶反應(yīng)的活性，比如，但不僅僅限于β-牛乳糖，β-內(nèi)酰胺酶，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶或熒光素酶等等；或者可以基于放射性同位素(如33P，3H，14C，35S，125I，32P或者131I等)。標(biāo)記物也可以是被其它基團修飾了的堿基，比如，在C5位置修飾嘧啶或在N7位置修飾嘌呤。修飾基團可以是多種多樣的，例如鹵素、醚或者聚醚、烷基、脂類或聚脂類，或常見的XR，在這里，X是連接基團，R是修飾基團。在修飾技術(shù)領(lǐng)域，存在許多種有效的可能適用于修飾核酸分子、寡核苷酸分子及其類似物的方法。方法。(A Practical Approach，Eckstein，ed.(1991)and in PCT/US94/00193)。
“信號發(fā)生系統(tǒng)”可以包括一種或多種組分，至少其中一種組分是可檢測的結(jié)合物。信號發(fā)生系統(tǒng)包括所有用以產(chǎn)生或增強可測信號(或是通過一定的方法作用于標(biāo)記以產(chǎn)生的信號)的試劑。信號發(fā)生系統(tǒng)提供了一種可以用外部檢測方法檢測的標(biāo)記，這種方法通常是通過測量吸收光和發(fā)射光的波長的差異實現(xiàn)的。信號發(fā)生系統(tǒng)也可包括生色底物和酶，其中生色底物在酶的作用下，吸收可見光區(qū)或紫外光區(qū)的光或是磷光、熒光，從而顯出顏色。當(dāng)然，信號發(fā)生系統(tǒng)也可以使用諸如放射性同位素之類的可檢測標(biāo)記以提供可檢測的信號。
信號發(fā)生系統(tǒng)包括至少一種催化劑(通常是至少一種酶)和至少一種底物，也可以包括兩種或更多的催化劑和一組底物(比如包括一組酶，其中一種酶的底物是另一種酶的產(chǎn)物)。信號發(fā)生系統(tǒng)的操縱是在預(yù)定的位點產(chǎn)生出可檢測的信號，即意味著在這預(yù)定的位點具有相應(yīng)的標(biāo)記。
為了得到可檢測的信號，這就要求將在預(yù)定位點的標(biāo)記產(chǎn)生的信號進行放大。這樣，這個標(biāo)記一般是催化劑、發(fā)光化合物或是放射性同位素，最好是催化劑。催化劑最好是可以從單個標(biāo)記產(chǎn)生多種信號發(fā)生分子的酶或是輔酶。酶或是輔酶可以通過產(chǎn)生可以吸收光的產(chǎn)物，如染料或是產(chǎn)生在照射下會激發(fā)出光的產(chǎn)物，如熒光劑以達到將所需信號放大的目的?；蛘撸呋磻?yīng)也可以直接產(chǎn)生激發(fā)光，例如化學(xué)發(fā)光。許多酶和輔酶都可以用以這一目的，見美國專利No.4,275,149和美國專利No.4,318,980(在參考文獻中)。另外，許多也可以實現(xiàn)上述作用的非酶類催化劑可見美國專利No.4,160,645(1979年7月10日)。
上述酶反應(yīng)的產(chǎn)物通常是染料或是熒光劑。在美國專利No.4,275,149中給出了大量熒光劑的說明。
其它用于此處的術(shù)語具有和本領(lǐng)域中通常使用時一致的意義，在技術(shù)性詞典中都有解釋。I.用于樣品處理和分析的集成芯片系統(tǒng)本發(fā)明包括一套用于樣品處理和分析的集成式生物芯片系統(tǒng)。所謂的“集成式生物芯片系統(tǒng)”是指具備以下幾個特征的系統(tǒng)1)包含至少一個芯片。2)能夠?qū)悠愤M行至少兩個順序的任務(wù)，其中至少一個任務(wù)為樣品處理任務(wù)。優(yōu)選的是，本發(fā)明中集成芯片系統(tǒng)所進行的任務(wù)至少有一項需要施加物理力，其產(chǎn)生源可以一部分在芯片外部，另一部分在芯片內(nèi)部。在本發(fā)明系統(tǒng)中至少一種芯片所進行的任務(wù)中，最好但不是必須的，至少一種樣品的組分可通過特定的連接部分如微粒來操縱。
腔體是芯片的組成部分之一，芯片是一塊固體基片，在其上可以進行一次或是多次的分離、分析、捕獲等等過程。芯片的材料可以是金屬、陶瓷、聚合物、共聚物、塑料、橡膠、硅、玻璃等等中的一種或是幾種。芯片可以包含幾種具有一定柔韌性的材料。芯片可以由多孔材料制成，也可以由致密的材料制成。芯片上制有或集成有諸如槽、通道、電極單元等等微加工結(jié)構(gòu)，在其上可以進行物理的、生物物理的、生物的、化學(xué)的反應(yīng)或是處理。芯片是一塊薄片。對芯片的表面積大小不作要求，比如從1mm2到0.25m2都可以。最好所用的芯片的表面積從4mm2到25cm2左右。芯片可以具有不同形狀，規(guī)則的形狀如矩形、圓形、橢圓形或其它不規(guī)則的形狀。芯片表面可以是平的，也可以是不平的。具有不平的表面的芯片在表面上可以包括通過在芯片表面進行加工或是蝕刻而得的槽、腔體等結(jié)構(gòu)。
芯片可以是腔體的一部分，也可以集成在腔體中，或者至少一部分位于腔體之內(nèi)，但這些并不是本發(fā)明所必須的。本發(fā)明的腔體是一種可以容納流體的結(jié)構(gòu)。腔體可以是任意尺寸，通常應(yīng)可以容納1nl至50ml的流體，更好應(yīng)可以容納1μl至20ml的流體，最佳情況是容納10μl至10ml的流體。一般而言，腔體是芯片上的結(jié)構(gòu)單元之一。腔體可以由任何適當(dāng)?shù)牟牧现瞥?，如硅、玻璃、金屬、陶瓷、聚合物、塑料等等，可以是質(zhì)地堅硬材料，也可以是質(zhì)地柔軟的材料。首選的材料是那些對樣品中的實體分子的介電電泳運動沒有干擾的材料，例如那些不與帶電或是極化分子結(jié)合的材料，如硅、某些種類的塑料或是多聚物(如丙稀酰胺、玻璃等等)。
本發(fā)明中或是本方法中使用的腔體具有一個或多個端口，或是在腔體的壁上具有開口。端口可以是任何大小的，但適宜的是可允許樣品、樣品組分、緩沖液、試劑等等加入腔體的形狀和尺寸。端口可以一直開啟，也可以含有閥，以便于控制開和閉。端口可以是兩個具有公共的壁的腔體的壁上的開口，也可以是為了便于向腔體中引入或是注射樣品，在腔體壁上的開口。
端口可以連接導(dǎo)管。導(dǎo)管可以是任何允許液體通過的管狀結(jié)構(gòu)，比如橡膠管、聚四氟乙烯管、或聚乙烯管。端口可以為反應(yīng)池壁提供一個開口以便于通過泵(蠕動泵和輸運泵)、注射器或是重力作用引入樣品。
本發(fā)明的系統(tǒng)中推薦使用主動式芯片。至少集成生物芯片系統(tǒng)中的一種芯片應(yīng)為主動式芯片。主動式芯片是具有微結(jié)構(gòu)的芯片，這些微結(jié)構(gòu)在外界供能后可以產(chǎn)生相應(yīng)的物理力。可以把外加能量轉(zhuǎn)變成本發(fā)明所需的物理力的微結(jié)構(gòu)可以是，但不僅僅限于，可以產(chǎn)生電泳力或是介電電泳力的電極、可以產(chǎn)生電磁力或是磁力的電磁單元、可以產(chǎn)生聲場力的壓電轉(zhuǎn)換器。根據(jù)芯片上集成的微結(jié)構(gòu)的不同，這些主動式芯片可以分別稱為電泳或是介電電泳芯片(集成了電極)、電磁芯片(集成了電磁單元)或是聲場芯片(集成了壓電轉(zhuǎn)換器)。芯片上還可以集成光學(xué)元件、微型毛細管導(dǎo)或針尖、加熱元件(如金屬導(dǎo)線)、帕爾帖(Peltier)元件、微閥或微泵等等。
主動式芯片可以通過在芯片表面集成或是制作物理力元件(例如電磁單元、壓電轉(zhuǎn)換器或是電極等等)的方法構(gòu)建，也可以采用被動式芯片的制作方法，在芯片表面修飾一層功能層，例如寡核苷酸陣列或是蛋白陣列。其它可以使用在本發(fā)明的主動式或是被動式芯片中的材料還有，但不僅僅限于，親和素(鏈霉親和素)、生物素、抗體、核酸；還可以是酶、催化劑、底物；可以是絕緣層用試劑、進行表面封閉以防止樣品在芯片表面的非特異吸附；可以是復(fù)合物；也可以是病毒和細胞。這些材料可以有選擇地修飾在本發(fā)明的系統(tǒng)中的芯片的微孔或微通道中。用作涂層或是用以防止樣品之間的相互作用、樣品與芯片表面(包括芯片上制作的微結(jié)構(gòu))的非特異性吸附的材料可以修飾在芯片表面(包括芯片上的微結(jié)構(gòu))以形成芯片的“頂層”。頂層可以是由聚合物、化合物如SiO2、表面活性劑、生物分子如BSA等形成的薄層(小于100埃)。
主動式芯片的例子有，但不僅僅限于，制作在玻璃基片上的介電電泳電極陣列(Dielectrophoretic Manipulation of Particles by Wang et al.，in IEEETransaction on Industry Applications，Vol.33，No.3，May/June，1997，pages660-669)；具有可單個選通電極陣列的微加工生物電子芯片(Preparation andHybridization Analysis of DNA/RNA from E. coli on MicrofabricatedBioelectronic Chips by Cheng et al.，Nature Biotechnology，Vol.16，1998，pages541-546)；毛細管電泳芯片(Combination of Sample-Preconcentrationand Capillary Electrophoresis On-Chip by Lichtenberg，et al.，in Micro TotalAnalysis Systems2000 edited by A.van den Berg et al.，pages307-310)；聲場力芯片(美國專利No.6,029,518)；電磁芯片(美國專利申請No.09/399,299，1999年9月17日遞交；美國專利申請“IndividuallyAddressable Micro-Electromagnetic Unit Array Chips in HorizontalConfigurations”，No.09/685,410，2000年10月10日遞交)。
