專利名稱：控制細(xì)胞融合的方法和相關(guān)組合物的制作方法
相關(guān)申請本申請是1994年12月13日提交的美國專利申請No.08/354,944的部分延續(xù)。該參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。
本發(fā)明的背景本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療致弱的、致死性的、遺傳性的、退化性的和/或不良的哺乳動物疾病的組合物和方法。具體地說，本發(fā)明涉及將正常的、或遺傳工程轉(zhuǎn)導(dǎo)的、或細(xì)胞系轉(zhuǎn)換(cytocline-converted)的生肌細(xì)胞移植到功能障礙的和/或退化的組織或器官。
現(xiàn)有技術(shù)的描述成肌細(xì)胞特性在哺乳動物中，成肌細(xì)胞是唯一的一種分布廣泛、可遷移、自然融合形成合胞體、融合后迅速失去其主要組織相容性一級抗原(MHC-1)、并發(fā)展至占人體50％體重的細(xì)胞。這些特性使得成肌細(xì)胞可以理想地用于基因轉(zhuǎn)移和體細(xì)胞治療(SCT)。成肌細(xì)胞治療是體細(xì)胞治療和基因治療的結(jié)合。成肌細(xì)胞治療雖然成肌細(xì)胞/衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉生成和肌肉再生中的作用可追溯到20世紀(jì)六十年代初(Konigsberg，I.R.，科學(xué)，1401273(1963)。Mauro，A.J.，Biophys.Biochem.Cytol.，9493-495(1961))，但其用于動物的治療直到1978年才見報(bào)道(Law，P.K.，Exp.Neurol.，60231-2431978))。
1990年2月15日，首例成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療(MTT)一位患杜興氏肌營養(yǎng)障礙(DMD)的男孩，標(biāo)志著人類基因轉(zhuǎn)移的首例臨床試驗(yàn)。已報(bào)道其成功(Law.P.K.等人，Lancet，336114-115(1990)；Kolata，G.紐約時(shí)報(bào)，，星期天，(1990年6月3日))。骨髓移植嚴(yán)格地以正常細(xì)胞取代遺傳異常的細(xì)胞，與之不同，成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療通過自然的細(xì)胞融合實(shí)際上將供體成肌細(xì)胞核內(nèi)的所有正?；虿迦氲綘I養(yǎng)障礙肌纖維中而修復(fù)它。此外，供體的成肌細(xì)胞之間也相互融合，形成遺傳正常的肌纖維以取代退化的部分。這樣，通過再生的自然發(fā)展過程，全部正?；虮徽系疆惓＜?xì)胞和異常器官中。
美國專利局1992年7月14日給本發(fā)明人授予了名為“治療肌肉退化及虛弱的組合物和方法”的專利(#5,130,141)。
1993年10月，食品及藥物管理局(FDA)正式地開始管理體細(xì)胞治療(SCT)，將之定義為“經(jīng)繁殖、擴(kuò)增、篩選、藥物處理、或通過間接體外生物學(xué)特征篩選的自體固有的、異常發(fā)生的、或異體的細(xì)胞，用于人體預(yù)防、處理、治療、診斷、或減輕疾病或損傷”。(聯(lián)邦注冊，5853248-53251(1993))。
成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療(MTT)屬于體細(xì)胞治療(SCT)的范圍，成肌細(xì)胞及其自然的、遺傳工程的或化學(xué)的衍生物成為潛在治療哺乳動物疾病的生物學(xué)方法。
1994年5月25日，F(xiàn)DA準(zhǔn)予細(xì)胞治療研究基金會(CTRF)對每個(gè)患者收費(fèi)63806美元。CTRF是由本發(fā)明人于1991年創(chuàng)建的一個(gè)非贏利的研究基金會。FDA批準(zhǔn)CTRF向這些臨床試驗(yàn)患者收取治療費(fèi)用，對于建立MTT和CTRF應(yīng)得到的科學(xué)可信度是極為重要的，引用1994年6月17日Memphis健康治療新聞的一段話“很少批準(zhǔn)允許為一項(xiàng)研究性產(chǎn)品付費(fèi)”，F(xiàn)DA發(fā)言人Monica Revelle說，“申請人必須經(jīng)過許許多多的過程，而且必須有在一系列近于科學(xué)幻想的研究之后看來似乎可行的產(chǎn)品。這主要用于支持對小公司的有前途的技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn)”。這是關(guān)于CTRF研究的描述。
