專利名稱：與p53結(jié)合的T細胞受體分子以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能與特定p53蛋白質(zhì)序列相結(jié)合的T細胞受體(TCR)分子，以及制造及使用這類分子的方法。本發(fā)明的TCR分子有各種用途，包括治療以及診斷方面的用途。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上治療例如癌癥等疾病的方法包含手術(shù)、放射線、化學(xué)治療、抗生素或組合治療。然而，上述治療方法對于這些指標的大多數(shù)還沒有證實具有有效性。發(fā)展預(yù)防和/或治療這類人類疾病的替代療法十分重要。近年來，利用抗體及T-淋巴細胞的免疫療法和基因療法已成為治療人類疾病的新方法，并且是很有發(fā)展前景的方法。
這種治療方法之一包括利用抗體使治療或診斷試劑對特定目標進行瞄準。許多團體圍繞利用抗體作為瞄準試劑這個課題形成了一些進展。這種進展包括對抗體融合蛋白質(zhì)和抗體共軛分子的構(gòu)造，將抗體連接到各種效應(yīng)分子上，包括放射性分子、化學(xué)治療劑、毒素、以及附加生物活性蛋白質(zhì)。利用這類分子建立起來的治療或診斷的設(shè)計是為了形成特定的效果，也就是連接了效應(yīng)分子的抗體的目標效果。
正如抗體已經(jīng)發(fā)展為療法，免疫系統(tǒng)的另外一種主要效應(yīng)物，T細胞受體(TCR)，擁有作為療法發(fā)展平臺的獨特優(yōu)勢?？贵w僅限于識別血液及細胞外空間內(nèi)的病原體，或者是細胞表面上的蛋白質(zhì)目標，而T細胞受體可識別細胞表面上表達出MHC分子的抗原(包含衍生自細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原)。依照T細胞的亞型，可識別顯示的抗原并變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，T細胞受體及承載T細胞受體的T細胞可參與控制各種免疫反應(yīng)。例如，T細胞參與體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，通過誘導(dǎo)B細胞分化成抗體產(chǎn)生細胞來實現(xiàn)。此外，活化的T細胞可引起細胞為媒介的免疫反應(yīng)。因此，T細胞受體可識別抗體不能發(fā)現(xiàn)的其它目標。
T細胞反應(yīng)通過抗原連接到T細胞受體(TCR)分子上進行調(diào)節(jié)。有一種類型的TCR是一種由外膜包裹的雜二聚體，它由類似于免疫珠蛋白的變異和恒定區(qū)域的α鏈及β鏈構(gòu)成。該TCRα鏈包含以共價連接的Vα及Cα鏈，而該β鏈包含以共價連接到Cβ鏈上的Vβ鏈。該Vα及Vβ鏈形成一個口袋或裂口，這樣就可以將超級抗原和抗原結(jié)合到主要組織兼容復(fù)合物系統(tǒng)中(MHC)(人類已知的是HLA復(fù)合物)。大體而言，參見Davis Ann.Rev.of Immunology 3537(1985)；Fundamental Immunology 3rd Ed.，W.Paul Ed.Rsen Press LTD.NewYork(1993)。
人們相信TCR在免疫系統(tǒng)的發(fā)展和功能中起著重要的作用。例如，已報導(dǎo)該TCR可調(diào)停細胞死亡、增加B細胞繁殖、并影響各種紊亂癥狀的發(fā)展和嚴重性，這些紊亂癥狀包括癌癥、過敏、病毒感染以及自體免疫障礙。
已有報告指出人類p53是一種腫瘤抑制蛋白質(zhì)，并且來自p53的肽表位具有特殊的I MHC類別的分子特征。進一步還有報告指出p53是廣泛的有關(guān)腫瘤的毒害細胞的T-細胞(CTL)目標的候選成員。參見，例如，Theobald，M.et al.(1995)PNAS(USA)9211993以及本文所引用的參考文獻。
現(xiàn)已認可人類p53蛋白質(zhì)的反常形式與各種癌癥相關(guān)。其中一種看法就是異?；蛲蛔兊膒53蛋白質(zhì)會湮沒正常(野生型)p53蛋白質(zhì)的保護特征。參見，例如Levine，A.J.et al.(1991)Nature(London)351453。
已有文獻描述了用于識別和具體連接衍生自人類p53蛋白質(zhì)的肽的人類I類分子。其中一種分子就是HLA-A2.1。參見Theobald，M.etal。
故人們期望得到可以識別和連接衍生自人類p53蛋白質(zhì)的肽的TCR分子。特別期望得到雜二聚體及單鏈TCR分子，可特異性地結(jié)合至人類p53蛋白質(zhì)的氨基酸位置264至272間的序列段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已識別出可與衍生自人類p53蛋白質(zhì)的肽相結(jié)合的T-細胞受體(TCR)分子。一方面，本發(fā)明人已分離出雜二聚體的TCR分子，它可以特異性地連接出現(xiàn)在HLA分子系統(tǒng)(尤其是HLA-A2.1)中，人類p53蛋白質(zhì)的優(yōu)選氨基酸位置264至272之間的序列段。另一方面，本發(fā)明人還制得了專門連接同一序列的單鏈TCR(sc-TCR)分子。本發(fā)明還揭示了制造及使用這種TCR分子的方法。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，包含治療用途及檢測具有p53蛋白質(zhì)的細胞的用途。
根據(jù)本發(fā)明的TCR分子通常為雜二聚體或單鏈分子，它可結(jié)合人類p53分子的優(yōu)選為氨基酸位置264至272間的序列。最佳的序列為Leu Leu Gly Arg Ash Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)的表位，其位置為人類p53分子的氨基酸位置264至272之間的范圍。其它合適的p53序列如下述。
特定的TCR分子具有各種用途的特征。例如本文所揭示的雜二聚體TCR分子可用于檢測表達p53蛋白質(zhì)的細胞，尤其是在出現(xiàn)適當抗原的復(fù)合物系統(tǒng)中。對這種復(fù)合物的舉例說明就是一種靈長類的I類主要組織兼容復(fù)合物(MHC)，它結(jié)合并出現(xiàn)在p53蛋白質(zhì)的CTL免疫相關(guān)的局部。優(yōu)選的MHC I類分子為如下揭示的人類HLA-A2.1復(fù)合物。
本發(fā)明包括各種雜二聚體的TCR分子，其所在的系統(tǒng)通常是預(yù)先確定的，以符合所需的用途。例如，于一具體實施例中，雜二聚體TCR分子表達為細胞表面分子位于轉(zhuǎn)染或基因重組的細胞上。該細胞的實例如下述。此外，合適的雜二聚體TCR分子以更易于溶解的形式給出，例如，該雜二聚體包含下述一種或多種免疫球蛋白(Ig)序列。
本發(fā)明更特別的雜二聚體TCR分子是以α鏈及β鏈為特征，這些鏈彼此之間通常由一個或多個共價鍵連接。最好，這些共價鍵包含一或多個雙硫鍵連接。更優(yōu)選的，雜二聚體包含至少一個Vα鏈和至少一個Vβ鏈，這些鏈最好構(gòu)造在有效位置，位于雜二聚體鍵合縫隙內(nèi)或附近，序列段大約為人類p53分子的氨基酸位置264到272的范圍，優(yōu)選氨基酸位置264-272。短語“有效位置”的意思是指根據(jù)本發(fā)明(雜二聚體和單鏈形式)TCR V鏈與p53的特定序列結(jié)合，按照本文所揭示的標準分析法，包括優(yōu)選的T細胞結(jié)合方式以及下述ELISA測試。
該雜二聚體TCR的特定V鏈包含以共價連接至C-α鏈的V-α鏈和以共價連接至C-β鏈的V-β鏈。在大多數(shù)具體實施例中，C-α鏈及C-β鏈各自獨立地連接到適當?shù)募毎缒そY(jié)構(gòu)區(qū)域，這個結(jié)構(gòu)區(qū)域通常進一步地獨立連接到適當?shù)募毎|(zhì)區(qū)域。例如，在需要一種可溶性雜二聚體分子的情況下，至少最好去除跨膜區(qū)域或最佳是去除整個跨膜區(qū)域，例如采用標準重組DNA的手段。
本發(fā)明的特征還有其它有用的TCR分子，包含本文所揭示的單鏈T細胞受體(sc-TCR)分子。一般，這些分子包含至少一個Vα鏈連接到至少一個Vβ鏈，通過至少一個肽序列。若需要，該sc-TCR可進一步包含至少一個Cα鏈的部分，并且可選至少一個Cβ鏈部分。在本發(fā)明更具體的實施例中，該sc-TCR將包含大約一個Vα鏈連接到大約一個Vβ鏈，通過至少一個肽連接序列。sc-TCR中任何V或C序列的排列通常并不重要，只要達到了目標連接結(jié)果。然而，通常最好Vα及Vβ鏈要足夠，可以有效連接到人類p53序列段上，大約是按照標準連接測試確定的氨基酸264-272的位置。
本發(fā)明給出了重要的優(yōu)點。
例如，雜二聚體及單鏈TCR首次提供了可辨識及結(jié)合到一種重要的p53表位序列上的TCR分子。本發(fā)明的分子通過結(jié)合至該序列提供了對于癌癥或癌癥前細胞中的p53腫瘤抑制蛋白的重要和可靠的識別。因此，在本發(fā)明之一個方面，該分子可用于診斷性的方面以檢查并量化(若需要)細胞、組織和器官內(nèi)p53的存在和數(shù)量。這類細胞包含培養(yǎng)細胞以及初級、二級及不死細胞系。檢測p53蛋白質(zhì)的能力對于癌癥的體內(nèi)和體外診斷十分有用。另一方面，本發(fā)明的TCR分子可用于檢測和(選用)量化細胞中的p53，特別是可以在適當?shù)腗HC I類分子的系統(tǒng)(特別是HLA-A2.1復(fù)合物)中引起p53抗原的那些。
因此，一方面，本發(fā)明的特征是一種分離的T細胞的受體(TCR)雜二聚物，它包含Vα鏈及Vβ鏈。最好，該雜二聚體可結(jié)合下列“靶”氨基酸序列Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，最好特別是在HLA-A2.1 MHC分子的系統(tǒng)中，包括該序列的變異序列，其中至少有一個保守氨基酸的替代物。優(yōu)選的結(jié)合通過任何一種標準TCR結(jié)合分析確定，其結(jié)合特性表達為結(jié)合的增加，這種結(jié)合的增加與發(fā)生在無關(guān)(對照)TCR上的結(jié)合具有顯著的不同(此處“顯著性”通過使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)統(tǒng)計方法決定，例如p≤0.05)。優(yōu)選，該結(jié)合高于對照組至少約2倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍、或至少約100倍。最優(yōu)選的TCR結(jié)合分析以及不相關(guān)的TCR雜二聚體如下所述。
在一個更具體的實施例中，本發(fā)明的特征還包括一種分離的T細胞受體(TCR)雜二聚體，其包含一種α鏈及一種β鏈，其中該α鏈包括按照下列順序通過共價鍵連接的a)一種Vα鏈以及b)一種Cα鏈；且該β鏈包括按照下列順序通過共價鍵連接的c)一種Vβ鏈及一種Cβ序列。優(yōu)選的，該雜二聚體可以在HLA-A2.1 MHC分子系統(tǒng)中結(jié)合前述的靶氨基酸序列SEQ ID NO.1，以及至少有一個保守氨基酸替代物的該靶序列的變異序列。
如上所討論，本發(fā)明的發(fā)明特征還有sc-TCR分子，它包括可特異性地連接靶SEQ ID NO.1序列的V鏈。