對于介電電泳芯片(包括用以常規(guī)介電電泳或是行波介電電泳的芯片)，芯片上的電極可以具有任意形狀，例如矩形、城堡形、三角形、圓形等等。電極的排布方式也有許多種，比如螺旋狀、平行狀、相互交錯形、多項式形等等。芯片上電極的制作可以使用本領(lǐng)域中常見的各種微加工和微機械方法，例如電鍍、金屬濺射、光化學(xué)蝕刻。包含有電極的芯片有，但不僅僅限于，制作在玻璃基片上的介電電泳電極陣列(Dielectrophoretic Manipulationof Particles by Wang et al.，in IEEE Transaction on Industry Applications，Vol.33，No.3，May/June，1997，pages660-669)、具有可單個選通電極陣列的微加工生物電子芯片(Preparation and Hybridization Analysis ofDNA/RNA from E. coli on Microfabricated Bioelectronic Chips by Cheng etal.，Nature Biotechnology，Vol.16，1998，第541-546頁)和毛細管電泳芯片(Combination of Sample-Preconcentration and Capillary ElectrophoresisOn-Chip by Lichtenberg，et al.，in Micro Total Analysis Systems2000 editedby A.van den Berg et al.，pages307-310)。
其它類型的可以使用在本發(fā)明中的芯片可參見美國專利申請“Apparatus for Switching and Manipulating Particles and Methods of UseThereof”(No.09/678,263，2000年10月3日遞交)和美國專利申請“Apparatuses Containing Multiple Active Force Generating Elements andUses Thereof”(No.09/679,024，2000年10月4日遞交)。單芯片系統(tǒng)本發(fā)明的集成式生物芯片系統(tǒng)僅由一塊芯片構(gòu)成。在這種情況中，單芯片集成式生物芯片系統(tǒng)僅包含一塊可以完成至少兩個順序任務(wù)的主動式芯片。單芯片系統(tǒng)中的主動式芯片由不同功能的元件構(gòu)成，以完成至少兩個順序任務(wù)。
能實現(xiàn)多個功能的芯片可以是一個或多個不同功能的元件，例如特異結(jié)合物、底物、試劑或不同類型的至少可以部分地產(chǎn)生一種或多種物理力的微結(jié)構(gòu)的組合。
在由一塊含不同功能元件的芯片組成的本發(fā)明的系統(tǒng)裝置中，芯片上不同功能元件所在的區(qū)域可以靠得很近，以利于樣品組分在不同功能元件之間擴散(例如，見圖17)。多力芯片中，產(chǎn)生不同物理力的元件分別制作在不同的基底材料上，這些基底材料可以一層一層的豎直疊加在一起。多力芯片的實例請參見2000年10月4日美國專利申請“Apparatuses ContainingMultiple Active Force Generating Elements and Uses Thereof”(No.09/679,024，2000年10月4日遞交)。
當(dāng)然，芯片上的功能元件也可以相互隔開。這種芯片包含可以產(chǎn)生用來將樣品組分從芯片的一處移動到另一處的物理力的多力芯片。用來移動樣品組分的物理力產(chǎn)生元件最好是電極和電磁單元。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，用來將樣品組分從芯片上的一處移動到另一處的電極和電磁單元以一定的方式排列，以產(chǎn)生行波介電電泳力或行波電磁力。
同一塊芯片上所進行順序任務(wù)的先后次序可以由功能元件的選擇性選通來控制；也可以通過控制樣品組分和結(jié)合物(最好是控制與樣品組分連接的微珠)的移動以實現(xiàn)；也可以通過控制試劑的加入來實現(xiàn)，試劑可以是，但不僅僅限于，去污劑、酶、特異結(jié)合物或是它們的組合。
本發(fā)明首選的用于將樣品組分從一個功能區(qū)移動到另一個功能區(qū)的芯片和功能元件層的實例可以參見美國專利申請“Apparatus for Switching andManipulating Particles and Methods of Use Thereof”(09/678,263，2000年10月3日遞交)。這些微粒開關(guān)芯片和微粒開關(guān)層可以用來將樣品組分從芯片的一處轉(zhuǎn)運到另一處，芯片的不同區(qū)域可以有不同的功能元件以完成不同的任務(wù)。它們也可以將樣品組分從多芯片系統(tǒng)的一塊芯片轉(zhuǎn)運到另一塊芯片上，不同的芯片上可以有不同的功能元件以完成不同的任務(wù)。
也有可能使用一種或是多種物理力在腔體上方或內(nèi)部轉(zhuǎn)運樣品組分或微粒。例如，作為轉(zhuǎn)運微粒的電場源的電極可以插入到腔體的壁上或者制作在腔體的壁上，向任意方向延伸(包括頂壁)。也可以將這一種或多種物理力產(chǎn)生元件制作在芯片或腔體的外部。多芯片系統(tǒng)本發(fā)明的集成式生物芯片系統(tǒng)由多塊芯片構(gòu)成。在這種情況中，多芯片集成式生物芯片系統(tǒng)僅包含至少一塊可以完成至少兩個順序任務(wù)的主動式芯片。
當(dāng)本發(fā)明中的集成生物芯片系統(tǒng)包含多個芯片時，樣品處理過程中至少一項任務(wù)可以在至少一個芯片上執(zhí)行，并且至少另一項不同的任務(wù)可以在另外的至少一個芯片上執(zhí)行。
當(dāng)本發(fā)明的生物芯片系統(tǒng)包括多個芯片時，至少在該系統(tǒng)進行操縱的某一時間段內(nèi)，多個芯片之間有流體交換。在這里，流體交換是指流體可以從一個芯片的表面轉(zhuǎn)移到另一芯片的表面，特別是溶解或懸浮在流體(液體或氣體)中的樣品組分和微?？梢詮囊粋€芯片的表面轉(zhuǎn)移到另一芯片的表面。這種轉(zhuǎn)移可以通過注射、移液等等方式實現(xiàn)。
相互之間有流體交換的芯片應(yīng)該根據(jù)具體的功能按照一定的順序排列，以便“第二個”芯片可以從“第一個”芯片接受經(jīng)過“第一個”芯片分離、轉(zhuǎn)移、捕獲、分析、混合或裂解等操縱的樣品或是樣品組分，以便于“第二個”芯片執(zhí)行后續(xù)的樣品處理或分析。這里，“第一個”和“第二個”并不是這些芯片在集成式系統(tǒng)中的絕對順序，而是一種相對順序，即第二個芯片上進行的處理過程在第一個芯片對樣品處理后進行。因此，第一個和第二個芯片在位置上應(yīng)該按照一定的次序放置，以便于樣品、樣品組分或樣品產(chǎn)物(也可以包括結(jié)合到微粒上的樣品組分)能夠從第一個芯片轉(zhuǎn)移到第二個芯片上。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，推薦的情況是第一個和第二個芯片應(yīng)該相鄰排列或是相互接近。
最好樣品組分從一個芯片轉(zhuǎn)移到另一個芯片，或從一個腔體轉(zhuǎn)移到另一個腔體，不需要人工操縱，而是由流體的運動(例如，利用泵推動)或通過施加一定的物理力來實現(xiàn)。
在多芯片系統(tǒng)中，將樣品組分或微粒從系統(tǒng)中某一芯片轉(zhuǎn)移到另一芯片的物理力可以通過一個或是多個集成在芯片上的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。多芯片系統(tǒng)中的主動式芯片可以通過行波介電電泳或者行波磁致電泳等手段進行芯片間樣品組分的轉(zhuǎn)移?？梢允褂梦⒘ｉ_關(guān)芯片，參見美國專利申請“Apparatus forSwitching and Manipulating Particles and Methods of Use Thereof”(No.09/678,263，2000年10月3日遞交)。微粒開關(guān)芯片也可用以將樣品組分從多芯片系統(tǒng)或者單芯片系統(tǒng)中芯片的某一區(qū)域轉(zhuǎn)運到另一區(qū)域，在這里，芯片的不同區(qū)域上具有可以執(zhí)行不同任務(wù)的不同功能元件。
上文提及的單芯片系統(tǒng)中使用的多力芯片，見美國專利“ApparatusesContaining Multiple Active Force Generating Elements and Uses Thereof”(No.09/679,024，2000年10月4日遞交)，也可以使用在本發(fā)明的多芯片系統(tǒng)中。例如，多力芯片可以通過介電電泳力或磁力對樣品組分進行分離，分離后的樣品組分可以在系統(tǒng)中的其它芯片上繼續(xù)執(zhí)行一個或多個分析任務(wù)。
本發(fā)明的多芯片系統(tǒng)也可以包含一個或多個被動式芯片，這種芯片不需要施加物理力就可實現(xiàn)其功能。這些被動式芯片在本發(fā)明的芯片系統(tǒng)中可被用來進行檢測和分析，例如，但不僅僅限于，親和分析、生化分析、細胞分析、遺傳分析、免疫分析等等。樣品處理和分析的順序的任務(wù)本發(fā)明中的集成式芯片系統(tǒng)有能力執(zhí)行至少兩個樣品處理和分析的順序任務(wù)。順序任務(wù)是為了得到所需的結(jié)果而按照一定的順序執(zhí)行的任務(wù)。當(dāng)兩個任務(wù)順序執(zhí)行時，第二個任務(wù)使用第一個任務(wù)的一個或多個直接或間接的產(chǎn)物。這里，“產(chǎn)物”可以是在第一個步驟中分離的，或是部分純化或富集的樣品組分，也可以是在第一步中經(jīng)過生化試劑處理的樣品組分，經(jīng)過變性或胞解的樣品組分等?！暗谝弧焙汀暗诙敝傅氖羌上到y(tǒng)中任務(wù)的相對順序而不是絕對順序。