現(xiàn)在，CTRF正在進(jìn)行第一項(xiàng)、也是唯一的FDA批準(zhǔn)的申請MTT的研究中新藥(IND)的人體臨床試驗(yàn)。這對于認(rèn)識CTRF已經(jīng)和FDA在用于遺傳細(xì)胞治療的該IND的批準(zhǔn)過程中為建立標(biāo)準(zhǔn)和政策進(jìn)行了密切的合作，是極為重要。用病毒載體介導(dǎo)的基因治療用于人類神經(jīng)肌肉疾病還沒有通過FDA批準(zhǔn)。用成肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療細(xì)胞是所有生命的基本單位。生命正是由這些無數(shù)的小實(shí)體形成的。用人類的巨大智慧和知識，我們還不能從非生命的成分，如DNA、離子和生化物質(zhì)生產(chǎn)出活的細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)是已知的人類能夠體外復(fù)制細(xì)胞的唯一方法。用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和預(yù)防措施，可以培養(yǎng)正常細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞至足夠量以修復(fù)和代替退化和損傷的組織。
細(xì)胞移植彌補(bǔ)體外和體內(nèi)系統(tǒng)間的間隙，并使得“新生命”能在已有遺傳缺陷或機(jī)體損傷的生命體內(nèi)的退化組織或器官繁殖。
細(xì)胞融合將細(xì)胞核內(nèi)所有正常的基因，象送去一個(gè)修理盒一樣，轉(zhuǎn)移到異常細(xì)胞內(nèi)。為了正確安裝及進(jìn)一步操作，染色體上的軟件還需要其它細(xì)胞器作為硬件來操作，認(rèn)識到這一點(diǎn)非常重要。
細(xì)胞融合后，基因缺陷的修正自發(fā)地發(fā)生在細(xì)胞水平。全部80,000個(gè)正?；虻淖匀徽稀⒄{(diào)控和表達(dá)，將正常表型傳遞給異核體。因?yàn)樗拗骰蚪M具有遺傳缺陷，宿主基因組不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或因子是由供體的正?；蚪M產(chǎn)生的。來源于其它基團(tuán)表達(dá)的不同輔因子證實(shí)了正常表型的恢復(fù)。用成肌細(xì)胞進(jìn)行基因治療本發(fā)明人在用成肌細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)移的載體方面已經(jīng)作了廣泛研究。在哺乳動物中，成肌細(xì)胞是唯一的一種分布廣泛、可遷移的、自然融合形成合胞體，融合后迅速失去MHC-1抗原，并發(fā)展至占人體50％體重的細(xì)胞。這些復(fù)合特性使其可理想地用于基團(tuán)轉(zhuǎn)移。
正常細(xì)胞核的自然轉(zhuǎn)導(dǎo)確保DMD患者的營養(yǎng)障礙蛋白(dystrophin)和相關(guān)蛋白質(zhì)在細(xì)胞水平的有序取代。這種理想的基因轉(zhuǎn)移過程對于肌肉而言是獨(dú)有的。畢竟在人體內(nèi)只有成肌細(xì)胞能夠融合并且唯有肌纖維是多核的。正是利用了這些固有的特征，MTT才能轉(zhuǎn)移所有正?；蛞杂行У剡M(jìn)行基因修復(fù)。在MTT中供體的成肌細(xì)胞間相互融合，形成正常肌纖維，肌肉也從加入遺傳正常細(xì)胞獲益。成肌細(xì)胞治療是未來醫(yī)學(xué)健康是所有人體細(xì)胞處理良好狀態(tài)。在遺傳性或退化性疾病中，病態(tài)細(xì)胞需要修復(fù)，死亡細(xì)胞需要取代，以保持健康。