在本發(fā)明的一個實施例中，這種sc-TCR包含至少一個Vα鏈通過共價鍵連接到至少一個Vβ鏈上，借由至少一個肽連接序列實現(xiàn)。優(yōu)選，這類sc-TCR包含約1到5個這種V鏈，更優(yōu)選為約1到2個這類V鏈。還優(yōu)選，這類V鏈在HLA-A2.1 MHC分子系統(tǒng)中可以連接下列靶氨基酸序列Leu Leu Gly Arg Ash Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，包括至少有一個保守氨基酸替代物的該靶序列的變異序列。
優(yōu)選的結(jié)合通過任何標準TCR結(jié)合分析確定，其結(jié)合特性表達為結(jié)合的增加，這種結(jié)合的增加與發(fā)生在不相關(guān)(對照)TCR上的結(jié)合有顯著的不同(此處“顯著性”通過使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)統(tǒng)計方法決定，例如p≤0.05)。優(yōu)選的，該結(jié)合高于對照組至少約2倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍、或至少約100倍。最優(yōu)的sc-TCR結(jié)合分析以及不相關(guān)sc-TCR描述如下。
另一方面，本發(fā)明的特征還包含至少一對核酸片段(通常為DNA或RNA)，該片段中編碼了一種或多種本文所提供的雜二聚體。
另一方面，本發(fā)明還包括DNA載體，包含至少一個編碼了TCR雜二聚體的DNA片段。例如，第一DNA片段可編碼該α鏈而第二DNA片段可編碼該β鏈。于某些例子中，需要提供一種單一的DNA載體，它帶有一些片段可以同時編碼雜二聚體的α鏈和β鏈。
本文還展望了包含這里指出的DNA載體的細胞。
本發(fā)明的特征還包括一種核酸片段(DNA或RNA)，它編碼了至少一個本文提供的sc-TCR分子，優(yōu)選約1至5個，更優(yōu)選為1到2個。本發(fā)明還包括含有核酸片段的DNA載體。
另一方面，本發(fā)明的特征還包含一種方法，可識別在HLA-A2.1MHC分子體系中表達p53蛋白的細胞和組織。在另一具體的實施例中，這種方法包括用轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞或基因重組細胞接觸細胞和組織，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞和基因重組細胞中包含本文所揭示的sc-TCR或TCR雜二聚體?；蛘?，使該細胞或組織可以與可溶性sc-TCR或TCR雜二聚體接觸，以替代(或結(jié)合使用)表達sc-TCR或TCR雜二聚體的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞或基因重組細胞。
本發(fā)明的特征還包含一種方法，用于識別在HLA-A2.1 MHC分子體系中表達p53蛋白質(zhì)的細胞和組織。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，該方法包括用本文提供的sc-TCR接觸該細胞或組織。
本發(fā)明還包括殺死表達下列氨基酸靶序列的細胞的方法Leu LeuGly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，包括這個序列的變異序列，它具有至少一個保守氨基酸的替代物。更具體的方法包括用轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞和重組細胞接觸該細胞，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞和重組細胞表達本文所給出的sc-TCR或TCR雜二聚體分子。此外，優(yōu)選的方法進一步包括用一定數(shù)量的sc-TCR或雜二聚體TCR接觸該細胞，所采用的數(shù)量根據(jù)傳統(tǒng)的分析方法來確定，通常足夠用來傷害或殺死此細胞(例如，錐蟲藍排除法(trypan blue exclusion)，表達出細胞程序死亡的特征等)。
另一方面，本發(fā)明的特征還包括治療癌癥的方法，該方法包括對哺乳動物施用治療上有效量的至少下列一種物質(zhì)a)具有本文所提供的TCR雜二聚體的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞或基因重組細胞，或b)至少一種本發(fā)明的sc-TCR，優(yōu)選為一種這類sc-TCR。優(yōu)選，所述癌癥的特征為p53蛋白質(zhì)的正調(diào)節(jié)(upregulation)，其調(diào)整量根據(jù)下列討論的免疫組織化學(xué)或流式細胞儀確定的量，正調(diào)整到至少約2倍，優(yōu)選至少5至10倍，優(yōu)選約100倍。
本發(fā)明的其它方面及具體實施例描述如下。


圖1是對pNAG2載體的圖示說明。
圖2是顯示pSUN27載體的示意圖(寄存編號為ATCC#209276)。
圖3是顯示載體中編碼優(yōu)選的雙特異交雜分子pBISP/D011.10以及pBISP/149(稱為pSUN28的寄存編號為ATCC#203186)的區(qū)域的示意圖。
圖4A、4B及4C顯示該264單鏈TCR(264sc-TCR)(SEQ ID NO.2)的氨基酸及核酸序列。Va3＝TCR Vα3區(qū)域(氨基酸61-399)；連接子序列(氨基酸400-471)；Vb3＝TCR Vβ3區(qū)域(氨基酸472-813)；Cb＝TCR Cβ區(qū)域(氨基酸472-813)。
圖5顯示該264TCR的光學(xué)Cα區(qū)域(SEQ ID NO.3)。
具體實施例方式
如上文所總結(jié)，本發(fā)明人現(xiàn)已分離出非常有用的T細胞受體(TCR)雜二聚體，它通常包含一個Vα鏈及一個Vβ鏈，也就是，一種雙鏈復(fù)合物。更優(yōu)選的雜二聚體通常在HLA-A2.1 MHC分子體系中，人類p53蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列約264到272間的區(qū)域結(jié)合，優(yōu)選為該蛋白質(zhì)的氨基酸位置264至272間，也就是，下列氨基酸靶序列Leu LeuGly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)。正如前面總結(jié)的，良好的結(jié)合效果是由下述標準T細胞結(jié)合分析確定的。
已有報告指出許多自然形成的TCR雜二聚體之一般結(jié)構(gòu)。例如參見Davis Ann Rev.of Immunology 3537(1985)；FundamentalImmunology 3rdEd.，W.Paul Ed.Raven Press LTD.New York(1993)以及此文所引用的參考文獻。
通常，T細胞是以提呈在其細胞表面上的T細胞受體來識別存在于細胞表面的抗原。TCR是雙硫鍵連接的雜二聚體，主要是由α及β鏈糖蛋白構(gòu)成。T細胞用來產(chǎn)生其各種受體分子的機制與用來產(chǎn)生在B細胞中起作用的各種抗體的機制相同。(Janeway and Travers；Immuno-biology 1997)。與免疫球蛋白基因相似，TCR基因是由在T細胞發(fā)展期間重新排列的片段所組成。TCR多肽是由可變的氨基端及固定的羧基端區(qū)域組成。同時，該羧基端區(qū)域的功能是作為透過細胞膜的錨接物，并且在受體被占據(jù)后參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而可變區(qū)域?qū)⒇撠熥R別抗原。該TCRα鏈僅含有由V及D片段編碼的可變區(qū)域，而β鏈含有額外的結(jié)合(J)部分。在整個TCR的各種各樣的組成成分中，這些片段的重新組合可以識別出現(xiàn)在不同MHC分子體系中的很多不同的抗原。
已有報告指出可識別特定抗原的特異性TCR。例如，尚未獲準的美國專利申請案U.S.S.N.08/813,781和U.S.S.N.09/422,375，合并在本文中作參考；以及國際公開申請PCT/US98/04274和PCT/US99/24645，并且本文討論的參考資料揭示了制備及使用特異性TCR的方法。此外，利用重組方法生產(chǎn)了特定特異性TCR如可溶性、單鏈TCR(sc-TCR)。生產(chǎn)和使用sc-TCR的方法揭示并描述于尚未獲準的美國專利申請08/943,086，以及國際申請PCT/US98/20263中，它們作為參考資料合并在本文中。
本發(fā)明優(yōu)選的TCR雜二聚體包含以至少一個雙硫共價鍵互相連接的α鏈及β鏈。已經(jīng)報道了鏈與鏈之間以非共價鍵連接的情況，例如，氫鍵連接。各鏈的長度約為150至350個氨基酸長度、優(yōu)選為約200至約300個氨基酸長度、優(yōu)選為約250至約290個氨基酸長度，本發(fā)明應(yīng)用中大部分使用約280個氨基酸長度的鏈。本發(fā)明的雜二聚體TCR分子可視需要予以醣基化。
“HLA-A2.1 MHC分子”系指靈長類的MHC I類分子，優(yōu)選為人類分子，其可由A2.1限制性產(chǎn)生或由A2.1限制性的具有TCR的腫瘤反應(yīng)性胞毒T淋巴細胞(CTL)識別，該TCR對具有得自人類p53蛋白質(zhì)的序列的肽具有特異性。優(yōu)選的氨基酸序列系人類p53序列中的約氨基酸250至約氨基酸290，優(yōu)選為該序列的約氨基酸264至約氨基酸272，于大部分應(yīng)用中系使用該p53蛋白質(zhì)序列的氨基酸264至氨基酸272區(qū)域。
本發(fā)明中優(yōu)選的HLA-A2.1 MHC分子是完整的膜蛋白質(zhì)，其包含具有三個細胞外結(jié)構(gòu)域(α1、α2、及α3)的糖蛋白重鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該重鏈與可溶性次單元β2-微球蛋白間典型地系以非共價鍵連接。該重鏈的α1及α2結(jié)構(gòu)域一起折疊形成特定p53序列的肽結(jié)合溝。該重鏈與β2-微球蛋白間的關(guān)聯(lián)有助于穩(wěn)定肽結(jié)合溝。該MHC分子可由自然產(chǎn)生或重組的I類重鏈(或其片段)的任何組合與自然產(chǎn)生或重組的β2-微球蛋白分子(或其生物活性片段)所構(gòu)成。
與人類p53氨基酸及核酸序列有關(guān)的信息可自國家醫(yī)藥圖書館，38A，8N05，Rockville Pike，Bethesda，MD 20894的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)-基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)獲得。Genbank亦可自網(wǎng)際網(wǎng)絡(luò)http//www.ncbi.nlm.nih.gov上獲得。參見Benson，D.A.et al.(1997)Nucl.Acids.Res.251中對Genbank的說明。亦參見前述Theobald，M et al.(1995)(揭示本案采用的該p53氨基酸編號表)。