本發(fā)明系統(tǒng)中的芯片至少能執(zhí)行的一個功能就是處理任務(wù)。這里，處理任務(wù)是為準(zhǔn)備樣品分析而進行的任何過程，包括，但不僅僅限于分離、轉(zhuǎn)移、聚焦、捕獲、富集、濃縮、純化、結(jié)構(gòu)改變、物理分解、化學(xué)反應(yīng)(包擴酶處理反應(yīng)、親和反應(yīng)等等)。
本發(fā)明的芯片系統(tǒng)至少可以執(zhí)行一種有分析功能的任務(wù)。分析任務(wù)是指任何能給出處理和分析的結(jié)果的過程。分析任務(wù)可以是，但不僅僅限于分析，如生化分析，細胞分析和檢測分析。檢測分析也可以包括親和反應(yīng)和酶促反應(yīng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，系統(tǒng)包含單一的芯片，至少一個處理任務(wù)和一個分析任務(wù)可以在該單一芯片上執(zhí)行。另外的本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，集成生物芯片系統(tǒng)包含多個芯片，其中至少一個處理過程可以在本發(fā)明的至少一個芯片上執(zhí)行，至少一個分析過程可以在本發(fā)明的至少一個芯片上執(zhí)行，但這并不是本發(fā)明所必須的。
當(dāng)本發(fā)明的生物芯片系統(tǒng)包括多個芯片時，至少在該系統(tǒng)進行操縱的某一時間段內(nèi)，多個芯片之間有流體的交換。在這里，流體交換是指流體可以從一個芯片的表面轉(zhuǎn)移到另一芯片的表面，特別是溶解或懸浮在流體(液體或氣體)中的樣品組分和微?？梢詮囊粋€芯片的表面轉(zhuǎn)移到另一芯片的表面。這種轉(zhuǎn)移可以通過注射、移液等等方式實現(xiàn)。
相互之間有流體交換的芯片應(yīng)該根據(jù)具體的功能按照一定的順序排列，以便“第二個”芯片可以從“第一個”芯片接受經(jīng)過“第一個”芯片分離、轉(zhuǎn)移、捕獲、分析、混合或裂解等操縱的樣品或是樣品組分，以便于“第二個”芯片執(zhí)行后續(xù)的樣品處理或分析。這里，“第一個”和“第二個”并不是這些芯片在集成式系統(tǒng)中的絕對順序，而是一種相對順序，即第二個芯片上進行的處理過程在第一個芯片對樣品處理后進行。因此，第一個和第二個芯片在位置上應(yīng)該按照一定的次序放置，以便于樣品、樣品組分或樣品產(chǎn)物(也可以包括結(jié)合到微粒上的樣品組分)能夠從第一個芯片轉(zhuǎn)移到第二個芯片上。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，推薦的情況是第一個和第二個芯片應(yīng)該相鄰排列或是相互接近。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例是一個集成式系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在樣品處理和分析過程中執(zhí)行至少兩個順序任務(wù)，同時樣品在集成系統(tǒng)中保持連續(xù)。也就是說，加到集成芯片系統(tǒng)中的樣品從集成系統(tǒng)開始執(zhí)行第一個順序任務(wù)起，直到最后一個執(zhí)行的順序任務(wù)結(jié)束為止的整個過程可以是連續(xù)的。
最好，樣品和樣品組分在無人工干預(yù)的情況下可以在系統(tǒng)內(nèi)移動并從一個地方運送到其它地方。樣品和樣品組分，或者溶液，緩沖液和試劑，可以在系統(tǒng)內(nèi)移動，這種移動可以是泵(如注射泵或蠕動泵)驅(qū)動的液體流動引起的。在這個例子的優(yōu)選實施例(有一些在圖1-13中給出了示意)中，通過施加一定的物理力，樣品組分可以從芯片的某個區(qū)域轉(zhuǎn)運到另一個區(qū)域，或者從某個芯片或腔體到另外的芯片或腔體。
本發(fā)明的集成式芯片系統(tǒng)應(yīng)該是全自動的，這樣，一系列任務(wù)可以在無人工干預(yù)的情況下進行，例如，將樣品或樣品組分從一個腔體轉(zhuǎn)移至另一個腔體。然而，這樣的一個自動化的系統(tǒng)也需要人工上樣(如移液或注射)，或需要人工將系統(tǒng)處理完畢的樣品組分收集起來(如，從腔室中吸出，或是利用連接導(dǎo)管的試管收集處理后的組分)。本發(fā)明的自動化集成式芯片系統(tǒng)最好為可編程的，但這并不是本發(fā)明所必須的。II.利用集成式芯片系統(tǒng)進行樣品處理和分析的方法本發(fā)明的系統(tǒng)可被用來進行樣品處理或者分析。樣品處理包括樣品組分的分離、樣品組分的轉(zhuǎn)運、樣品組分的捕獲、樣品組分的隔離、樣品組分的聚集、樣品組分至少是部分的純化、樣品組分的濃縮、樣品組分的富集、樣品組分的分解(可以通過使用溶液、試劑或是預(yù)處理，也可以沒有)。樣品分析包括樣品組分的檢測、樣品組分定量分析、樣品組分活性檢測(這里，活性可以是組分的調(diào)節(jié)活性、催化活性、親和結(jié)合活性，也可以是其機制已知或者仍然未知的活性，如細胞毒性，促有絲分裂活性，轉(zhuǎn)錄激活活性等等)。
方法包括將樣品應(yīng)用于本發(fā)明的集成式芯片系統(tǒng)；在該集成式系統(tǒng)中進行至少兩個順序任務(wù)，其中在順序任務(wù)中至少有一個是處理任務(wù)。一個處理任務(wù)包括分離樣品組分、轉(zhuǎn)移樣品組分、捕獲樣品組分、分離樣品組分、至少部分地純化樣品組分、富集樣品組分、濃縮樣品組分、分解樣品組分(通過使用溶液、試劑或是經(jīng)過預(yù)處理，也可以不使用)。處理任務(wù)的例子有，但不僅僅限于血液樣品中的白細胞的分離，從母體血或者母體羊膜液中分離胎兒細胞，從血液中分離惡性細胞，從骨髓樣品中分離干細胞，裂解白細胞(白細胞從血液樣品中分離所到)，從尿樣中富集細菌細胞和從靶細胞裂解液中分離mRNA分子。
方法也包括將樣品組分從芯片的一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另外一個區(qū)域，上述的芯片的不同區(qū)域至少執(zhí)行兩個不同的任務(wù)；或者將樣品組分從一個芯片轉(zhuǎn)移到另外一個芯片，這不同芯片至少執(zhí)行兩個不同的任務(wù)。樣品應(yīng)用樣品可以是任何種類的流體樣品，例如環(huán)境樣品，包括空氣樣品、水樣品、食品樣品；也可以是生物樣品，包括生物樣品的抽提物。樣品可以是至少經(jīng)過部分處理的。例如，樣品可以是經(jīng)過離心的樣品；或者已經(jīng)加入去污劑的樣品；樣品也可以在應(yīng)用本發(fā)明的方法之前已經(jīng)被加熱或者冰凍；樣品中也可以預(yù)先加入了試劑，這些試劑可以是，但不僅僅限于穩(wěn)定劑，包括螯合劑、還原劑、表面活性劑、抗凝血劑、甘油、二甲亞砜(DMSO)等等。樣品可以是儲存過的樣品，包括經(jīng)過低溫保存的樣品或是冰凍過的樣品。生物樣品可以是血液、血清、唾液、尿液、精液、眼淚、鼻、咽喉、生殖器或排泄物的提取物。生物樣品也可以是器官、組織、細胞培養(yǎng)基樣品(包括培養(yǎng)基和細胞株)。首選的樣品是血液樣品。
血液樣品可以是任何種類的血液樣品，從個體新鮮抽提的、從貯存庫中獲得的、從個體外獲得的，如衣物、家具、器械等等。血液樣品可以是通過抽提得到的，例如，把帶有血液的物品浸入特定的緩沖液或是溶液得到。血液樣品可以是處理過的，也可以是未處理過的，或是部分處理過的，處理的方式可以是離心以去除血清、透析、進行流式細胞計數(shù)、加入試劑等等。血液樣品的處理步驟大致包括，但不僅僅限于，buffy coat，通過諸如流式細胞計數(shù)技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)和磁力細胞分選技術(shù)等等對細胞樣品進行分離。血液樣品可以是任意體積，例如不到5微升，或是超過5升，這完全由實驗需要而定。
樣品可以通過任何一種適當(dāng)方式引入集成式芯片系統(tǒng)，例如，通過吸管或者注射的方法將樣品加到芯片上或者是系統(tǒng)的腔體內(nèi)。樣品的加入可以通過管道連接到一個腔體的端口，該腔體包含當(dāng)前發(fā)明的一個系統(tǒng)的一個芯片，可以使用泵，例如注射泵或者蠕動泵，或者通過重力注入。
一種或是多種試劑、緩沖液、溶液等等和樣品混合液可以從一個或幾個端口引入到集成式芯片上。本發(fā)明中的樣品溶液包括可以改變樣品中至少一種組分的介電性質(zhì)的溶液，也可以是可以裂解紅細胞的溶液。關(guān)于這樣的樣品溶液，可以參見美國專利申請“Compositions and Methods for Separationof實體分子on Chips”(No.09/686,737，2000年10月10日遞交)。一種或是多種試劑、緩沖液、溶液等等可以和樣品同時加入反應(yīng)池，或是先于、后于樣品加入反應(yīng)池。也可以在進入反應(yīng)池前，先把樣品和試劑、緩沖液或是溶液先混合起來，這樣的混合過程可以在將流體引入反應(yīng)池的導(dǎo)管中進行，也可以在一個或是多個與導(dǎo)管相連的樣品池中進行。加入的方法可以是任意適宜的方法，例如擴散、使用物理力輸運(包括介電電泳力、電磁力等等)。