細(xì)胞培養(yǎng)是產(chǎn)生新的、活的細(xì)胞，使之移植到人體后能夠存活、發(fā)展、并具正常功能、取代失去功能的退化細(xì)胞的唯一途徑。
成肌細(xì)胞是人體內(nèi)唯一能夠進(jìn)行自然細(xì)胞融合的細(xì)胞。自然細(xì)胞融合使全部正常基因轉(zhuǎn)移至遺傳缺陷細(xì)胞，通過彌補(bǔ)缺陷進(jìn)行有效的表型修復(fù)。DMD的MTT治療法是第一個(gè)安全、有效的人類基因治療法。用MTT轉(zhuǎn)移其它基因及其啟動子/增強(qiáng)子用以治療其它疾病的工作正在進(jìn)行。成肌細(xì)胞是有效、安全、通用的基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗鼘τ跈C(jī)體是內(nèi)源性的。由于外源性基因總能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其作用，細(xì)胞治療將永遠(yuǎn)是通向健康的常用途徑。畢竟細(xì)胞是生命的基礎(chǔ)。
DMD疾病示例DMD是一種遺傳的、退化的、使人衰弱的、致死的和不良的哺乳動物疾病。它以進(jìn)行性肌肉退化和力量減弱為特征。這些癥狀開始于3歲或更小并貫穿整個(gè)病程。每3300名男性人口中有1人由于DMD而衰弱并死亡，DMD是居第二位的人類最常見的致死性遺傳疾病。典型的DMD患者在12歲靠輪椅代步，75％的患者在20歲前死亡。由于伴有呼吸肌退化，不能吸入足夠氧氣和排除肺部感染，肺炎通常是DMD的急性死因。10％的DMD患者在青春期中段發(fā)展至心肌病癥狀。18歲前，所有DMD患者發(fā)展為心肌病，但心衰很少是原發(fā)死因。
1950年前，對80多種化合物進(jìn)行了評價(jià)并報(bào)道有33種可能有效(Milhorat.A.T.，哥倫比亞地區(qū)醫(yī)學(xué)年鑒，2315(1954))。沒有一種現(xiàn)在仍在使用(Wood，D.S.，InKakulas，B.A.and Mastaglia，F(xiàn).L.，eds.杜興氏和貝氏肌營養(yǎng)障礙的病理和治療。New YorkRavenPress；85-99(1990))。未肯定的DMD治療報(bào)道有用維生素、氨基酸(Van Meter.J.R.，加州醫(yī)學(xué)，79297(1953))，ATR(Nakahara，M.，Arzneim.Forsch.，15591(1965))，輔酶Q(Folkers，K.等人，Excerpta Med.Int.Congr.Ser.，334158(1974))，腺苷酸琥珀酸(Bonsett，C.A.，印第安那醫(yī)藥，79236(1986))，以及生長激素抑制劑(Coakley，J.H.等人，Lancet，1(8578)184(1988))。篩選了數(shù)百種藥物(Wood，同上)，一些研究表明類固醇是有效的(Entrikin，R.K.等人，肌肉神經(jīng)，7130-136(1984))。
首次報(bào)道強(qiáng)的松對DMD有效大約已有20年(Drachman，D.B.等人，Lancet，21409-1412(1974))。研究者報(bào)道，強(qiáng)的松能延緩?fù)嘶^程，而且在一些病例中甚至短暫地增強(qiáng)肌肉力量。這些證明強(qiáng)的松效果的證據(jù)不是沒有爭議(Munsat，T.L.and Walton，J.N.，Lancet，1276-277(1985)；Rowland，L.P.，Lancet，1277(1975)；and Siegel，I.M.等人，I.M.J.14532-33(1974))。雖然強(qiáng)的松的作用機(jī)制還沒有確定。強(qiáng)的松引起的眾多的副作用，以及長期使用引起的反作用，已經(jīng)超過了報(bào)道的有爭議的正面效果。