已有報告指出于惡性細胞中，腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53的表達有向上調(diào)節(jié)的情形。亦顯示出所有腫瘤中，50％的腫瘤于其表面上增加p53的表達程度(Kolliston，M.D.，et al.，Science(1991)，25349)。
關(guān)于制造及使用人類HLA-A2.1 MHC分子的信息，尤其是關(guān)于腫瘤細胞表達p53，以揭示于前述Theobald，M et al.(1995)的報告及其參考文獻中。亦參見PCT/US97/03611及USSN 08/812,393，申請日為1997年3月5日，該申請案請求USSN 60/012,845，申請日為1996年3月5日的優(yōu)勢。PCT/US97/03611、USSN 08/812,393、以及USSN60/012,845申請案的內(nèi)容在此引入以供參考。
檢測HLA-A2.1 MHC分子與得自p53蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列間的結(jié)合的方法已揭示于，例如前述Theobald，M et al.(1995)的報告中。一般，該方法包括利用識別性競爭分析法以評估p53肽對HLA-A2.1分子的結(jié)合。亦參見，PCT/US97/03611、USSN 08/812,393、以及USSN60/012,845申請案。
本發(fā)明的特定雜二聚體TCR分子包含一Vα鏈，該鏈與第4A-C圖所示的Va3鏈具有至少約90％的同一性，優(yōu)選為約95％至100％的同一性。本發(fā)明的其它雜二聚體包含Vβ鏈，該鏈與第4A-C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vb3鏈具有至少約90％的同一性，優(yōu)選為約95％至100％的同一性。
優(yōu)選地，為了決定兩個氨基酸序列間的同一性百分比，將這些序列排列以進行最適合的比對(例如，于第一及第二氨基酸之一或兩者中插入間隔(gap)以進行最佳的比對，以及為了比對的目的，而忽視非相似性性序列)?！副葘Υ翱凇瓜抵高x自由25至600，通常約50至約200，更通常約100至約150個連續(xù)位置的數(shù)目中的任一片段，于該兩序列經(jīng)最佳排列后，將該片段的序列與連續(xù)位置的相同數(shù)目的參考序列進行比對。為了辨別序列具有如本文所揭示的適當?shù)耐恍裕?，該比對窗口可包括任何上述片段范圍?br> 兩序列間的同一性百分比系序列間共有的相似位置的數(shù)目、計算間隔的數(shù)目、以及為了進行兩序列間最理想的排序而需插入的間隔的長度的函數(shù)。的后比對于相對應(yīng)氨基酸位置上氨基酸殘基。當?shù)谝恍蛄兄械哪澄恢玫陌被釟埢c對應(yīng)于第二序列的位置時，則于該位置的分子系列為相似的(本文中所使用氨基酸的「同一性」等同于氨基酸的「相似性」)。
兩序列間的同一性百分比可利用本領(lǐng)域中已知的數(shù)學(xué)算法決定(參見，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。例如，兩氨基酸序列間的同一性百分比可利用Needleman及Wunsch算法決定(J.Mol.Biol.(18)444-453，1970)，其系GCG軟件包(可自http//www.gcg.com取得)的GAP程序之一部份，或由Smith &Waterman的局部相似性算法(Adv.Appl.Math.2482，1981)，Pearson& Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988)與Altschul等人(Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402，1997)的相似性搜尋的方法，這些計算機化的算法(Wisconsin Genetic Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及BLAST(得自Genetic Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.))，或手動排序以及用肉眼檢視(參見，例如前述Ausubel等人)決定序列的同一性。
可調(diào)整間隔參數(shù)以符合使用者的需要。例如，當使用GCG軟件包時，可采用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70、或80之間隔比重(gap weight)與1、2、3、4、5、或6的長度比重(length weight)。使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣之間隔比重的例子為16、14、12、10、8、6、或4，而長度比重的例子為1、2、3、4、5、或6。兩氨基酸序列間的同一性百分比可使用PAM120比重殘基表、間隔長度的扣分為12及間隔扣分為4的條件，并利用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Myers與W.Miller的算法(CABIOS 411-17)加以決定。
因此，「100％同一性」系指V鏈的氨基酸與相對應(yīng)的自然產(chǎn)生的TCR Vβ或Vα鏈或其具有相同結(jié)合特征的對偶變異物(例如，于結(jié)合特異性與親和性方面無顯著差異)系100％相似的。亦即，V鏈與相對應(yīng)的自然產(chǎn)生的鏈(或其具有相同結(jié)合特征的對偶變異物)具有相同的長度與氨基酸序列。
本發(fā)明其它優(yōu)選的雜二聚體分子包含分別與第5圖[SEQ ID NO.3]以及第4A至C圖[SEQ ID NO.2]所示的Cα及Cβ鏈的序列具有至少約90％同一性的Cα及Cβ鏈序列。優(yōu)選地，該Cα及Cβ鏈序列與第5及第4A至C圖所示的Cα及Cβ鏈序列間具有約95％至約100％的同一性。
sc-TCR的一般結(jié)構(gòu)以及制造與使用該sc-TCR的方法已揭示于未獲準的USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274中。USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274所揭示的內(nèi)容在此引入以供參考。
其它，亦參見未獲準的USSN 08/943,086以及PCT/US98/20263中有關(guān)制造及使用sc-TCR分子的內(nèi)容。USSN 08/943,086以及PCT/US98/20263所揭示的內(nèi)容在此引入以供參考。
如上述，本發(fā)明系以非常有用的單鏈T細胞受體(sc-TCR)蛋白質(zhì)為特征，一般，該sc-TCR包含通過約1至5個肽連接子序列共價連接至約1至5個Vβ鏈的約1至5個Vα鏈。優(yōu)選的sc-TCR包含通過約1個本文所提供的肽連接子序列而共價連接至約1個Vβ鏈的約1個Vα鏈。
其它優(yōu)選的sc-TCR典型地可結(jié)合至在HLA-A2.1 MHC分子中具有得自人類p53蛋白質(zhì)的序列的肽。優(yōu)選的氨基酸序列通常系人類p53序列中約氨基酸250至約氨基酸290間，優(yōu)選系以具有橫跨p53蛋白質(zhì)的氨基酸位置264至272序列的自約氨基酸264至約氨基酸272間為最佳應(yīng)用。優(yōu)良的結(jié)合系以下述的標準T細胞受體(TCR)ELISA分析法來決定。
本發(fā)明中特定的sc-TCR分子包含與下述第4A至C圖[SEQ ID NO.2]所示的Va3鏈具有至少約90％同一性的Vα鏈，優(yōu)選為約95％至約100％的同一性。其它優(yōu)選的sc-TCR分子包含與第4A至C圖[SEQ ID NO.2]所示的Vb3鏈具有至少約90％同一性的Vβ鏈，優(yōu)選為約95％至約100％的同一性。
本發(fā)明其它優(yōu)選的sc-TCR分子包含與第4A至C圖所示的Cβ鏈具有至少約90％同一性的Cβ鏈，優(yōu)選地，該Cβ鏈與第4A至C圖所示的Cβ鏈具有約95％至約100％的同一性。
已于標準T細胞受體(TCR)ELISA分析法中發(fā)現(xiàn)，展現(xiàn)優(yōu)良的sc-TCR結(jié)合并不總是需要Cα鏈。于這些具體實施例中，并不需要以Cα鏈作為sc-TCR分子的一部份。例如，參見下述第4A至5C圖(揭示最佳的264sc-TCR的序列)。然而，sc-TCR分子可包含至少一個Cα鏈(例如于第5圖所示者)或其功能片段，優(yōu)選為約1至5個這些鏈，其中以1個這些Cα鏈為適當者。
本發(fā)明具體實施例中特定的sc-TCR分子包含Cα鏈或其功能片段，該鏈與第5圖[SEQ ID NO.3]所示的Cα鏈具有至少約90％同一性。優(yōu)選為與第5圖[SEQ ID NO.3]所示的Cα鏈具有約95％至約100％的同一性。
本發(fā)明特定的sc-TCR分子包含共價連接的序列1)第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vα3鏈；2)肽連接子；以及3)第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3鏈。于一具體實施例中，該sc-TCR分子進一步包含如第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所提供的Cβ鏈，其優(yōu)選系連接至Vβ3鏈的C端。
于前述特定的sc-TCR分子的具體實施例中，該sc-TCR進一步包含如第5圖(SEQ ID NO.3)所提供的Cα鏈，該鏈優(yōu)選系共價連接Vα鏈的C端及肽連接子的N端。
本文所揭示的典型的雜二聚體的Vα及Vβ鏈及單鏈TCR分子的長度一般系約200至400個氨基酸，優(yōu)選為約300至350個氨基酸。決定氨基酸長度的方法為本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，該方法包含聚丙烯酰胺凝膠電泳。
如所討論，本發(fā)明優(yōu)選的sc-TCR分子包含一或多的肽連接子序列，其優(yōu)選位于Vα及Vβ鏈間。優(yōu)選的連接子序列包括自約7至20個氨基酸，優(yōu)選自約8至16個氨基酸。該連接子序列優(yōu)選系具有靈活性的，因此不將衍生自該人類p53蛋白質(zhì)(且表達于HLA-A2.1分子中)的序列限制為單一所需的構(gòu)形。特定地，該肽連接子序列可設(shè)置于TCR可變鏈中以加強這些鏈間的結(jié)合靈活性。該連接子明顯地包括具有小型側(cè)鏈的氨基酸，例如甘胺酸、丙胺酸以及絲胺酸，使提供靈活性。約80或90百分比或以上的連接子序列包括甘胺酸、丙胺酸或絲胺酸殘基，尤其系甘胺酸以及絲胺酸殘基。至于雜二聚體TCR，該連接子序列系適當?shù)剡B接至TCR分子的β鏈，雖然該連接子序列亦可附接至該TCR分子的α鏈。此外，該連接子序列可連接該TCR分子的α鏈及β鏈兩者。
參見下列關(guān)于制造及使用sc-TCR分子的參考文獻以補充本文所揭示的內(nèi)容Novotny，J.et al.PNAS(USA)888646(1991)；SooHoo，W.F.et al.PNAS(USA)894759(1992)；Wülfing，C.andPlückthun，A.，J.Mol.Biol.242655(1994)；Kurucz，I.et al.PNAS(USA)903830(1993)；PCT WO 96/13593；Ward，E.S.et al.J.Mol.Biol.224885(1992)；Schlueter，C.J.et al.J.Mol.Biol.256859(1996)；Mariuzza，R.A.and Winter，G.，(1989)2647310；Gascoigne，N.R.J.，et al.，PNAS(USA)(1987)，842936。