本發(fā)明中可以使用的溶液可以參見美國專利申請“Compositions andMethods for Separation of實體分子on Chips”(No.09/686,737)。兩個或是兩個以上的順序任務(wù)最好，至少一個處理任務(wù)(包括，但不限于，分離、轉(zhuǎn)移、捕獲、隔離、純化、濃縮、結(jié)構(gòu)變化、分解等)是通過使用物理力實現(xiàn)的。產(chǎn)生這些物理力的方法和所運用的物理力的種類有關(guān)。例如，聲場力、光輻射力、電磁力、介電電泳力和電泳力可以分別通過在集成在芯片的壓電轉(zhuǎn)換器、光學(xué)單元、珀爾貼(Peltier)元件、金屬線、毛細管、微閥、微泵、電磁單元或者電極上施加電信號來產(chǎn)生。發(fā)明中所用到的物理力可以參見美國專利申請“Methods for Manipulating實體分子in Microfluidic Systems”(No.09/636,104，2000年8月10日遞交)；美國專利申請“Apparatus forSwitching and Manipulating Particles and Methods of Use Thereof”(No.09/678,263，2000年10月3日遞交)；美國專利申請“ApparatusesContaining Multiple Active Force Generating Elements and Uses Thereof”(No.09/679,024，2000年10月4日遞交)；美國專利申請“IndividuallyAddressable Micro-Electromagnetic Unit Array Chips”(No.09/399,299，1999年9月17日遞交)；美國專利申請“Individually Addressable Micro-Electromagnetic Unit Array Chips in Horizontal Configurations”(No.09/685.410，2000年10月10日遞交)。
一塊能產(chǎn)生聲場力和常規(guī)介電力的芯片可以在芯片表面用這兩種力同時作用于實體分子，例如細胞或者微粒。兩種不同類型的物理力可以作用于順序的任務(wù)，這些任務(wù)可以在同一個或者不同的芯片上發(fā)生。這些物理力可以依次或是同時作用在實體分子上。例如，能產(chǎn)生聲場力和常規(guī)介電力的本發(fā)明的系統(tǒng)中的芯片可用于同時作用于兩種實體分子，例如細胞和微粒。在另外一個例子中，一個能同時產(chǎn)生磁力和行波介電電泳力的系統(tǒng)可用于同時作用于兩種實體分子，如磁珠和特定類型的生物細胞。這些功能可以在同一個系統(tǒng)的芯片上或者分立的芯片上實現(xiàn)。磁力僅作用于磁珠，而行波介電電泳力可能僅作用于生物細胞。還有另一個例子中，系統(tǒng)可在不同芯片上依次產(chǎn)生磁力和行波介電電泳力。首先，選通磁力生成元件，這樣和特定實體分子結(jié)合的磁珠就會受到一個特定時間長度的磁力并被捕獲到芯片上。未被捕獲的樣品組分被轉(zhuǎn)移到下一個芯片，在那里行波介電電泳力生成元件被打開，從而作為樣品組分的生物細胞受到行波介電力的作用。
本發(fā)明可以通過控制外部與芯片上產(chǎn)生不同物理力的微結(jié)構(gòu)連接的信號源，以達到控制芯片上產(chǎn)生的物理力的目的。例如，一個或多個信號源能產(chǎn)生一個或多個有一定次序的電信號，作用在一系列電磁單元上，用電極陣列生成電場。這些不同的功能單元可以制作在同一個芯片上，也可以制作在不同的芯片上。多個功能元件可以同時選通，例如，產(chǎn)生聲場力的壓電轉(zhuǎn)換器和產(chǎn)生常規(guī)介電力的電極，這兩種功能元件分布或者重疊在同一塊芯片上，并提供例如同時混合和分離的功能。也可以按照次序加載電信號給同一塊芯片上部分的功能元件，例如在行波磁泳中那樣；或者加載不同相位的電信號給電極的不同部分，例如在行波介電電泳中。這樣，可以通過一個可自動化的和可編程的切換設(shè)備控制的電源控制系統(tǒng)或信號發(fā)生器控制系統(tǒng)來控制加在這些功能元件上的電信號，從而實現(xiàn)控制所產(chǎn)生的物理場的目的。最好，電源控制系統(tǒng)或信號發(fā)生控制系統(tǒng)也允許操縱者控制和調(diào)節(jié)輸出電源或產(chǎn)生的信號的各個參數(shù)。在應(yīng)用電場時，這些參數(shù)包括信號頻率、信號相位、信號幅度和信號調(diào)制模式。
本系統(tǒng)中至少有一個過程是通過芯片的方式操縱樣品組分以進行樣品的處理任務(wù)或分析任務(wù)。待操縱的實體分子可以是細胞、細胞器、病毒、分子、或它們的復(fù)合體。待操縱的實體分子可以是純凈的物質(zhì)，或以混合物的形式存在，在該混合物中靶實體分子僅是混合物的一個組成。例如，白血病病人的血液中癌細胞可以作為待操縱的實體分子。類似地，不同的血液細胞，例如血液中的紅細胞和白細胞，可以作為待操縱的實體分子。
可操縱的細胞，例如，但不僅僅限于，包括動物的、植物的、真菌的、細菌的、重組的或培養(yǎng)的細胞。對動物細胞，源自一特定組織或器官的細胞可被操縱。更適宜地，源自動物內(nèi)部器官的細胞，例如腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰腺、腎、膽囊、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、腺體、內(nèi)血管，等等，可被操縱。進一步，源自任何植物和真菌的細胞，例如酵母、真細菌或古細菌，可被操縱。源自任何真核的或原核的重組細胞，例如動物、植物、真菌或細菌細胞也可被操縱。
可操縱的細胞器包括細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、囊泡、液泡或微體。可操縱的病毒(無論是完整的病毒還是任何病毒結(jié)構(gòu))在其生存周期中可以來自諸如第一類病毒、第二類病毒、第三類病毒、第四類病毒、第五類病毒或第六類病毒。
可操縱的細胞內(nèi)實體分子是指位于胞內(nèi)的實體分子，即位于細胞質(zhì)或細胞器基底中，附著在任何細胞內(nèi)膜上，位于質(zhì)膜(如果存在)上，或是位于細胞表面，即附著在細胞質(zhì)膜或細胞壁(如果存在)的外表面上。任何所需的細胞內(nèi)實體分子都可以從靶細胞中分離出來。例如，細胞器、分子或是它們的聚集體可以被分離出來。這樣的細胞器的例子包括，但不僅僅限于，細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、囊泡、液泡或微體、膜受體、細胞質(zhì)中的抗原、酶和蛋白質(zhì)。
可操縱的分子可以是無機分子如離子，有機分子或它們的復(fù)合體?？刹倏v的離子的例子包括，但不僅僅限于，鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、氯離子、鐵離子、銅離子、鋅離子、錳離子、釩離子、鎳離子、鉻離子、氟離子、硅離子、錫離子、硼離子或砷離子?？刹倏v的有機分子的例子包括，但不僅僅限于，氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類或它們的復(fù)合體。
對于不可以直接使用物理力操縱的實體分子，如果自身可以直接用合適的物理力操縱的結(jié)合物可以與實體分子結(jié)合，這樣類型的實體分子的操縱可以通過操縱結(jié)合物-實體分子復(fù)合體來實現(xiàn)。任何能以一定親和力和特異性與實體分子結(jié)合而且能被適當(dāng)?shù)奈锢碜饔昧Σ倏v的結(jié)合體都可以在本方法中使用。結(jié)合物可以是細胞如動物、植物、真菌或細菌細胞；細胞器如細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、囊泡、液泡或微體；病毒、微?；蛘咚鼈兊木酆衔锘驈?fù)合體。在C部分描述的細胞、細胞器和病毒亦可被用作結(jié)合體。
本方法中使用的微粒的尺寸在大約0.01微米至10厘米之間。最好，本方法中使用的微粒尺寸在大約0.01微米至至幾千個微米之間。使用的微?？梢允?，但不僅僅限于，塑料微粒、聚苯乙烯微粒、玻璃珠體、磁珠、中空玻璃球、金屬微粒或具有復(fù)雜的成分或各種微加工出來的結(jié)微細構(gòu)的微粒等等。
被操縱的實體分子可以用任何已知的方法與結(jié)合物的表面結(jié)合。例如，實體分子可以直接或通過一個連接臂(最好是一個可切割的連接臂)與結(jié)合物的表面結(jié)合。實體分子也可以通過一個共價鍵或非共價鍵與結(jié)合物的表面結(jié)合。另外，實體分子也可以通過特異性或非特異性結(jié)合與結(jié)合物的表面結(jié)合。最好，實體分子與結(jié)合物之間的連接臂是可切割的連接臂，例如可以用化學(xué)、物理或酶處理的方法切割連接臂。同樣，可以使用在美國專利申請“METHODS FOR MANIPULATING MOIETIES IN MICROFLUIDICSYSTEMS”(No.09/636,104；2000年8月10日遞交)的中的關(guān)于耦聯(lián)及解耦聯(lián)實體分子與結(jié)合物的方法。最好被操縱的實體分子基本上結(jié)合在結(jié)合物的表面。更好的是，被操縱的實體分子完全結(jié)合在結(jié)合物的表面。
最好，通過使用美國專利申請“METHODS FOR MANIPULATINGMOIETIES IN MICROFLUIDIC SYSTEMS”(No.09/636,104，2000年8月10日遞交)中的結(jié)合物操縱實體分子的方法可以用于不能直接使用物理力操縱的實體分子的操縱。
被操縱的實體分子可以是液態(tài)或氣態(tài)的，也可以是處于液態(tài)或氣態(tài)介質(zhì)中，或是二者的結(jié)合。最好實體分子是在液態(tài)介質(zhì)中被操縱。液態(tài)介質(zhì)可以是懸浮液、溶液或是二者的結(jié)合。
現(xiàn)有的方法可以一次操縱一種實體分子，也可以同時操縱多種實體分子。在某些情況下，待操縱實體分子是包含在某一混合物中的，并且該實體分子被選擇性地操縱。選擇性操縱是指這樣的操縱過程由于被操縱的實體分子與混合物中的其它實體分子、微粒和分子相比，受到不同的物理力的操縱，從而使得該實體分子被選擇性地處理，和/或從混合物中分離。在另外的情況中，待操縱實體分子組成混合物，并且整個混合物被操縱。待操縱實體分子可以是可被各種物理力直接作用的，也可以無法被物理力直接作用，但是可以和可被操縱的結(jié)合物結(jié)合的。在特定情況中，待操縱實體分子是細胞、細胞器、病毒、分子，或其復(fù)合物。