基因操作和基因轉(zhuǎn)移是正在被用來治療遺傳性和退化性疾病的另一途徑。然而，這種治療方法應(yīng)用于DMD的臨床仍需要相當(dāng)長一段時(shí)間(Law，P.K.InKakulas，B.A.等人，eds.杜興氏和貝氏肌營養(yǎng)障礙的病理和治療。紐約Raven Press，190(1990)；and Watsson，J.D.等人，重組DNA.New YorkW.H.Freeman and Co.；576(1992))。據(jù)稱肌肉內(nèi)注射DNA獲得成功(AcsadG.等人，自然，352815-818(1991)；and Wolff，J.A.等人，科學(xué)，2471465-1468(1990))而動脈內(nèi)釋放不成熟的肌細(xì)胞(或稱為成肌細(xì)胞)到骨骼肌(Neumeyer，A.M.等人，神經(jīng)學(xué)，422258-2262(1992))則極為有限并仍存疑問。試圖使用轉(zhuǎn)染的自身固有的成肌細(xì)胞導(dǎo)致了較低的功效以及轉(zhuǎn)染過程中產(chǎn)生突變(Barr，E.and Laideh，J.M.，科學(xué)，2541507-1509(1991)；Dhawom，J.等人，自然，2541509-1512(1991)；and Smith，B.F.等人，分子細(xì)胞生物學(xué)，103268-3271(1990))。這種途徑將難以產(chǎn)生足夠的生肌細(xì)胞以提供全身成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法(MTT)治療DMD病人(Law，同上)。基于轉(zhuǎn)基因鼠研究的囊性纖維變性(CF)的臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行(Hyde，S.C.等人，同上，362250-255(1993))。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)的基因治療的臨床試驗(yàn)也已經(jīng)進(jìn)行。CF和SCID的遺傳缺陷是通過酶缺失介導(dǎo)的，與之不同，DMD的遺傳缺陷表現(xiàn)為細(xì)胞膜上的稱之為營養(yǎng)障礙蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白的缺失，而不是調(diào)節(jié)蛋白缺失。
雖然營養(yǎng)障礙蛋白在評價(jià)肌肉改善方面可作為一個(gè)好的遺傳學(xué)/生物化學(xué)指征(Hoffman，E.P.等人，Cell，51919-928(1987))，但營養(yǎng)障礙蛋白的替換僅構(gòu)成治療過程的一部分。這已經(jīng)被本發(fā)明者和其他人用MTT在對以下對象的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)mdx鼠(Chen，M.等人，細(xì)胞移植，117-22(1992)；Karpati，G.等人，美國病理雜志，13527-32(1989)；and Patridge，T.A.，等人，自然，337176-179(1989))以及人(Gussoni，E.，等人，自然，356435-438(1992)；Huard，J.等人，臨床科學(xué)，81287-288(1991)；Huard，J.等人，肌肉神經(jīng)，15550-560(1992)；Law，P.K.等人，Lancet，336114-115(1990)；Law P.K.et al.，Acta Paediatr.Jpn.，33206-215(1991)；Law P.K.et al.，Adv.臨床神經(jīng)科學(xué)，2463-470(1990)；Law，P.K.et al.，InAngelini，C.et al.，eds.肌營養(yǎng)障礙研究。紐約Elsevier科學(xué)出版社，109-116(1991)；and LawP.K.et al.，Acta Cardiomilogica，3281-301(1991))。由于DMD的病理是肌肉的退化和衰弱，結(jié)構(gòu)尤其是功能的改善是首先需要考慮的。這兩個(gè)參量已經(jīng)被用dy2Jdy2J營養(yǎng)障礙鼠作為遺傳性肌肉退化的動物模型進(jìn)行了廣泛的研究(Law，P.K.，實(shí)驗(yàn)神經(jīng)學(xué)，60231-243(1978)；Law，P.K.，肌肉神經(jīng)，5619-627(1982)；Law，P.K.et al.，移植進(jìn)展，201114-1119(1988)；Law，P.K.et al.，InGriggs，R.C.；Karpat；G.，eds.成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療。