于本發(fā)明特定具體實施例中，適合的連接子序列系A(chǔ)SGGGGSGGG(亦即，Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)(SEQ ID NO.4)，重復(fù)4次或更多次，優(yōu)選系連接至TCR的β結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸?？墒褂貌煌倪B接子序列，包含任何數(shù)量的靈活的連接子設(shè)計，這些設(shè)計的連接子已成功地用于結(jié)合抗體可變區(qū)，參見Whitlow，M.et al.，(1991)MethodsA Companion to Methods in Enzymology 297-105。適當?shù)倪B接子序列可輕易地憑經(jīng)驗加以辨別。另外，連接子序列的適當大小及序列亦可由已知計算機仿真技術(shù)基于該TCR分子的預(yù)定的大小及形狀加以辨別。
因此，于一具體實施例中，本發(fā)明以特定的sc-TCR分子為特征，其中優(yōu)選至少一個肽具有下列序列Gly Gly Gly Gly Ser，重復(fù)4次或更多次(SEQ ID NO.5)。
亦參見案名為「T細胞受體融合物及共軛物及其使用方法」的相關(guān)申請中的申請案，申請日為2001年6月5日(USSN 09/874,907，發(fā)明人為Jon A.Weidanz，Kimberlyn F.Card，以及Hing C.Wong)以提供其它關(guān)于特定264TCR相關(guān)分子的信息；該相關(guān)申請中的申請案的內(nèi)容在此引入以供參考。
某些套組(settings)可用于制造本發(fā)明的多價sc-TCR分子，例如，增加該sc-TCR的價數(shù)。簡單的說，該多價TCR蛋白質(zhì)是通過利用例如，標準生物素-抗生蛋白鏈菌素標記技術(shù)或通過共軛至適合的固體支撐物(例如乳膠珠)將二及四種蛋白質(zhì)(可相同或不同)彼此間共價連接而制造該多價sc-TCR蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)交聯(lián)蛋白質(zhì)(例如交聯(lián)至樹狀聚合物)亦為適合的多價種類。例如，可通過包含帶有化學(xué)反應(yīng)性支鏈(例如Cys或His)的可編碼出氨基酸殘基的序列修飾該蛋白質(zhì)。這些帶有化學(xué)反應(yīng)性支鏈的氨基酸可位于該經(jīng)連接的蛋白質(zhì)中的各種位置，優(yōu)選位于TCR的抗原結(jié)合區(qū)域的末端。例如，可溶性融合蛋白質(zhì)的C-β鏈片段的C端可共價連接至蛋白質(zhì)純化卷標或其它包含此種反應(yīng)性氨基酸的其它蛋白質(zhì)。適合的支鏈包含可將二或多種融合蛋白質(zhì)化學(xué)地連接至適合的樹狀聚合物粒子而得到多價分子者。樹狀聚合物為合成的化學(xué)聚合物，其表面可具有一些不同官能基中的任一者(D.Tomalia，Aldrichimica Acta，2691101(1993))。根據(jù)本發(fā)明所使用的樹狀聚合物的實例包含，例如，E9亮光聚胺樹狀聚合物以及E9燃燒性聚胺樹狀聚合物，其可連接半胱胺酸殘基。
本文所提供的人類p53序列對本發(fā)明的TCR分子的成功的提呈可通過各種特定分析法決定，包含T細胞結(jié)合分析法以及下述的TCRELISA。此外，若需要，可通過監(jiān)測T細胞的活性檢測及定量該成功的提呈，該T細胞活性監(jiān)測包含T細胞增殖的誘發(fā)或抑制、或T細胞對特定位置或標記的免疫反應(yīng)的起始作用或抑制作用。這些適合的分析法包含，但不限于，體外分析法，包含培養(yǎng)T細胞、增殖T細胞、以及使T細胞與MHC-肽抗原復(fù)合物接觸，然后評估該細胞的生物反應(yīng)。參見USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274申請案關(guān)于這些分析法的更多特定實例。
一方面，TCR分子的功能系由監(jiān)測該TCR識別適當?shù)腗HC分子(例如HLA-2A)中的適當?shù)膒53肽的能力所決定，例如由監(jiān)測該TCR與MHC:p53肽復(fù)合物的結(jié)合。這些復(fù)合物可提呈于細胞，于此情形中TCR的功能系由使經(jīng)標記的TCR與提呈p53的細胞接觸且測量與細胞結(jié)合的量，另一方面將該經(jīng)標記的TCR與未提呈p53的細胞并測量與細胞結(jié)合的量，比較兩者。經(jīng)標記的細胞可通過使用本領(lǐng)域中常規(guī)的流式細胞儀加以檢測。
另一方面，系使用非-細胞為主分析法，例如TCR酶連接免疫吸附分析法(Enzyme Linked Immunosorbant Assay，ELISA)。例如將該TCR直接結(jié)合至一支撐物，即可測量其與MHC:p53肽復(fù)合物的結(jié)合能力，或者將該MHC:p53結(jié)合至一支撐物，即可測量復(fù)合物與TCR的結(jié)合能力。適合的支撐物包含，但不限于微滴定盤的孔槽、細胞培養(yǎng)盤、膜、玻璃或聚合物基材等。除了直接將TCR結(jié)合至支撐物外，可于該支撐物外涂覆一種可識別TCR的抗體，該經(jīng)結(jié)合的抗體會捕捉TCR因而間接將TCR結(jié)合至支撐物上。這些分析法的適當?shù)膶φ战M為熟于本領(lǐng)域者所知悉，其包含，但不限于MHC分子與不恰當?shù)目乖Y(jié)合、不會識別p53的TCR、緩沖液等。于TCR ELISA中，TCR分子或MHC分子或肽接可經(jīng)標記。優(yōu)選為結(jié)合至支撐物上的分子系未經(jīng)標記的。本文所使用的「經(jīng)標記」是指直接或間接標記。因此，「經(jīng)標記的TCR分子」包括直接連接至TCR的標記或包括通過經(jīng)標記的結(jié)合伙伴(bindingpartner)，例如抗體，直接或間接與TCR結(jié)合，該結(jié)合伙伴可識別TCR或識別與TCR結(jié)合的抗體。本文中所使用的「經(jīng)連接」系指兩個分子間穩(wěn)定的連接，該連接可為共價或非共價連接。
監(jiān)測TCR功能的分析法亦包含測量由TCR調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。一方面，將可編碼出TCR雜二聚體的核酸構(gòu)建體引入細胞中，該細胞不會表達TCR或至少不會表達具有相同特異性的TCR。然后可檢測該TCR-表達細胞與p53:MHC復(fù)合物結(jié)合時該細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)適當信號的能力。例如，可測量該TCR-表達細胞產(chǎn)生IL-2的能力。亦可將sc-TCR轉(zhuǎn)染進入細胞。此方法中，該sc-TCR優(yōu)選系表達為一種與穿膜結(jié)構(gòu)域多肽(例如，得自免疫球蛋白分子)融合的融合物，以及更優(yōu)選為一種與適當細胞質(zhì)信號結(jié)構(gòu)域融合的融合物。一方面，該細胞質(zhì)信號結(jié)構(gòu)域系CD3ζ分子。MHC:p53復(fù)合物可以通過自然的或經(jīng)人造工程抗原提呈細胞的方式提呈或可為分離的復(fù)合物。
亦可測定TCR調(diào)節(jié)細胞溶解(cytolytic)反應(yīng)的能力。這些分析中，優(yōu)選系將可編碼TCR分子的核酸構(gòu)建體引入細胞中，該細胞可表達適當?shù)墓?刺激分子。
于上述所有分析法中，「具功能的」TCR系指與未結(jié)合MHC:p53復(fù)合物的對照組TCR相較下，可顯示使功能增加者(例如，增加結(jié)合、增加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如產(chǎn)生IL-2)、增加細胞殺傷等)。顯示「具功能的TCR」所增加的功能的量系根據(jù)所使用的分析法。例如，一方面，具功能的TCR所得的分析值比對照組TCR大約10％以上、約15％以上、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、或約100％以上。于其它分析中，具功能的TCR所得的分析值比對照組TCR大約2倍以上、約4倍以上、約8倍以上、約10倍以上、約20倍以上、約30倍以上、約40倍以上、約50倍以上、約60倍以上、約70倍以上、約80倍以上、約90倍以上、或約100倍以上。至于其它分析，具功能的TCR所得的分析值比對照組所得者在統(tǒng)計上具有p＜0.05的顯著差異。熟于本領(lǐng)域者可常規(guī)地評估測量所使用的特定分析法的差異。
通常，本發(fā)明TCR的制備可由本文所揭示的程序以及經(jīng)認可的重組DNA技術(shù)(包含，例如聚合酶連鎖放大反應(yīng)(PCR)、質(zhì)體DNA的制備、以限制酶切割DNA、寡核苷酸的制備、DNA的接合、mRNA的分離、將DNA引入至一適合的細胞中、宿主的轉(zhuǎn)形作用或轉(zhuǎn)染作用、培養(yǎng)宿主)加以完成。此外，可使用離液劑(chaotropic agent)及已知的電泳、離心與層析法將該TCR分子分離及純化。參見，Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.(1989))；以及Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York(1989)揭示相關(guān)的方法。
亦參見USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274以及上述參考的相關(guān)申請中的申請案，案名為「T-細胞受體融合物與共軛物及其使用方法」申請日為2001年6月5日(USSN 09/874,907，發(fā)明人為Jon A.Weidanz，Kimberlyn F.Card以及Hing C.Wong.)以提供更多關(guān)于制造及使用本文所揭示的分子的特定背景信息。
如所討論，本發(fā)明優(yōu)選的分子顯示有良好的結(jié)合，該結(jié)合系以本文所述的標準T細胞結(jié)合分析法或TCR ELISA所測定?！笜藴蔜細胞結(jié)合分析法」系指一種結(jié)合測試法，其可檢測及定量適當?shù)腡細胞和與抗原復(fù)合的MHC分子間的結(jié)合。簡單的說，優(yōu)選的試驗法包含提供可檢測的經(jīng)標記的MHC分子、于利于形成MHC-抗原T細胞復(fù)合物的條件下，使該經(jīng)標記的MHC分子(與抗原復(fù)合)與T細胞接觸、以及利用標準檢測法監(jiān)測復(fù)合物的形成。若需要，可測定該復(fù)合物的形成。亦可使用上述其它的TCR功能分析法。