本方法可以使用任何類型的操縱。例如，但不僅僅限于，輸運、聚焦、富集、濃縮、聚集、捕獲、推斥、懸浮、分離、分餾、分部或是使實體分子作直線或是其它形式的運動。
最好芯片上所作的第一個任務(wù)是在樣品處理中的分離、轉(zhuǎn)移、捕獲、混合、或分裂等步驟，但是這并不是本發(fā)明必須的。在包含細胞的樣品的處理過程中，可以把感興趣的細胞可從其它細胞中分離出來，例如，通過常規(guī)介電電泳力；也可以從溶解的其他類型細胞的細胞碎片中轉(zhuǎn)移出來，例如，通過行波介電電泳；也可以通過捕獲的方式，例如，通過結(jié)合到電磁單元上(磁性微粒制劑已經(jīng)加入到樣品中)；也可以通過混合，例如，加入特異的結(jié)合物，利用聲學(xué)元件；也可以進行裂解或是破胞，例如，使用電脈沖裂解細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，至少兩個連續(xù)的分析任務(wù)可作用于不同類型的樣品組分，例如，第一步分離任務(wù)可作用于細胞，而第二步分離任務(wù)可作用于蛋白質(zhì)，或者第一步分離任務(wù)可作用于蛋白質(zhì)，而第二步分離任務(wù)可作用于RNA分子。分析任務(wù)在本發(fā)明的系統(tǒng)中，至少一個樣品分析任務(wù)發(fā)生于至少一個處理任務(wù)之后。本發(fā)明系統(tǒng)的芯片上進行的分析任務(wù)可以使用混合或結(jié)合的步驟，還包括檢測分析，生化分析，細胞分析，結(jié)合分析或遺傳分析。一個或多個分析任務(wù)可并行進行。例如，蛋白質(zhì)的檢測分析和RNA分子的檢測分析可以同時進行，在某些情況下在同一塊芯片上進行(參見，例如，圖15E)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，首選的檢測方法包括將一種樣品組分結(jié)合到特異的結(jié)合物上，例如，一連接到芯片表面的核酸分子或是抗體。待檢測的樣品組分可以通過連接在微粒上而被物理力所操縱，且在進行檢測之前，把待檢測樣品組分從結(jié)合物上解離下來?？梢杂糜诒景l(fā)明的可以把實體分子和微?？赡娼Y(jié)合的偶聯(lián)物質(zhì)可以參見美國專利申請“Methods forManipulating Moieties in Microfluidic Systems”(No.09/636,104，2000年8月10日遞交)。結(jié)合到連接在芯片表面的特異結(jié)合物的樣品組分可通過幾種途徑檢測到。該樣品組分可以在結(jié)合之前先進行標(biāo)記；也可以使用夾心法，即使用帶有可檢測標(biāo)記的第三種分子(抗體或是寡核苷酸)。也可使用其它的檢測方法，例如使用可以把可檢測標(biāo)記加入樣品組分的酶促反應(yīng)(例如，通過PCR的方法摻入標(biāo)記物)?？梢詤⒁娒绹鴮＠暾垺癕ethods andCompositions for Identifying Nucleic Acid Molecules Using NucleolyticActivities and Hybridization”(No.09/648,081，2000年8月25日遞交)。這些檢測方法中用到的可檢測標(biāo)記可以是熒光物質(zhì)，也是可被分光光度法檢測到的。在這種情況下，裝入檢測芯片的腔體應(yīng)該具有一個透明的蓋子，例如玻璃蓋子，以便于檢測。
也可以使用其它的檢測方法。例如，待檢測的實體分子可以先與磁珠結(jié)合，芯片的表面制作有可以感應(yīng)磁珠磁信號的磁力檢測裝置，這樣，當(dāng)待檢測實體分子結(jié)合在芯片的表面時，就會把磁珠也帶到芯片表面的特異的位置，從而得以檢測。另外，也可以使用可以感受重力變化的懸臂梁裝置進行檢測。微粒的重力可以通過懸臂梁傳感，并且信號可以傳輸?shù)斤@示或者紀(jì)錄設(shè)備。
還可以檢測熒光信號。樣品組分從系統(tǒng)的至少一個芯片轉(zhuǎn)移到另外的至少一個芯片樣品組分，包括連接到微粒等特異連接物上的樣品組分，可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞剑瑥南到y(tǒng)中的至少一塊芯片轉(zhuǎn)移到另外一塊芯片，包括液體輸運(通過機械力，例如通過注射泵或蠕動泵，或?qū)α髁?。但是更適宜地是，從本發(fā)明的系統(tǒng)中的至少一個芯片到另外一個芯片的樣品組分的傳輸(包括已連接在微粒上的樣品組分)是通過物理力的作用實現(xiàn)的，例如，但不限于，電泳力、介電電泳力(包括常規(guī)介電電泳力和行波介電電泳力)或電磁力。尤其首選的樣品組分從芯片一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個區(qū)域的轉(zhuǎn)移方法是行波介電電泳和行波磁泳。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中連接到微粒上的樣品組分，是利用行波介電電泳或行波磁泳的方法來實現(xiàn)從一個芯片到另一個芯片的轉(zhuǎn)移的。
本發(fā)明可以通過控制外部與芯片上產(chǎn)生不同物理力的微結(jié)構(gòu)連接的信號源，以達到控制芯片上產(chǎn)生的物理力的目的。在一些應(yīng)用中，需要按照一定的次序?qū)㈦娫葱盘柤虞d在同一芯片上的功能元件的一部分以形成行波磁泳，或者將不同相位的電信號加載在電極的一部分上以形成行波介電電泳。這樣，可以通過一個可自動化的和可編程的切換設(shè)備控制的電源控制系統(tǒng)或信號發(fā)生器控制系統(tǒng)來控制加在這些功能元件上的電信號，從而實現(xiàn)控制所產(chǎn)生的物理場的目的。最好，電源控制系統(tǒng)或信號發(fā)生控制系統(tǒng)也允許操縱者控制和調(diào)節(jié)輸出電源或產(chǎn)生的信號的各個參數(shù)。在應(yīng)用電場時，這些參數(shù)包括信號頻率、信號相位、信號幅度和信號調(diào)制模式。
樣品組分和微粒從本發(fā)明的系統(tǒng)的一個芯片到另一個芯片的轉(zhuǎn)移可以通過包含芯片的腔體上的端口，也可以通過導(dǎo)管，但這并不是本發(fā)明所必須的。樣品組分和微粒從本發(fā)明的系統(tǒng)的芯片的一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個區(qū)域，或是從一個芯片到另一個芯片的轉(zhuǎn)移可以通過液體流動實現(xiàn)，包括流體和電泳，但最好，樣品和微粒是通過物理力的作用進行轉(zhuǎn)移的，包括常規(guī)介電電泳力或行波介電電泳力或電磁力，包括磁泳。物理力的產(chǎn)生裝置至少有一個是集成在芯片上或是系統(tǒng)的腔體中的。樣品組分，包括連接到微粒上的樣品組分，是按照一定的順序從本發(fā)明的系統(tǒng)的一個芯片轉(zhuǎn)移到另一個芯片上的，因此處理和分析樣品的處理過程是按照產(chǎn)生預(yù)期最終結(jié)果的順序進行的。例如，一個特殊類型的細胞樣品組分可以在第一個芯片中被分離，然后轉(zhuǎn)移到第二個芯片，在那里它們被溶解釋放出細胞內(nèi)的實體分子形式的樣品組分，并且該樣品組分和一種含有特異結(jié)合物例如微粒的試劑混合。然后連接到微粒上的樣品組分被轉(zhuǎn)移，例如利用行波介電電泳的方式，到第三個芯片，在那里，進行檢測分析。
樣品組分，包括連接到微粒上的樣品組分，也可以從本發(fā)明的系統(tǒng)的一個芯片轉(zhuǎn)移到另一個芯片，因此處理和分析樣品的串行過程也可以并行進行。樣品組分可以同時或者按照一定的順序轉(zhuǎn)移到多個芯片上。最好，不同的樣品組分轉(zhuǎn)移到不同的芯片上，但是這并不是必須的。例如，一個蛋白質(zhì)樣品組分可以轉(zhuǎn)移到一個芯片上，一個核酸樣品組分可以轉(zhuǎn)移到第二個芯片上，而一個甾類激素樣品可以轉(zhuǎn)移到第三塊芯片上。也可以是樣品組分引入同一塊芯片，例如RNA和蛋白質(zhì)樣品組分可以引入到同一個檢測芯片上。在優(yōu)選實施例中，不同的樣品組分轉(zhuǎn)移到不同芯片或芯片的不同區(qū)域可以通過將不同的樣品組分連接到具有不同特性的微粒上來實現(xiàn)，例如微粒分別帶有不同的介電特性。在這種方法中，微粒對作用在芯片上的不同的物理力進行響應(yīng)，并會被導(dǎo)向到不同的方向，例如，引導(dǎo)不同的樣品通過不同的接口進入不同的腔體，或引導(dǎo)微粒進入同一個芯片的不同區(qū)域。
可以將樣品組分分別轉(zhuǎn)移到不同的芯片上的首選的芯片是微粒轉(zhuǎn)換芯片，可以參見美國專利“Apparatus for Switching and Manipulating Particlesand Methods of Use Thereof”(No.09/678,263，2000年10月3日)。微粒轉(zhuǎn)換芯片使用行波電泳、常規(guī)介電電泳或是行波介電電泳來轉(zhuǎn)移微粒。通過對微粒開關(guān)使用不同的電信號，響應(yīng)不同場頻的微粒可以被引導(dǎo)到不同的位置，并通過不同的路徑遷移。
在本發(fā)明的方法中，至少兩個任務(wù)是順序進行的。這意味著至少有一個任務(wù)所用的樣品組分是其前一個任務(wù)的結(jié)果或是產(chǎn)物。集成式生物芯片系統(tǒng)用于處理和分析樣品是源自“從樣品到結(jié)果”的設(shè)計思想。