NewPlenum Press；75-87(1990)；Law，P.K.et al.，肌肉神經(jīng)，11525-533(1988)；Law，P.K.et al.，In Kakulas，B.A.；Mastaglia，F(xiàn).L.，eds.杜興氏和貝氏肌營養(yǎng)障礙病理和治療，紐約Raven Press；101-118(1990)；andLaw，P.K.and Yap，J.L.，肌肉神經(jīng)，2356-363(1979))。這些研究導(dǎo)致了首例MTT臨床試驗(yàn)或單肌肉治療(SMT)(Gussoni，E.et al.，自然，356435-438(1992)；Huard，J.et al.，臨床科學(xué)，81287-288(1991)；Huard，J.et al.，肌肉神經(jīng)，15550-560(1992)；Law，P.K.，et al.，Lamcet.336114-115(1990)；Law，P.K.et al.，Acta Paediatr.Jpn.，33206-215(1991)；Law，P.K.et al.，高級臨床神經(jīng)科學(xué)，2463-470(1992)；Law，P.K.et al.，InAngelini，C.et al.，eds.肌營養(yǎng)障礙研究，紐約Elsevier SciencePublishers109-116(1991)；and Law，P.K.et al.，ActaCardiomiologica 3281-301(1991))。
本發(fā)明者通過下肢治療實(shí)驗(yàn)，對MTT的可行性、安全性和有效性進(jìn)行了評價(jià)。病例包括32位年齡在6-14歲的男性患者，其中一半不能步行(Law，P.K.et al.，細(xì)胞移植，2485-505(1993))。通過48次注射，將50億(55.6×106/ml)個(gè)正常成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到每個(gè)病者的雙下肢的22個(gè)主要肌肉中。除其他情況外，MTT治療9個(gè)月后結(jié)果表明，(1)MTT是一種安全的治療方法；(2)改善了DMD患者的肌肉功能；(3)50億以上的成肌細(xì)胞對于改善6～14歲DMD男性患兒的雙下肢肌肉力量是必要的。其它疾病狀況MTT可能對任何遺傳性疾病均有效。通過自然的細(xì)胞融合，將供體成肌細(xì)胞的全部正?；虿迦氲竭z傳功能異常細(xì)胞內(nèi)去修復(fù)它。缺陷基因的啟動子和增強(qiáng)子將被提供、或激活、或抑制，以獲得基因轉(zhuǎn)錄和翻譯從而使移植和生肌細(xì)胞中釋放激素或酶。同樣地，能產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)蛋白以預(yù)防或減輕疾病癥狀。
轉(zhuǎn)導(dǎo)的成肌細(xì)胞可以被選擇使用。其過程包括a)從患者體內(nèi)取肌肉活組織，b)用正?；蜣D(zhuǎn)染一個(gè)“種子”量的衛(wèi)星細(xì)胞，c)確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生肌性，d)擴(kuò)增被轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞至足夠產(chǎn)生有效作用的數(shù)量，以及e)將成肌細(xì)胞施入患者體內(nèi)。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體已被用于在原代培養(yǎng)時(shí)，在允許轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞分化為表達(dá)轉(zhuǎn)移的基因的肌管的條件下，將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到鼠和狗的成肌細(xì)胞內(nèi)(Smith，B.F.et al.，分子細(xì)胞生物學(xué)，103268-3271(1990))。而且，小鼠注射了轉(zhuǎn)染了人生長激素(hGH)的鼠成肌細(xì)胞后，在肌肉和血清中表現(xiàn)出顯著的hGH水平，并保持3個(gè)月(Dhawan，J.et al.，科學(xué)，2541509-1512(1991)；Barr E.and J.M.Leiden，科學(xué)，2541507-1509(1991))。