本文所提供優(yōu)選的TCR分子(包含雜二聚體及單鏈分子)一般具有足夠的大小可使該TCR特異性的結(jié)合至MHC分子。于具體實施例中，該MHC系與抗原復(fù)合亦稱為肽-MHC分子，該TCR分子至少包含可形成MHC-肽結(jié)合口袋(binding pocket)的CDR結(jié)合圈。含有MHC-肽結(jié)合口袋的有用的α/βTCR分子優(yōu)選至少系由α鏈可變結(jié)構(gòu)域(根據(jù)α鏈的CDR的長度約為氨基酸1至約氨基酸110至約氨基酸130)以及該β鏈可變結(jié)構(gòu)域(根據(jù)β鏈的CDR的長度約為氨基酸1至約氨基酸110至約氨基酸130)。
本發(fā)明中優(yōu)選的TCR分子于本文前述的標準T細胞結(jié)合試驗中展現(xiàn)顯著的結(jié)合活性。優(yōu)選地，該TCR分子與其同源MHC抗原分子復(fù)合物的特異性結(jié)合的程度顯著地與結(jié)合至不適當?shù)?對照組)TCR不同(此處「顯著性」系利用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)統(tǒng)計方法決定，例如具有p≤0.05)。優(yōu)選地，該結(jié)合系對照值的至少約2倍、至少約倍10、至少約20倍、至少約50倍、或至少約100倍。適合的對照分子的實例包含，例如，USSN 08/813,781；USSN 09/422,375；PCT/US98/04274；PCT/US99/24645；以及其它本文所引用的參考資料中所提供的149 TCR分子。
非常有用的體外及體內(nèi)T細胞結(jié)合分析法已揭示于公開的PCT申請案PCT/US95/09816、PCT/US96/04314及PCT/US97/01617，以及申請中的美國專利申請案08/382,454、08/596,387及08/943,086。若需要鑒定本發(fā)明TCR分子與顯示于適當?shù)腗HC分子中的所揭示的p53氨基酸序列間的良好結(jié)合，可使用或輕易地采用所揭示的T細胞結(jié)合分析法。該公開的PCT申請案PCT/US95/09816、PCT/US96/04314及PCT/US97/01617，以及申請中的美國專利申請案08/382,454、08/596,387的內(nèi)容在此引入以供參考。
該T細胞結(jié)合試驗的優(yōu)選實例已揭示于相關(guān)申請中的申請案，申請日為2001年5月16日，案名為「T-細胞受體交互作用的調(diào)節(jié)」(USSN09/859,012，發(fā)明人為Peter Rhode，Vaughan Wittman，Jon A.Weidanz，Martin Burkhardt，Kimberlyn F.Card，Rony Tal，Jorge Acevedo，and Hing C.Wong)，該相關(guān)申請中的申請案的內(nèi)容在此引入以供參考(的后稱為「于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案」)。前述于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案系USSN 60/206,920的接續(xù)案。USSN 60/206,920的內(nèi)容在此引入以供參考。
尤其，于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案的實施例15揭示標準T細胞結(jié)合試驗的實例。典型地，該試驗涉及產(chǎn)生可表達目的TCR(例如本發(fā)明的雜二聚體)的T細胞；然后將這些細胞以適當?shù)腎類MHC分子(特別系HLA-A2.1分子)染色。將T細胞染色的方法(包含已知的生物素/抗生物素蛋白鏈菌素技術(shù))已揭示于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案。如所揭示的，優(yōu)選的檢測形式為流式細胞分析法，但是其它檢測策略可能更適合某些申請案。
「標準T細胞受體(TCR)ELISA」包括，但不限于所揭示的任一個適合的分析法，例如揭示于前述2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案者。優(yōu)選的分析法涉及利用，例如以孔盤為主的ELISA，操作單鏈或雜二聚體TCR構(gòu)建體。簡單的說，該分析法涉及可檢測地標記該單鏈或雜二聚體TCR，使經(jīng)標記的TCR分子與適合的含肽的MHC分子(優(yōu)選為本文所示的HLA-A2.1分子)接觸，其中該接觸系于足夠形成TCRMHC-肽復(fù)合體的條件下進行。優(yōu)選的標記策略系揭示于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案中，且包含生物素/抗生物素蛋白鏈菌素標記策略。參見，例如，于2001年5月16日申請的相關(guān)申請中的申請案的實施例15。
如所討論，本發(fā)明優(yōu)選的TCR分子典型地系與HLA-A2.1 MHC分子中，人類p53蛋白質(zhì)序列的自約氨基酸264至約氨基酸272間的氨基酸序列結(jié)合，優(yōu)選為該蛋白質(zhì)的氨基酸位置264至272，亦即，，下列「標的」氨基酸序列Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQID NO.1)。此外，標的氨基酸的衍生物亦可與本發(fā)明的TCR分子結(jié)合，標的氨基酸的衍生物系具有至少一個保留性氨基酸取代的氨基酸序列。于具體實施例中系于任何標的序列的殘基上進行二或多個保留性氨基酸取代，根據(jù)需要，這些取代可為相鄰的或非相鄰的。
優(yōu)選地，保留性取代系一種不會改變表達型的氨基酸取代作用，亦即，該取代不會顯著地影響該TCR于標準分析法中的結(jié)合作用。將保留性氨基酸取代成另一氨基酸的實例系于優(yōu)選的標的序列中氨基酸位置7(相當于人類p53蛋白質(zhì)的氨基酸位置270)的酪胺酸取代為苯丙胺酸。相反地，將標的序列中的任一亮氨酸取代為精胺酸則系非-保性氨基酸取代的實例。優(yōu)選的保留性氨基酸取代的實例已揭示于U.S.Pat.No.6,127,524(第15A-B圖)；該篇專利案的內(nèi)容在此引入以供參考。
本發(fā)明進一步提供編碼本發(fā)明TCR分子(包含優(yōu)選的雜二聚體與單鏈構(gòu)建體)的核酸序列(DNA或RNA)且特別是DNA序列。這些DNA序列優(yōu)選附帶于適合染色體外復(fù)制的載體上，例如噬菌體、病毒、質(zhì)體、噬粒(phagemid)、黏粒(cosmid)、YAC、或游離基因(episome)。于某些具體實施例中，該DNA載體可編碼其它輔助蛋白質(zhì)(helperprotein)，該等蛋白質(zhì)的專一功能為促進本文所述的制備性方法以獲得顯著量的該蛋白質(zhì)。該DNA序列可插入至適當?shù)谋磉_載體中，亦即，該載體包含該經(jīng)插入的蛋白質(zhì)編碼序列于進行轉(zhuǎn)錄作用與轉(zhuǎn)譯作用所需的組件。各種宿主-載體系統(tǒng)可用于表達該蛋白質(zhì)編碼序列。包含以病毒感染的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如牛痘病毒、腺病毒等)或以表達載體轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞系統(tǒng)；以病毒感染的昆蟲細胞系統(tǒng)(例如桿狀病毒)；微生物，例如含有酵母菌載體的酵母菌，或以噬菌體DNA、質(zhì)體DNA或黏粒DNA轉(zhuǎn)形的細菌。根據(jù)所利用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用任何數(shù)目的適合進行轉(zhuǎn)錄作用與轉(zhuǎn)譯作用的組件。一般參見前述Sambrook等人以及前述Ausubel等人。
一般，本發(fā)明優(yōu)選的DNA載體包括通過磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列，由5’至3’的方向包括第一克隆位置，其是為了引入可編碼出TCR鏈的核苷酸序列，該第一核苷酸序列操作性連接至編碼效應(yīng)物分子(effector molecule)的序列，亦即融合蛋白質(zhì)或共軛物。
本文中所使用的「效應(yīng)物分子」系指一氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽；糖類或多糖類；脂質(zhì)或醣脂類、糖蛋白、脂蛋白質(zhì)或可產(chǎn)生此處所討論的所需作用的化學(xué)藥劑。因此，適合的分子包含調(diào)節(jié)因子、酶、抗體或藥物以及DNA、RNA、以及寡核苷酸。該生物活性分子或效應(yīng)物分子可為自然產(chǎn)生的或由已知成分合成，例如通過重組或化學(xué)合成以及可包含異性成分。生物活性分子或效應(yīng)物分子一般系介于約0.1至100KD或高達約1000KD，優(yōu)選為介于約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之間，其大小是通過標準分子大小估算技術(shù)(例如離心或SDS-聚丙酰胺凝膠電泳)來評定。本發(fā)明目的的效果包含，例如，誘發(fā)細胞增殖或細胞死亡，激活免疫反應(yīng)或為了診斷目的作為檢測分子，該診斷是通過如下所揭示的分析來決定，包含含有一系列步驟的分析，如培養(yǎng)細胞至細胞增殖，以及使該細胞與本發(fā)明的TCR融合復(fù)合物接觸然后評估該TCR融合復(fù)合物系抑制該細胞還是使該細胞分化。
于多數(shù)例子中，各個由該DNA載體所編碼出的融合蛋白質(zhì)構(gòu)成要素優(yōu)選系以「暗盒」的型式提供。「暗盒」一詞系指各個構(gòu)成要素可輕易地通過標準重組方法由另一個構(gòu)成要素取代。為了制造編碼本文所提供的TCR分子的載體，編碼該TCR分子的序列系利用適合的連接酶連接至載體序列。
若需要，于該基因構(gòu)建體中亦可含有其它核苷酸序列。例如，激活子序列，其系控制編碼該TCR分子的序列的表達，或者含有前導(dǎo)序列，其是將該TCR融合復(fù)合物指向細胞表面或培養(yǎng)基，該前導(dǎo)序列可包含于構(gòu)建體中或存在于表達載體(含有經(jīng)插入的構(gòu)建體)中。于哺乳動物細胞表達中特佳為免疫球蛋白或CMV激活子。
應(yīng)注意，本發(fā)明TCR分子的組成包含，但不限于可變鏈、穿膜結(jié)構(gòu)域、固定鏈等，這些組成可以任何順序加以組織而提呈其功能。
可使用許多策略來表達本文提供的TCR分子。例如，將可與HLA分子中的標的氨基酸序列SEQ ID NO1結(jié)合的sc-TCR分子通過已知的方式(例如使用限制酶在載體上制造一切口，接著使該構(gòu)建體與載體接合)合并至適合的載體。然后將含有該重組基因構(gòu)建體的載體引入到適合的宿主中以表達該TCR融合肽。一般參見，Sambrook等人，如前述。根據(jù)與克隆方法相關(guān)的因素，可憑經(jīng)驗選擇適合的載體。例如，該載體應(yīng)為可兼容的，以及對宿主(目的使用的宿主)具有恰當?shù)膹?fù)制子。再者，該載體必需能容納編碼該TCR分子(欲表達的TCR分子)的DNA序列。適合的宿主細胞包含真核及原核細胞，優(yōu)選為易轉(zhuǎn)形的細胞及于培養(yǎng)基中展現(xiàn)快速生長能力的細胞。具體言的，優(yōu)選的宿主細胞包含原核生物，例如大腸菌、枯草桿菌等以及真核生物，例如動物細胞及酵母菌種(例如啤酒酵母菌)。一般以哺乳動物細胞優(yōu)選，尤其為J558、NOS、SP2-O或CHO。其它適合的宿主包含，例如昆蟲細胞(例如Sf9)。培養(yǎng)條件系使用已知的條件。參見，Sambrook等人，如前述。然后選擇可穩(wěn)定轉(zhuǎn)形及轉(zhuǎn)染的細胞株?？赏ㄟ^已知程序決定用以表達TCR分子的細胞。例如，經(jīng)連接至免疫球蛋白的TCR分子的表達可通過對該經(jīng)連接的免疫球蛋白特異的ELISA以及/或通過免疫斑點法加以決定。