盡管本發(fā)明的系統(tǒng)要求至少有兩個任務(wù)是按照順序進行的，但是本發(fā)明并不要求所有的任務(wù)都必須按一個連續(xù)的順序進行。例如，在一些實施例中可以并行地進行特定的分析步驟，其中一個分析過程是用于檢測一種類型的樣品組分(例如，RNA)，而另一個分析任務(wù)是用于檢測另一個類型的樣品組分(例如，蛋白質(zhì))。
系統(tǒng)的操縱以圖中所示的為例，在這里，圖僅僅起說明解釋的作用，并不意味著本發(fā)明僅僅包括圖中所畫的內(nèi)容。
圖1是包含了本發(fā)明的系統(tǒng)所使用的一個多力芯片的腔體。圖中的DEP電極可以使用其它不同尺寸的電極代替，例如“Dielectrophoreticmanipulation of cells using spiral electrodes by Wang et al.，Biophys.J.，Vol.72，pages1887-1899(1997)”中的螺旋形電極陣列可以代替圖1B中所示的矩形陣列電極。圖1B-1E的所有的功能元件(壓電轉(zhuǎn)換器、DEP電極、電磁元件、微粒切換元件等)都需要電路連接到外部信號源。為了清楚起見，電路連接未在圖中顯示。連接的細節(jié)可以參見美國專利申請No.09/399,299(1999年9月17日遞交)；美國專利申請“Individually AddressableMicro-Electromagnetic Unit Array Chips in Horizontal Configurations”(No.09/685,410，2000年10月10日遞交)；美國專利申請“Apparatus forSwitching and Manipulating Particles and Methods of Use Thereof”(No.09/678,263，2000年10月3日遞交)和美國專利申請“ApparatusesContaining Multiple Active Force Generating Elements and Uses Thereof”(No.09/679,024，2000年10月4日遞交)。
圖2A和B是一種樣品，例如血液樣品，其中加入了修飾了特異結(jié)合物的微粒，通過腔體的端口用泵輸送到芯片上。
圖3顯示芯片包含的聲學(xué)元件，通過聲場力混合樣品。聲場力是通過在聲學(xué)層的聲學(xué)元件上加載交流信號產(chǎn)生的。在交流信號的作用下，聲學(xué)元件由于壓電效應(yīng)而產(chǎn)生機械振動。這種機械振動的頻率與所加的電信號的頻率相同，并傳到腔體中，在腔體中產(chǎn)生聲波或聲場。產(chǎn)生的聲場或聲波對腔體中的細胞和珠體產(chǎn)生力的作用，并同時作用于腔體中的懸浮介質(zhì)，導(dǎo)致聲場引發(fā)的混合。如果在本發(fā)明的系統(tǒng)中使用包被了結(jié)合物的順磁性微粒，聲場力能顯著提高微粒和樣品組分結(jié)合的效率(圖4)。
當(dāng)和樣品中特異的組分結(jié)合之后，順磁性微粒可用于分離。微粒可以是包被了特異識別某種類型細胞的抗體的順磁性微粒，本發(fā)明中所使用的多力芯片中應(yīng)包含電磁單元。選通的電磁元件可用于收集和捕獲磁珠-細胞復(fù)合體，同時其他類型的細胞和樣品組分被清洗出腔體(圖5A和5B，和5C)。然后可以將所需的實體分子從微粒上解離下來(圖6)，例如通過化學(xué)方法切割連接臂。隨后，可以使用介電電泳的方法，將所需的實體分子和微粒分離(圖7A和7B)。例如，可以把和靶細胞的介電性質(zhì)不同的磁性微粒，通過液體流動的方式從腔體中清洗出去。介電電泳力可以通過用給電極陣列施加電信號，產(chǎn)生非均勻電場得到。使得實體分子可以滯留在芯片的表面，而微粒不能滯留在芯片的表面。
其他溶液、懸浮液或試劑可被加入到含有介電電泳滯留的實體分子的腔體中。例如，含不同類型微粒的懸浮液加入到圖8中的腔體中。不同的微粒上包被有不同的結(jié)合物，可以與不同的實體分子結(jié)合。例如，一種微粒的表面包被了可以和一種特定類型蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，而另一種微粒的表面包被了可以和一種例如類固醇分子的小分子結(jié)合的抗體，再另一種微粒表面包被了可以和mRNA分子的Poly-A端結(jié)合的寡核苷酸鏈，而再另外一種微粒的表面包被了可以和一種核酸實體分子序列互補的單鏈DNA分子等等。可以將實體分子分解以釋放組分，與其它加入的試劑相互作用，加入的試劑可以是含有一種或多種微粒的制劑。例如，可以將細胞破胞以使細胞內(nèi)部的實體分子釋放到介質(zhì)中，與含有微粒的制劑作用(圖9A和B)。細胞的胞解可以通過加入低滲溶液實現(xiàn)，也可以加入含有去污劑或其他裂解試劑的溶液而實現(xiàn)。還可以使用機械力(例如攪拌)、電脈沖或聲場力來促使細胞的胞解。
聲場力的應(yīng)用可以用來高效率地混合分解后的實體分子(例如，裂解了的細胞的所釋放出的組分)及含有不同類型微粒的制劑(圖10)。它提高了樣品組分和微粒的結(jié)合效率(圖11)。在這里，從溶解的靶細胞得到的mRNA結(jié)合到類型1珠體上，溶解靶細胞得到的靶蛋白結(jié)合到類型2珠體上，溶解靶細胞得到的DNA結(jié)合到類型3珠體上，而溶解靶細胞得到的目標(biāo)小分子結(jié)合到類型4珠體上。
在這個例子中，不同類型的微粒在外加電場下(示于圖12A和B)呈正向介電電泳。結(jié)合了感興趣的實體分子的不同類型的微粒，在正向介電電泳的作用下，集中在芯片的中心區(qū)域(圖12B)。在這種情況中，在腔體中的DEP電極上施加不同相位的信號，以產(chǎn)生行波電場，電場的方向可以朝向電極陣列的中心或者朝向電極陣列的邊緣。為產(chǎn)生行波電場，電極按組分開，每一組加載同相位的交流信號，并且每一組的電極和其他組的電極(加載不同相位的信號)間隔分布。至少需要三組電極，且加載三種不同相位的信號來產(chǎn)生行波電場。在一個例子中，每5個矩形電極(從最里面的那個開始數(shù))接在一起以形成4組電極例如，第一組電極1、5、9；第二組電極2、6、10；第三組電極3、7、11；以及第四組電極4、8、12。這四組電極加載同頻率但相位分別為0、90、180和270度，或0、-90、-180、-270度的交流信號。這種電極配置需要多層結(jié)構(gòu)。也可以采用“Dielectrophoreticmanipulation of cells using spiral electrodes by Wang et al.，Biophys.J.，Vol.72，pages1887-1899(1997)”中的螺旋形電極。
滯留在芯片上的一個或多個區(qū)域的微?？梢栽谖⒘ｉ_關(guān)芯片上得以分離，參見美國專利申請“Apparatus for Switching and Manipulating Particlesand Methods of Use Thereof”(No.09/678,263，2000年10月3日遞交)。微粒，包括結(jié)合有感興趣的實體分子的微粒，可利用行波介電電泳轉(zhuǎn)移到微粒切換芯片上(圖13A，B和C)。在分支點上，非均勻電場和行波場可以引導(dǎo)一種微粒到一個方向，引導(dǎo)另一種微粒到另一個方向。當(dāng)在微粒開關(guān)上施加適當(dāng)?shù)碾娦盘柡?，這種引導(dǎo)不同微粒向不同的方向運動是可能同時發(fā)生的。首先，加載一組特定的信號以在微粒開關(guān)上移動一種(“第一種”)微粒到一個方向，同時另外一種微粒保持不動或者基本上不動。當(dāng)“第一種”微粒到達微粒開關(guān)中指定的位置之后，另外一組信號被加載，以把另一種微粒移到微粒開關(guān)的另一個方向。微?？杀灰龑?dǎo)通過包含微粒轉(zhuǎn)換芯片的腔體的不同端口到達不同的芯片作下一步分離、分析、或檢測，或引導(dǎo)到同一芯片的不同區(qū)域以進行后續(xù)的分離、分析、或檢測。
圖14A，B，和C中使用了包被了核酸分子的磁性微粒，芯片上的一個區(qū)域制作了寡核苷酸陣列，信號檢測是通過檢測結(jié)合在該區(qū)域的磁性微粒的電磁信號實現(xiàn)的。加入的微粒表面包被了可以與被測樣品中存在的或是可能存在的核酸分子結(jié)合的核酸探針，這樣樣品中互補的核酸就會和磁性微粒雜交。與磁性微粒上探針發(fā)生雜交的核酸在雜交后，仍然具有一部分未結(jié)合的單鏈，可以與預(yù)先固定在芯片表面的核酸陣列雜交。先將沒有磁性微粒結(jié)合的樣品中的核酸去除，例如，通過電磁方式捕獲磁性微粒，再清洗腔體洗去未與磁性微粒結(jié)合的核酸。由于磁性微粒上的核酸復(fù)合物可以和陣列上的寡核苷酸鏈雜交，這樣磁性微粒就結(jié)合在陣列的一個特定位置上。芯片上該位置的磁性微粒的存在，可以通過例如特定的磁場傳感器或者懸臂型壓力檢測器來測定。例如，可以使用“A biosensor based on magnetoresistancetechnology”，in Biosens.Bioelectron.Vol13，pages731-739，1998，byBaselet et al中的傳感技術(shù)來探測磁性微粒的存在。
也可以通過在核酸分子或者蛋白質(zhì)修飾熒光分子的方法來進行檢測(圖15A-D)。在這種情況中，結(jié)合到感興趣的實體分子上的微?？梢杂贸Ｒ?guī)介電電泳或行波介電電泳轉(zhuǎn)移到包含特異結(jié)合物(例如，單鏈核酸分子和抗體)的芯片上。結(jié)合到微粒上的感興趣的實體分子(例如，感興趣的蛋白質(zhì)或感興趣的RNA)可以在微粒的介電電泳轉(zhuǎn)移前或電泳過程中從微粒上解離下來。感興趣的實體分子的解離，使得這些實體分子可以特異的結(jié)合到芯片上的結(jié)合物上?？梢杂萌芤呵逑辞惑w以去除未結(jié)合的實體分子。隨后，可以進行夾心式雜交反應(yīng)，這個過程中熒光分子結(jié)合到感興趣的實體分子上。這樣，熒光分子就可以結(jié)合到芯片的特定的區(qū)域上，并且可以被任何一種標(biāo)準(zhǔn)的熒光檢測方法檢測到。