經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受一種類似于腺苷脫氨酶(ADA)缺損途徑的激勵(lì)。在ADA缺損狀態(tài)下，來自患者的T細(xì)胞功能性ADA基因轉(zhuǎn)染后，通過對已轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)增殖，再回輸給患者(Culver，K.W.et al.，移植進(jìn)展，23170-171(1991))。
用遺傳工程轉(zhuǎn)導(dǎo)的成肌細(xì)胞治療其它疾病的類似途徑也已進(jìn)行了動物試驗(yàn)，如血友病B(Yao，S.N.et al.，基因治療，199-107(1994))，心肌病(Marelli，D.，細(xì)胞移植，1383-390(1992)；Koh，G.Y.et al.，臨床觀察雜志，921548-1554(1993))，貧血(Hamamori，Y.et al.，人類基因治療，51349-1356(1994))。毫無疑問，成肌細(xì)胞治療將用于許多遺傳性疾病的治療。
成肌細(xì)胞雖然已分化，但仍然是能去分化或甚至轉(zhuǎn)換的胚細(xì)胞。最近表明成肌細(xì)胞在骨形成蛋白-2作用下可以轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞(Katagiri，T.et al.，J.Cell Biol.，127-1755-1766(1994))。該研究表明，細(xì)胞素轉(zhuǎn)化的成肌細(xì)胞可用于骨/軟骨退化疾病患者的治療。相應(yīng)地還表明，鼠的皮膚成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為生肌細(xì)胞譜系(Gibson，A.J.et al.，J.細(xì)胞科學(xué)，108207-214(1995))。
用成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療方法治療癌癥和II型糖尿病的糖尿癥的有關(guān)應(yīng)用在下文描述。為什么進(jìn)行成肌細(xì)胞治療在遺傳性或退化性疾病中，基因缺陷導(dǎo)致細(xì)胞隨時(shí)間退化并死亡。有效的治療不僅必須修復(fù)退化的細(xì)胞，而且要補(bǔ)充死亡細(xì)胞。這最好是通過遺傳上正常的細(xì)胞的移植或體細(xì)胞治療方法來實(shí)現(xiàn)。分子遺傳學(xué)的出現(xiàn)促進(jìn)了單基因操作，后者目前正被探索用于治療遺傳性疾病。象藥物一樣，單基因操作不能補(bǔ)充失去的細(xì)胞，而且能證明這種途徑可修復(fù)退化細(xì)胞的證據(jù)非常有限。
在美國專利No.5,130,141中，發(fā)明者首次公開了治療肌肉退化和衰弱的組合物和方法。該組合物包括將從供體獲得的遺傳正常的成肌細(xì)胞注射到患有遺傳性神經(jīng)肌肉紊亂患者宿主的一個(gè)或多個(gè)肌肉組織中。注入后肌肉結(jié)構(gòu)和功能顯著地改善，從而預(yù)防和減輕肌肉虛弱，后者是導(dǎo)致遺傳性肌肉營養(yǎng)障礙患者致殘和呼吸衰竭的主要原因。這種將遺傳正常的肌肉細(xì)胞移植到患遺傳性肌肉營養(yǎng)障礙患者的病態(tài)肌肉的方法被稱為MTT。
MTT與通常的單基因轉(zhuǎn)移形式在許多方面有顯著不同。在單基因治療中，低分子的、小的營養(yǎng)障礙基因的單基因拷貝被作為病毒的軛合物轉(zhuǎn)導(dǎo)到成熟的營養(yǎng)障礙的肌纖維中，該肌纖維缺失許多蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。多基因插入對于修復(fù)這些缺失蛋白是必要的(

圖1)。需要更多的基因插入以產(chǎn)生輔因子來調(diào)節(jié)和表達(dá)這些失去的蛋白，從而修復(fù)退化的細(xì)胞。