一般上述提及的宿主細胞可用于制備的目的使可編碼目的的融合蛋白質(zhì)的核酸增殖。因此，宿主細胞可包含原核或真核細胞，其中該融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系經(jīng)特定的。因此，具體地宿主細胞包含酵母菌、蠅類、蟲類、植物、蛙類、哺乳動物細胞以及可增殖編碼該融合物的核酸的有機體?？墒褂玫牟溉閯游锛毎甑姆窍拗茖嵗珻HO dhfr-細胞(Urlaub and Chasm，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))，293 Cells(Graham等人，J.Gen.Virol，3659(1977))或骨髓癌細胞，如SP2或NSO(Galfre and Milstein，Meth，Enzymol，73(B)3(1981))。
可增殖編碼目的的雜二聚體或單鏈TCR的核酸的宿主細胞亦包含非-哺乳動物真核細胞，包含昆蟲(例如夜蛾，Sp.frugiperda)、酵母菌(例如啤酒酵母菌、裂殖酵母菌、畢赤酵母(P.pastoris)、克氏乳酸菌(K.lactis)、漢遜酵母菌(H.polymorpha)；典型地如Fleer，R.，Current Opinion in Biotechnology，3(5)486496(1992)所整理者)、真菌以及植物細胞。亦包含某些原核生物，例如大腸菌及桿菌。
通過轉(zhuǎn)染細胞的標準技術(shù)將編碼目的的融合蛋白質(zhì)的核酸引入宿主細胞中。該「轉(zhuǎn)染」或「轉(zhuǎn)染作用」一詞系欲包含所有已知的將核酸引入宿主細胞的技術(shù)，包含磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡萄聚糖-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染作用、脂質(zhì)體感染、電穿孔、微注射、病毒轉(zhuǎn)換以及/或整合?？捎赟ambrook等人，如前述，及其它實驗教科書中發(fā)現(xiàn)適合用于轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法。
本發(fā)明進一步提供分離本文所揭示的任一TCR分子的生產(chǎn)過程。于該過程中，使宿主細胞(例如酵母菌、真菌、昆蟲、細菌或動物細胞)生長于具有生產(chǎn)規(guī)模的培養(yǎng)基中，刺激該可編碼出目的的融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄作用，其中該宿主細胞已經(jīng)引入目的的可編碼出該蛋白質(zhì)的核酸，操作上該核酸系連接至調(diào)節(jié)序列。接著，自經(jīng)收集的宿主細胞或培養(yǎng)基中分離出該TCR分子?？衫脴藴实鞍踪|(zhì)純化技術(shù)自該培養(yǎng)基或自該經(jīng)收集的細胞分離出目的的蛋白質(zhì)。尤其，該純化技術(shù)可用于自各種培養(yǎng)容器(包含轉(zhuǎn)動瓶、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、組織培養(yǎng)盤、生物反應(yīng)器、或發(fā)酵槽)大規(guī)模(即至少毫克的量)表達及純化出目的的TCR蛋白質(zhì)。
可通過已知的方法分離及純化出經(jīng)表達的本發(fā)明TCR分子。典型地，將培養(yǎng)基進行離心，然后通過親合性或免疫親合性層析法純化該上清液，例如蛋白質(zhì)-A或蛋白質(zhì)-G親合性層析法或免疫親合性方法，包括利用結(jié)合該經(jīng)表達的TCR分子的單株抗體。這些分子可通過適當組合已知的技術(shù)加以分離及純化。這些方法包含，例如，利用溶解度的方法(例如鹽類沉淀及溶劑沉淀法)、利用分子量的差異的方法(例如透析、超過濾法、凝膠過濾法以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)、利用電荷的差異的方法(例如離子交換管柱層析法)、利用特異親合性的方法(例如親合性層析法)、利用疏水性的差異的方法(例如逆相高效能液相層析法)以及利用等電點的差異的方法(例如等電聚焦電泳)、金屬親合性管柱(例如Ni-NTA)。一般參見Sambrook等人及Ausubel等人，如前述所揭示的相關(guān)方法。
本發(fā)明的單鏈TCR分子優(yōu)選為實質(zhì)上純的蛋白質(zhì)。亦即，該分子已自天然伴隨著該分子的細胞取代物中分離出，所以該融合蛋白質(zhì)優(yōu)選系以至少80％或90％至95％的同構(gòu)型(w/w)存在。具有至少98％至99％的同構(gòu)型(w/w)的融合蛋白質(zhì)最適合用于許多醫(yī)藥、臨床及研究的應(yīng)用。在治療應(yīng)用方面，實質(zhì)上經(jīng)純化的融合蛋白質(zhì)實質(zhì)上應(yīng)不含污染物。該蛋白質(zhì)經(jīng)部分純化或?qū)嵸|(zhì)上純時，該可溶性TCR分子(優(yōu)選為單鏈形式)可用于治療或如本文前述的內(nèi)容進行活體外或活體內(nèi)分析?？赏ㄟ^多種標準技術(shù)(例如層析法及交電泳)來決定該融合蛋白質(zhì)實質(zhì)上的純度。
本發(fā)明經(jīng)截斷的TCR分子含有經(jīng)充分地截斷的TCR分子，以致于本發(fā)明的TCR分子于表達后可分泌至培養(yǎng)基中。因此，經(jīng)截斷的TCR分子(sc-TCR、TCR融合物或復(fù)合物)典型地不包含富有疏水性殘基的區(qū)域(典型地為該TCR分子的穿膜及細胞質(zhì)區(qū)域)。因此，例如，本發(fā)明優(yōu)選的經(jīng)截斷的TCR分子中，該TCR分子的β鏈的自約殘基199至237以及該α鏈的自約殘基193至230優(yōu)選系不包含于該經(jīng)截斷的TCR復(fù)合物中。
「可溶性」一詞或類似的名稱系指本發(fā)明的TCR分子(通常，但是不僅指單鏈構(gòu)建體)于低G-力量離心(例如，于標準離心中小于約每分鐘30,000轉(zhuǎn))下不易自水溶性緩沖液(例如細胞培養(yǎng)基)中沉降出來。再者，如果該分子于大于約5至37℃的溫度下以及于低濃度或無陰離子或非-離子性接口活性劑存在下的接近自然的pH時仍保留于水溶液中，該分子系提呈可溶的狀態(tài)。于這些條件下，可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)常具有低沉降值，例如小于約10至50史維德柏里單位(svedberg unit)。
本文所提及的水溶液典型地具有緩沖化合物以建立pH，典型地pH值是落于約5至9的范圍中，以及離子濃度范圍系約2mM及500mM之間。有時會添加蛋白酶抑制劑或溫和的非-離子性接口活性劑。此外，如果需要可添加載體蛋白質(zhì)，例如于每毫升中添加幾毫克的牛血清白蛋白(BSA)或人類血清白蛋白(HSA)。水性緩沖液的實例包含標準的磷酸緩沖鹽水，Tris-緩沖鹽水，或其它已知的緩沖液以及細胞培養(yǎng)基調(diào)配物。
本發(fā)明的TCR分子適合于活體外或各種細胞的活體內(nèi)使用，該細胞系癌細胞、處于癌細胞前期、或腫瘤生成性細胞。與正常細胞(野生型)相較下，這些細胞優(yōu)選可表達高程度的p53蛋白質(zhì)，該等細胞并非已知為癌細胞、處于癌細胞前期、或腫瘤生成性細胞。
本發(fā)明分子尤其適合用于人類病人，該病人具有或懷疑具有與p53不正常表達(例如至少2倍的過度表達)有關(guān)的惡性疾病、病癥或病情。例如，本發(fā)明分子或其衍生物特別適合用于于人類病人中治療與p53不正常表達有關(guān)的腫瘤。依照本發(fā)明，可治療的特定疾病的實例包含癌癥，例如乳癌、前列腺癌等，其它本文所提及的特定疾病的病癥。
本發(fā)明的分子可通過多種適合的途徑給予，包含，口服給予、局部給予(包含經(jīng)皮給予、經(jīng)頰給予或經(jīng)舌下給予)、經(jīng)鼻給予以及非口服給予(包含腹膜內(nèi)給予、皮下給予、靜脈內(nèi)給予、皮內(nèi)給予或肌內(nèi)注射)，一般以口服或非口服優(yōu)選。應(yīng)了解，優(yōu)選的給予方法及劑量會隨著例如，接受者的病情及年齡而改變。有效劑量可通過決定標準臨床治療終結(jié)點加以監(jiān)測，例如腫瘤的抑制、降低癌癥的表達-特定標記(包含p53)、降低細胞增殖、經(jīng)改善或正常的活組織切片檢查結(jié)果等。
本發(fā)明的分子可單獨用于治療或與其它藥物(該藥物已經(jīng)識別對所指示欲治療的病癥具有藥理活性)一起使用。藥物的實例包含經(jīng)識別的治療法，例如手術(shù)、放射線、化學(xué)治療及其它型式的免疫治療(例如疫苗、治療為主的抗體)。本發(fā)明的分子如需要可于這些治療法的前、進行治療法期間或進行治療法的后給予。
本發(fā)明的一或多種分子可單獨給予，其亦可以部分醫(yī)藥組成物(與已知的賦形劑混合)存在，即適合用于非口服、口服或其它目的的給予上的醫(yī)藥可接受性有機或無機載體物質(zhì)，以及其與活性化合物不會造成有毒的反應(yīng)以及對接受者亦不會造成毒性。通常，本發(fā)明的醫(yī)藥組成物包括一或多種本發(fā)明的TCR分子或編碼這些TCR分子的DNA構(gòu)建載體與一或多種可接受載體。思及為了與該配方中其它的成分兼容，該載體必需為「可接受的」以及對接受者亦不會造成毒性。適合的醫(yī)藥可接受載體包含，但不限于水、鹽類溶液、醇、植物油、聚乙二醇、凝膠、乳糖、淀粉醣、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、黏性石蠟、芳香油、脂肪酸單甘油酯及二甘油酯、派卓亞瑟(petroethral)脂肪酸酯、羥甲基-纖維素、聚乙烯基可與輔劑，例如，潤滑劑、防腐劑、安定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖液、著色劑、矯味劑以及/或芳香物質(zhì)等混合，其與本發(fā)明的活性分子不會造成有毒的反應(yīng)。
關(guān)于非口服的施用，特別適合者為溶液、優(yōu)選為油性或水性溶液以及懸浮液、乳液或植入物，包含栓劑。安瓿是方便的單位劑量。
關(guān)于腸道的施用，特別適合者為錠劑，經(jīng)涂覆的藥丸或具有滑石以及/或碳氫化合物載體結(jié)合劑等的膠囊，該載體優(yōu)選為乳糖以及/或玉米淀粉以及/或馬鈴薯淀粉。可使用糖漿、萬能藥等，其中系使用甜味載劑。可調(diào)配持續(xù)釋放的組成物，其中該活性成分系經(jīng)不同的可分解性被覆所保護者，例如微膠囊化、多重被覆等。