檢測可以在感興趣的實體分子通過一個管道或端口時用檢測熒光信號的方法進行。例如，已經(jīng)從其它實體分子和樣品組分中用微粒通過介電電泳的方法分離出來的類固醇，可以被轉(zhuǎn)移并集中在芯片的一個通道中(圖16A，B)。然后，把感興趣的實體分子從微粒上分離下來，對感興趣的實體分子進行標(biāo)記，例如用熒光標(biāo)記，然后使用流體等方式引導(dǎo)實體分子通過通道(圖16C，D和E)，使用光學(xué)手段進行檢測。
在圖14A-14F和15A-F中描述的例子中，行波介電電泳(TW-DEP)的電極上施加了電信號，以使得結(jié)合了感興趣分子的微粒移動并分散到腔體中。在這個情況中，應(yīng)用了行波介電電泳力。TW-DEP電極上施加了不同相位的信號，從而產(chǎn)生行波電場，通過行波介電電泳力來移動和分散微粒。為了產(chǎn)生行波電場，電極分成幾組，每組施加同相位的交流信號，并且每一組的電極和其他組的電極(加載不同相位的信號)間隔分布。至少需要三組電極，且其加載三種不同相位的信號來產(chǎn)生行波電場。在一個例子中，每四個半圓的電極(在圖14B和15B中從最里面的那個開始數(shù))被接在一起形成三組電極例如，第一組電極1、4、7；第二組電極2、5、8；第三組電極3、6、9。三個平行電極也可以接到上面提到的三組電極中。三組電極可加載同頻率但相位分別為0、120、240度或0、-120、-240度的交流信號。這種電極配置需要多層結(jié)構(gòu)。
圖17是一個單芯片集成生物芯片系統(tǒng)，其中芯片是腔體的一部分，腔體的蓋子有一個入口用于樣品和其他試劑的加入，出口用于廢液的流出。芯片的三個分離的區(qū)域分別用于樣品處理(區(qū)域A和區(qū)域B)和分析(區(qū)域C)，并且每一個芯片區(qū)域也包含不同的功能區(qū)域或功能層。
圖18是一個單芯片集成生物芯片系統(tǒng)，其中的多力芯片是腔體的一部分，腔體的蓋子上有用于樣品和其他試劑加入的入口，以及用于廢液流出的出口。芯片包含一個微粒開關(guān)，它能引導(dǎo)樣品組分進入不同的芯片區(qū)域以進行后續(xù)的處理和分析任務(wù)。
圖18中單芯片系統(tǒng)的一個例子中，包含靶細胞和非靶細胞的流體樣品被引入腔體A。靶細胞在腔體A中與非靶細胞分離，再通過液體流動除去非靶細胞之后，靶細胞被裂解并釋放出細胞內(nèi)組分。然后兩種類型的微粒被放入腔體A中一種微粒結(jié)合mRNA而另一種微粒結(jié)合靶蛋白質(zhì)分子。腔體A中進行靶細胞的分離和分解以得到細胞內(nèi)實體分子的過程類似于圖1-13中圖解的方法。
通過使用芯片上的微粒開關(guān)，結(jié)合了mRNA分子的微粒被引導(dǎo)進入腔體B1，而結(jié)合了靶蛋白質(zhì)分子的微粒則被引導(dǎo)進入腔體B2(圖18)。這樣，mRNA分子和蛋白質(zhì)分子從其它細胞內(nèi)組分中分離出來，并進入兩個不同的腔體。微粒上的mRNA分子和蛋白質(zhì)分子隨后被引入到腔體B1和B2中，用熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。被標(biāo)記的mRNA分子和蛋白質(zhì)分子可以從微粒表面解離下來，然后再通過液體流動的方式分別運輸?shù)角惑wC1和C2中。
在腔體C1的上表面已經(jīng)預(yù)先固定了核酸探針，它可以和靶mRNA分子結(jié)合，在控制的嚴(yán)格條件下，結(jié)合探針和靶mRNA分子之間可以發(fā)生雜交。類似的，腔體C2的上表面已經(jīng)預(yù)先固定了抗體，在嚴(yán)格控制的條件下，靶蛋白質(zhì)和抗體可以特異的結(jié)合。嚴(yán)謹型的控制可以通過流經(jīng)腔體的結(jié)合緩沖液和清洗緩沖液，或者雜交液的成分來實現(xiàn)。在清洗后，芯片上熒光信號的強度，給出了關(guān)于原始樣品的靶細胞中mRNA分子和蛋白質(zhì)分子的定量信息。
例子使用集成式芯片系統(tǒng)分離血液樣品中的白細胞，并進行RNA的分離多力芯片尺寸為1cm見方的多力芯片制作在硅片上。該芯片有兩層，如圖19A中所示上層具有互相交錯的微電極，下層具有微加工制作的電磁線圈。微電極用鉻(厚度為100埃)作為種子層，0.2微米厚的金膜作為頂層并具有50微米的寬度和50微米的間隔。包含一個磁芯的電磁單元的尺寸是50微米(寬)乘200微米(長)乘5-10微米(厚)。(在芯片上制作這些電磁單元的具體制造過程的詳細描述參見美國專利申請“Individually AddressableMicro-Electromagnetic Unlt Array Chips in Horizontal Configurations”(No.09/685,410，2000年10月10日遞交)。微電極和電磁元件間的絕緣是通過沉積絕緣薄膜(例如二氧化硅，5到20微米厚)實現(xiàn)的。
多力芯片周圍構(gòu)建了一個腔體。在這個情況中，一個模鑄的塑料矩形圍欄(有四條邊但沒有頂和底)用膠粘在芯片上作為腔體的壁。腔體壁具有大概600微米的厚度。然后一片薄玻璃被粘在塑料圍欄的頂邊上構(gòu)成腔體的頂部。腔體的兩個相對的壁上鉆了兩個開口，直徑為1/16英寸的聚四氟乙烯管道被粘在塑料腔體的開口上，一條作為“流入管道”而另一條作為“流出管道”。樣品通過連接到腔體的一條管道(“流入管道”)進入腔體，而通過另外一條連接到腔體另一邊的管道(“流出管道”)流出腔體。從血液樣品中對白細胞進行介電電泳分離10微升外周血與2％的低滲蔗糖溶液以1∶19的比例混合。通過注射器將200微升稀釋后的血液樣品加入腔體。在加入血液樣品之前，腔體中預(yù)先充滿了等滲的蔗糖溶液(8.5％的蔗糖，0.3％葡萄糖)。當(dāng)加入血液樣品后，在腔體的電極上施加峰峰值為5伏，頻率介于1-6MHz之間的電信號。在這樣的電場下，白細胞受到正向介電電泳力，吸附在微電極的周圍(見圖19B)。
為了優(yōu)化白細胞的收集，應(yīng)該調(diào)節(jié)腔體中液體的流速。過高的流速會減少收集的白細胞的數(shù)量。不同的流速下，白細胞的收集率不盡相同。通常流速介于0.5ml/h至2ml/h之間。對腔體持續(xù)通幾分鐘(約5分鐘)的血液樣品，直至腔體不再收集白細胞，這時，腔體已經(jīng)通過介電電泳收集了足夠的白細胞(圖19C)。圖19C顯示了在多力芯片上使用介電電泳完成處理任務(wù)，例如從稀釋的血液樣品中收集/分離白細胞。
當(dāng)白細胞被收集到芯片表面之后，在微電極上施加電信號(例如頻率1-6MHz，峰峰值小于5V)，再加入裂解液(圖19D)。裂解液(100mM Tris-HCl，pH7.5；500mM LiCl，10mM EDTA；1％LiDS and 5mM DTT)中含有直徑2.8微米，表面包被了Oligo(dT)25的磁珠(Dynal)。加入的液體應(yīng)和腔體的容積大約接近，然后停止注入液體。現(xiàn)在，樣品(細胞裂解液)與含有磁珠的裂解液/結(jié)合液溫育5-10分鐘以使得白細胞中釋放出的mRNA和磁珠表面的Oligo(dT)25雜交。通過電磁捕獲的方式分離mRNA在下層的電磁單元上施加100-200mA的直流電，這樣，這些電磁單元的周圍就產(chǎn)生了非均勻的磁場，這樣磁珠就會被收集在電磁線圈的兩極(圖19E)(磁場最強的區(qū)域)。施加直流電1-3分鐘使得磁珠被充分收集，再加入清洗緩沖液A(10mM Tris-HCl，pH7.5；0.17M LiCl，1mM EDTA，0.1％LiDS)洗去未結(jié)合的分子(例如DNA、蛋白質(zhì)或是其它生物分子)。
再使用清洗緩沖液A洗去未結(jié)合的分子(例如DNA、蛋白質(zhì)或是其它生物分子)后，再加入清洗緩沖液B(10mM Tris-HCl，pH7.5；0.17M LiCl，1mM EDTA)洗滌磁珠。加入清洗的清洗緩沖液的體積大約為100微升，流速為3ml/h。這種流速下，結(jié)合在兩極的磁珠不會被沖洗下來。
清洗完畢后，撤去施加在微電磁單元上的電信號，這樣，磁珠就不再被吸附在兩極。然后通入緩沖液沖出磁珠，收集在離心管中。分離的mRNA的PCR分析將收集的磁珠進行反轉(zhuǎn)錄以得到cDNA分子。得到的cDNA分子進一步通過PCR進行擴增。使用可以和管家基因G3PDH雜交的引物。PCR反應(yīng)液的成分為0.2μM引物，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，10mM Tris-HCl(pH＝8.3)，50mM KCl and 0.001％gelatin。PCR程序為94℃(30秒)，60℃(60秒)，72℃(60秒)，30個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖膠進行電泳，使用溴化乙錠進行染色檢測(見圖19F)。
右側(cè)泳道中的條帶的大小與G3PDH基因(3-磷酸葡萄糖脫氫酶基因)一致，顯示對應(yīng)的磁珠上捕獲了對應(yīng)于G3PDH基因的mRNA分子。而中間泳道是陰性對照，所使用的磁珠上沒有包被oligo-(dT)25分子(圖19F)。
權(quán)利要求
1.一種用于樣品制備和分析的集成式生物芯片系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以進行兩個或是兩個以上的順序的任務(wù)，任務(wù)中至少有一個是處理的任務(wù)，該系統(tǒng)至少包含一塊芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，包括至少一個腔體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中所述的至少一塊芯片是主動式芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中樣品組分可以從芯片的至少一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到至少另一個區(qū)域，是通過除了流體推動、電泳或是電滲以外的機制實現(xiàn)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中樣品組分可以從芯片的至少一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到至少另一個區(qū)域，是通過行波介電電泳或是行波磁泳實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中加入的樣品在進行兩個或是兩個以上的順序任務(wù)時，從開始到結(jié)束的整個過程，都是連續(xù)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中的集成式生物芯片系統(tǒng)是自動化的。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中的至少一塊芯片是多力芯片。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，包括兩塊或是兩塊以上芯片，該集成式生物芯片系統(tǒng)可以使用至少兩塊這樣的芯片進行兩個或是兩個以上的順序任務(wù)而且至少一個這樣的順序任務(wù)是處理任務(wù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，包括至少一個腔體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中至少兩塊芯片是主動式芯片。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中至少一塊主動式芯片是微粒開關(guān)芯片。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中一種或是多種樣品組分可以從芯片的至少一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到至少另一個區(qū)域，是通過除了流體推動、電泳或是電滲以外的機制實現(xiàn)的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中樣品組分可以從芯片的至少一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到至少另一個區(qū)域，是通過行波介電電泳或是行波磁泳實現(xiàn)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中至少一塊主動式芯片是多力芯片。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中至少兩塊芯片，至少在集成式生物芯片系統(tǒng)操作過程的部分時間內(nèi)，相互之間有液體的交換。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中一種或是多種樣品組分可以從至少一塊芯片轉(zhuǎn)移到至少另一塊芯片上，是通過除了流體推動、電泳或是電滲以外的機制實現(xiàn)的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的集成式生物芯片系統(tǒng)，其中一種或是多種樣品組分可以從至少一塊芯片轉(zhuǎn)移到至少另一塊芯片上，是通過行波介電電泳或是行波磁泳實現(xiàn)的。
19.一種使用權(quán)利要求5所述的集成式生物芯片系統(tǒng)的方法，包括以下的步驟a)在集成式生物芯片系統(tǒng)中加入樣品；b)在上述集成式生物芯片系統(tǒng)中進行兩個或是兩個以上的順序任務(wù)，其中至少一個順序任務(wù)是操作任務(wù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中的樣品是水樣品、血液樣品、腹水、腦髓液或是羊水。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中的至少一個處理任務(wù)是分離、轉(zhuǎn)運、濃縮、純化、富集、結(jié)構(gòu)改變或是分解。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)是通過使用一種或是多種物理力進行的，物理力至少是部分的由集成在芯片上的微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中外加的物理力是聲場力、介電電泳力、磁力、行波介電電泳力或是行波磁力。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)包括使用物理力對實體分子進行操縱。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中外加的物理力是聲場力、介電電泳力、磁力、行波介電電泳力或是行波磁力。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，使用外加物理力對實體分子的操縱是通過操縱與實體分子相連的結(jié)合物實現(xiàn)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中的結(jié)合物是磁珠。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)是通過使用多種物理力實現(xiàn)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，還包括分析任務(wù)。
30.一種使用權(quán)利要求9中的集成式生物芯片系統(tǒng)的方法，包括的步驟為a)在集成式生物芯片系統(tǒng)中加入樣品；b)在上述集成式生物芯片系統(tǒng)中進行兩個或是兩個以上的順序任務(wù)，其中至少一個順序任務(wù)是操作任務(wù)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中的樣品是水樣品、血液樣品、腹水、腦髓液或是羊水。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中的至少一個處理任務(wù)是分離、轉(zhuǎn)運、濃縮、純化、富集、結(jié)構(gòu)改變或是分解。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)包括使用物理力對實體分子進行操縱。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中外加的物理力是聲場力、介電電泳力、磁力、行波介電電泳力或是行波磁力。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)伴隨著使用物理力操縱實體分子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中外加的物理力是聲場力、介電電泳力、磁力、行波介電電泳力或是行波磁力。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，使用外加物理力對實體分子的操縱是通過操縱與實體分子相連的結(jié)合物實現(xiàn)的。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中的結(jié)合物是磁珠。
39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中至少一個處理任務(wù)是通過使用多種物理力實現(xiàn)的。
40.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中一種或是多種樣品組分可以從至少一塊芯片轉(zhuǎn)移到至少另一塊芯片上，是通過除了流體推動、電泳或是電滲以外的機制實現(xiàn)的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中一種或是多種樣品組分可以從至少一塊芯片轉(zhuǎn)移到至少另一塊芯片上，是通過行波介電電泳或是行波磁泳實現(xiàn)的。
42.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，還包括分析任務(wù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于樣品制備和分析的集成式生物芯片系統(tǒng)。本發(fā)明給出了在集成式生物芯片系統(tǒng)的一塊或是多塊芯片上按照一定順序?qū)悠愤M行處理和分析的器件。該系統(tǒng)包括一塊或是多塊主動式芯片，并且可以實現(xiàn)自動化操作。本發(fā)明還包括了使用這樣的集成式生物芯片系統(tǒng)進行樣品處理和分析的方法。該方法包括在系統(tǒng)中加入樣品，在芯片表面進行至少兩個順序任務(wù)。該方法還包括使用物理力，例如介電電泳力、電磁力等進行樣品的處理和分析，同時還包括使用可以和樣品組分結(jié)合的，又可以被介電電泳力或是電磁力操縱的微粒的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1412321SQ01145118
公開日2003年4月23日 申請日期2001年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月9日
發(fā)明者程京, 王小波, 吳鐳, 楊衛(wèi)平, 許俊泉 申請人:清華大學(xué), 北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司