本發(fā)明的治療化合物亦可包含于微脂體中。該包入作用可根據(jù)已知的微脂體制備程序進行，例如，超音波處理及擠壓作用。微脂體制備的適合的已知方法亦系揭示于，例如，A.D.Bangham等人，J.Mol.Biol.，23238-252(1965)；F.Olson等人，Biochim.Biophys.Acta，5579-23(1979)；F.Szoka等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，754194-4198(1978)；S.Kim等人，Biochim.Biophys.Acta，728339-348(1983)；以及Mayer等人，Biochim.Biophys.Acta，858161-168(1986)。
本發(fā)明亦提供于哺乳動物(例如人類)中引起免疫反應(yīng)的方法，包含對哺乳動物(例如人類)注射疫苗以對抗與p53過度表達相關(guān)的標記病癥(例如癌癥)。
這些方法包括對哺乳動物給予有效量的DNA序列，該序列包括編碼本發(fā)明的TCR分子的DNA載體。TCR分子表達載體的制備系如上所述以及說明于下列實施例中。已有報導(dǎo)指出質(zhì)體DNA的給予方法、經(jīng)給予者的細胞攝入該DNA的方法以及蛋白質(zhì)的表達。參見Ulmer，J.B.等人，Science(1993)2591745-1749。
可編碼出本發(fā)明TCR分子的DNA載體適當?shù)亟o予至包含人類的哺乳動物的優(yōu)選方式是肌內(nèi)注射。Ulmer等人已說明如何將cDNA給予至哺乳動物的骨骼肌，接著該肌肉細胞攝入經(jīng)給予的表達載體以及表達由該DNA所編碼的蛋白質(zhì)的方式，且提出該實驗方法[Ulmer，J.B.等人，Science 2591745-1749]。于特定治療的施用中，理想的劑量可通過已知方法決定。
除了用于治療人類病癥外，本發(fā)明的TCR分子以及本發(fā)明的可編碼出此種TCR分子的DNA構(gòu)建體于獸醫(yī)方面的應(yīng)用中亦具有顯著的用途，例如，使用適合該動物物種的同源p53抗原以及MHC分子治療家畜(例如牛、羊等)及寵物(例如狗及貓)的病癥。
應(yīng)理解，實際上本發(fā)明TCR分子或可編碼出此種TCR分子的DNA構(gòu)建體于特定治療中優(yōu)選的給予量系根據(jù)特定的活性化合物或所使用的化合物、特定的經(jīng)調(diào)配的組成物、施用形式、給予的特定位置、病人的體重、大致上的健康情況、性別等、治療時的特定指示等以及其它熟知本領(lǐng)域者(包含醫(yī)師或獸醫(yī)人員)所確認的因子而改變。特定給予方法的最理想的給予速度可由熟知本領(lǐng)域者利用已知的劑量決定試驗，例如以關(guān)于前述的指導(dǎo)方針以及本文所揭示的分析法輕易地決定。
「多肽」系指任何聚合物，優(yōu)選為由20種天然的必須氨基酸(不論其大小)的任一者所組成。雖然該「蛋白質(zhì)」一詞經(jīng)常系用于提及相當大的蛋白質(zhì)，而「肽」經(jīng)常系用于提及小的多肽，于此領(lǐng)域中這些名詞的使用經(jīng)常會重疊。「多肽」一詞，除非另有所指，通常系指蛋白質(zhì)、多肽以及肽。依照本發(fā)明，通常有用的肽一般系介于約0.1至100KD或高達約1000KD，優(yōu)選為介于約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之間，這些肽的大小是通過標準分子大小估算技術(shù)(例如離心或SDS-聚丙酰胺凝膠電泳)來評定。
如本文所使用，「細胞」一詞欲包含任何原生細胞或不死化細胞株、任何含有這些細胞的組群、組織或器官。該細胞優(yōu)選為哺乳類細胞，尤其是人類來源的細胞，且可被一或多種病源體感染。根據(jù)本發(fā)明中「宿主細胞」系經(jīng)感染的細胞或可用于增殖本文所述的核酸的細胞(例如大腸菌)。
本文中所有提及的文獻其內(nèi)容在此引入以供參考。下列非限制的實施例是用來說明本發(fā)明。
實施例1264單-鏈(sc)TCR的構(gòu)建該T細胞克隆，264，可識別人類野生型腫瘤抑制物蛋白質(zhì)p53(由HLA-A2.1所限定)的肽片段(aa 264至272；LLGRNSFEV)。將該T細胞受體基因克隆至先前所示的三域單鏈形式以產(chǎn)生可溶性TCR及功能性受體分子。
簡單的說，自該T細胞克隆分離mRNA以及利用Marathon cDNA擴增套組(Clontech)制造cDNA。將cDNA純系進行定序，辨識出兩個Vα鏈(Vα3及Vα13)以及單一Vβ鏈(Vβ3)。于聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)中該cDNA系作為模板，以引子KC228及KC229或KC226及KC227分別產(chǎn)生5’SfiI-3’SpeIVα3或Vα13片段。然后以相同DNA作為PCR模板，利用引子PRIB4及KC176產(chǎn)生5’XhoI-3’XmaIVβCβ鏈片段。將Cβ鏈全長中位于第127個氨基酸，光胺酸，的前的Cβ鏈截斷。
將該α及β鏈片段克隆至該pGEM-T Easy Vector System(Promega)中以進行DNA定序。將正確的片段以限制酶切割且克隆至表達載體pKC60中(說明于前述的申請中的美國專利申請案第08/813,781號)以創(chuàng)造出兩個Vα-(G4S)4VβCβscTCR分子、264-A(帶有Vα3)以及264-B(帶有Vα13)。
將上述的DNA構(gòu)建體(264-A及264-B)分別以引子ET-TCRF1及KC170或ET-TCRF2及KC170通過PCR再次擴增，以產(chǎn)生5’AgeI-3’ClaI DNA片段。將該片段克隆至pGEM-T Easy VectorSystem(Promega)中以進行DNA定序。
然后將該5’AgeI-3’ClaI DNA片段于引子分別為KC232及KC208或KC231及KC208的PCR中作為模板DNA以產(chǎn)生用于克隆至該CD3ζ融合分子(說明如下)的5’AgeI-3’HpaI DNA片段以及最終的264 IL-2融合分子(說明如下)。
實施例2CD3ζ融合穿梭載體(shuttle vector)的構(gòu)建為了確定該兩個Vα鏈系具有功能的，該264-A及264-B scTCR系以CD3ζ融合分子表達。
「穿梭載體」的構(gòu)建已說明于前述申請中的美國專利申請案第09/422,375號中，其內(nèi)容在此引入以供參考。
簡單的說，將α及β鏈TCR片段克隆至表達載體pKC60中以創(chuàng)造出Vα-(G4S)4VβCβscTCR分子。將該新的載體命名為pNAG2(第9圖)。然后將pNAG2于引子為KC203及KC208的PCR中再次擴增，以產(chǎn)生5’AgeI-3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNA片段。將該scTCR片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中，以及然后將此以pGEM為主的新的載體作為「穿梭載體」，用于引入其它DNA片段以創(chuàng)造雙特異性sc分子。
將Sc-Fv DNA以限制酶切割以及克隆至該scTCR的「穿梭載體」的下游。為了將scTCR及sc-Fv連接成單鏈融合蛋白質(zhì)，遂以適當?shù)南拗泼盖懈钤摗复┧筝d體」，以脫離先前的連接子DNA片段以及使sc-TCR及Sc-Fv間的連接子序列接合。
于上述的「穿梭載體」的設(shè)計中，將終止密碼及接合位置引入至該NruI及ClaI限制酶位置之間作為帶有「后」引子KC208的scTCR的PCR擴增之一部分。為了幫助接下來進行的雙特異性sc蛋白質(zhì)的純化，設(shè)計了一組經(jīng)退火的寡核苷酸(annealed oligonucleotides)(KC237及KC238)以引入帶有終止密碼及接合位置的3’EE卷標(EEEEYMPME)(SEQ ID NO.4)。該經(jīng)退火的寡核苷酸對將5’NruI-3’ClaI克隆至該已可編碼出完整的雙特異性sc-TCR分子的「穿梭載體」中。
將scTCR、sc-Fv、連接子，以及卷標DNA片段克隆至該「穿梭載體」中以完成該雙特異性sc分子的設(shè)計后，以限制酶切割(AgeI-ClaI)該DNA，然后克隆至哺乳動物細胞表達載體pSUN27(第2圖)(說明于前述的申請中的美國專利申請案序號第08/943,086號)以創(chuàng)造pBISP/149以及pBISP/D011.10(第3圖)。熟于本領(lǐng)域的人士可利用pBISP/149(以pSUN28寄存)與任三個D011.10scTCR質(zhì)體(pSUN18-ATCC#97895、pSUN19-ATCC#97896、或pSUN27-ATCC#209276)來產(chǎn)生pBISP/D011.10。該USSN 08/943,086的內(nèi)容在此引入以供參考。
CD3ζ融合載體的構(gòu)建簡單的說，以鼠的cDNA作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的模板，以引子KC312及KC304產(chǎn)生5’HpaI-3’ClaI鼠CD3ζ片段。
將該鼠CD3ζ片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中以進行DNA測序。將正確的片段以限制酶切割以及克隆至「穿梭載體」中，有效地移除該存在的連接子、scFv以及EE卷標。
將該CD3ζ基因克隆至該「穿梭載體」中后，以限制酶切割該DNA的AgeI-HpaI處，使其與該264-A及264-B scTCR片段(如上所述)接合，創(chuàng)造出兩個新的scTCR/CD3ζ融合物。最后，將該新的DNA制備物以限制酶切割(AgeI-ClaI)，然后克隆至哺乳動物細胞表達載體pSUN28(pBISP/D011.10)，第3圖，說明于前述申請中的美國專利申請案序號第09/422,375號。
實施例3264scTCR/CD3ζ融合分子的表達將茱凱細胞(Jurkat cell)以冷的DPBS洗滌，預(yù)備用于轉(zhuǎn)染作用。將該細胞懸浮于DPBS中且與20ug的以PvuI直線化的264-A/CD3ζ或264-B/CD3 DNA混合。至于冰上5分鐘后，利用基因脈沖器(GenePulser，BioRad)，設(shè)定為傳送250伏特、960μFd的脈沖對該細胞進行電穿孔處理。將經(jīng)脈沖處理的細胞置于冰上5分鐘。將該細胞以10％IMDM培養(yǎng)基(IMDM、10％FBS、2mM谷胺酰胺)稀釋成10ml，以及使該細胞在37℃及5％CO2環(huán)境下生長于T-25平方公分的TC培養(yǎng)皿中一整夜。隔日，將該細胞置于含有選擇性培養(yǎng)基(10％ IMDM加上1.0mg/mlG418)的96孔盤中。一星期后，將G418的濃度增加到2mg/ml。轉(zhuǎn)染后，將生長的細胞群再培養(yǎng)約2星期以及約于一星期后進行篩選。
利用流式細胞分析法(flow cytometry analysis)篩選出于細胞表面上有scTCR表達的茱凱細胞。呈陽性的轉(zhuǎn)染物系以經(jīng)螢光-標記的mAb(H57-597)染色進行識別，該經(jīng)螢光-標記的mAb可檢測鼠TCR的Cβ部分結(jié)構(gòu)域。
實施例4正確的264scTCRVα結(jié)構(gòu)域的識別將經(jīng)轉(zhuǎn)染的茱凱細胞(可表達CD3ζ融合分子的264-A或264-B變體)用于細胞活化分析。該分析中，將HLA-A2(于細胞株T2存在下)作為APC。于37℃及5％CO2環(huán)境下將該T2細胞以264肽(或不恰當?shù)碾?裝載一整夜。隔日，加入該經(jīng)轉(zhuǎn)染的茱凱細胞株以及使其與該肽脈沖的APC進行交互作用一整夜。
該轉(zhuǎn)染物通過經(jīng)264裝載的APC所進行專一性的刺激是利用IL-2ELISA評估的。將抗-人類IL-2mAb涂覆于96孔盤上整夜。洗滌該盤以及以10％FBS/DPBS阻斷1小時。將阻斷劑彈掉以及于37℃下將得自該分析的上清液加入至該盤中反應(yīng)1小時。經(jīng)洗滌后，利用另一個共軛至生物素的抗-IL-2mAb來檢測經(jīng)結(jié)合的IL-2。于37℃下45分鐘后，洗滌該盤以及加入抗生物素蛋白鏈菌素(strepavidin)-HRP反應(yīng)15分鐘。最后，洗滌該盤以及使用ABTS受質(zhì)顯色。于405nm讀取吸光度。
基于細胞活性分析，該Vα3區(qū)域系具有功能的。只有于經(jīng)264裝載的APC存在下，該264-A分子經(jīng)刺激而產(chǎn)生IL-2。
表1，如下頁所示，顯示出前述實施例中所使用的各種寡核苷酸之一級序列。
表1

雖然本發(fā)明的優(yōu)選具體實施例已使用特定術(shù)語說明，這些描述僅供說明的目的，且應(yīng)了解在不悖離下列權(quán)利要求的精神及范圍下可進行各種改變及變化。
權(quán)利要求
1.一種分離的T細胞受體(TCR)，包括Vα及Vβ鏈，該T細胞受體可與MHC分子中的p53肽結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的TCR，其中所述的p53肽包括下列氨基酸序列Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的TCR，其中所述的MHC分子包括HLA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的TCR，其中所述的HLA分子包括HLAA2.1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的分離的TCR，其中所述的α鏈包括共價連接的序列a)Vα鏈及b)Cα鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的分離的TCR，其中所述的β鏈包括共價連接的序列c)Vβ鏈以及Cβ序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的分離的TCR，其中所述的結(jié)合是通過監(jiān)測該TCR與MHC分子的結(jié)合而決定，該MHC分子是與如SEQID NO.1的氨基酸序列的肽復(fù)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的TCR，其中所述的結(jié)合作用是利用TCRELISA或標準TCR結(jié)合分析進行監(jiān)測。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的TCR，其中所述的結(jié)合作用是由測量TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行監(jiān)測。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項所述的分離的TCR，其中，與對照組TCR雜二聚體相較下，該氨基酸序列與TCR分子間的結(jié)合作用增加了至少2倍。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項所述的分離的TCR，其中，相對于對照組TCR雜二聚體，該氨基酸序列與TCR雜二聚體間的結(jié)合作用增加了至少10％。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的分離的TCR，其中所述的Vα鏈與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)中所示的Vα3鏈具有至少90％的氨基酸序列同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項所述的分離的TCR，其中所述的Vβ鏈與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)中所示的Vβ3鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的分離的TCR，還包括與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)中所示的Cβ鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性的Cβ序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項所述的分離的TCR，其中所述的Cα鏈與第5圖(SEQ ID NO.3)中所示的Cα鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的分離的TCR，其中所述的TCR包括一雜二聚體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項所述的分離的TCR，其中所述的TCR包括單鏈TCR。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的單鏈TCR(scTCR)，其中所述的Vα鏈是通過肽連接子序列而共價連接至Vβ鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求17至18任一項所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR包括穿膜結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19任一項所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR包括細胞質(zhì)信號結(jié)構(gòu)域。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20任一項所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR依序包括1)如第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vα3鏈，2)肽連接子，以及3)如第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3鏈。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的sc-TCR，還包括如第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所提供的經(jīng)連接至Vβ3鏈的C端的Cβ鏈。
23.根據(jù)權(quán)利要求21至22任一項所述的sc-TCR，還包括如第5圖(SEQID NO.3)所提供的Cα鏈的片段，該片段是共價連接至Vα鏈的C端與肽連接子的N端間。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項所述的sc-TCR，其中所述的肽連接子具有下列序列Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID5)重復(fù)至少4次。
25.一種分離的核酸，其中該核酸可編碼根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項所述的TCR。
26.一種載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸。
27.一種細胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求25所述的分離的核酸或根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體。
28.一種可編碼權(quán)利要求16所述的雜二聚體的DNA對片段，其中，第一DNA片段可編碼該Vα鏈以及第二DNA片段可編碼該Vβ鏈。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的DNA對片段，其中，經(jīng)編碼的Vα鏈與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vα3鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性。
30.根據(jù)權(quán)利要求28至29所述的DNA對片段，其中，經(jīng)編碼的Vβ鏈與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30所述的DNA對片段，其中所述的第二片段進一步可編碼Cβ鏈，Cβ鏈該與第4A至C圖(SEQ ID NO.2)所示的Cβ鏈具有至少約90％的氨基酸序列同一性，該經(jīng)編碼的V-β鏈的C端是與該經(jīng)編碼的Cβ鏈的C端連接。
32.一種鑒別表達p53的細胞或組織的方法，包括使細胞或組織與權(quán)利要求1至24任一項所述的TCR接觸。
33.一種鑒別表達p53的細胞或組織的方法，包括使細胞或組織與權(quán)利要求27所述的細胞接觸。
34.一種殺死表達p53于MHC分子中的細胞的方法，該方法包括使細胞與權(quán)利要求27所述的細胞接觸。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的方法還包括使MHC分子與表達于權(quán)利要求27所述的細胞上的TCR形成免疫復(fù)合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的方法還包括誘發(fā)足以殺死該細胞的免疫反應(yīng)。
37.一種治療癌癥的方法，包括對哺乳動物給予治療上有效量的權(quán)利要求1至24任一項所述的TCR，該癌癥是以向上調(diào)的p53為特征。
38.一種治療癌癥的方法，包括對哺乳動物給予治療上有效量的權(quán)利要求27所述的細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種T細胞受體(TCR)分子，它可以與衍生自p53蛋白質(zhì)的肽結(jié)合，特別是人類p53蛋白質(zhì)。該TCR分子包含雜二聚分子以及單鏈分子，且該TCR分子特異性地結(jié)合至顯現(xiàn)于上下文的HLA分子系統(tǒng)，特別是HLA－A2.1中的p53蛋白質(zhì)的一個序列段，尤其是氨基酸264－273的位置。本發(fā)明還揭示了制造及使用這類TCR分子的方法。本發(fā)明具有廣泛的用途，包括治療用途以及檢測表達p53蛋白質(zhì)的細胞的用途。
文檔編號C12N5/10GK1692124SQ02815303
公開日2005年11月2日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月5日
發(fā)明者L·A·舍曼, K·F·卡德, J·A·韋丹茲, H·C·王, E·L·湯姆森 申請人:阿爾特生物科學(xué)公司, 斯克里普斯研究院