發(fā)明概要成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療MTT的初步的可行性、安全性和有效性的結(jié)果(Law et al.，細(xì)胞移植，2485(1992))促使本發(fā)明人開始了一項(xiàng)全身整體試驗(yàn)(WBT)，分別將250億個(gè)成肌細(xì)胞注射到64例杜興氏肌肉營養(yǎng)障礙(DMA)男孩和1例嬰兒面肩胛骨營養(yǎng)障礙(IFSH)男孩的體內(nèi)。得到FDA和Essex IRB(IND II期)認(rèn)可的隨機(jī)的雙育法臨床試驗(yàn)方案包括兩個(gè)MTT療程，間隔3～9個(gè)月。每個(gè)療程進(jìn)行200次注射或釋放125億個(gè)成肌細(xì)胞至患者上肢的28塊肌肉(VBT)或者下肢的36塊肌肉(LBT)。注射的肌肉包括頸部、肩部、背部、胸部、腹部、臂部、臀部和腿部肌肉。每次MTT療程后受試者口服環(huán)孢菌素3個(gè)月。在過去的17個(gè)月里，1例IFSH和10例DMD男孩接受了全身整體治療試驗(yàn)(WBT)，另外20例DMD男孩接受了UBT或LBT，未出現(xiàn)有害作用。這些初步結(jié)果表明WBT是可行和安全的。育法試驗(yàn)將繼續(xù)進(jìn)行，直到研究結(jié)束，以確定哪一組的肱二頭肌或股四頭肌接受了成肌細(xì)胞或安慰劑，在MTT治療3～9個(gè)月的一次組織活檢中已有5例表現(xiàn)出有肌營養(yǎng)缺陷蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)。而對應(yīng)組的肌肉活組織檢查表現(xiàn)沒有肌營養(yǎng)缺陷蛋白。MTT治療后3～6個(gè)，超過80％的受試者的肺功能(FVC)表現(xiàn)無衰退或者增強(qiáng)了15～25％。約50％受試者報(bào)告在跑步、平衡、爬梯和打球方面行為改善。1例14歲DMD受試者在MTT治療后不需要輪椅就可以活動(Law，P.K.et al.，美國神經(jīng)移植科學(xué)摘要，p27(1995)；Law，P.K.et al.，應(yīng)用細(xì)胞生物化學(xué)，21A367(1995))。
施用300億成肌細(xì)胞于受試人的可行性和安全性的結(jié)果為成肌細(xì)胞用作生物學(xué)方法治療人類疾病提供了關(guān)鍵性的證據(jù)。劑量效應(yīng)結(jié)果進(jìn)一步證明了這一設(shè)想成肌細(xì)胞治療能用來治療各種不同的遺傳性、退變性、致弱性、致死性或不良的哺乳動物疾病。
本發(fā)明提供了為遺傳性或退化性疾病患者，尤其是那些以肌肉功能障礙、退化和虛弱為特征的患者，修復(fù)退化細(xì)胞和補(bǔ)充失去的細(xì)胞的組合物和方法。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，任何生肌細(xì)胞均可采用，無論其是否來源于骨骼肌、平滑肌或心肌。轉(zhuǎn)移的細(xì)胞類型包括成肌細(xì)胞、肌管和/或幼肌纖維。生肌細(xì)胞可以是原代培養(yǎng)的或克隆自正常供體的肌肉活檢組織。它們還可以是細(xì)胞素轉(zhuǎn)化或遺傳性轉(zhuǎn)導(dǎo)的生肌細(xì)胞。典型情況是父母、同胞或朋友作為肌營養(yǎng)障礙患者的供體。此外，計(jì)劃通過建立優(yōu)選成肌細(xì)胞的細(xì)胞系，無論來源于人還是動物，為沒有合適供體的患者提供準(zhǔn)備好的健康供體的細(xì)胞，(圖2-5，Law，P.K.成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，Lamdes，Austin，(1994))。進(jìn)一步期望細(xì)胞移植療程將改善大小、形狀、外觀或功能，和/或減輕病情。
本發(fā)明還提供了一種當(dāng)成肌細(xì)胞注射到退化病患者體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)肌肉后控制、啟動或促進(jìn)細(xì)胞融合的方法。通過人為地增加大6-硫酸軟骨素蛋白多糖(LC6SP)的濃度至患者內(nèi)源性濃度水平之上，便能增強(qiáng)和控制被轉(zhuǎn)移的供體成肌細(xì)胞之間或其與其它類型細(xì)胞之間的融合。(Law，P.K.，成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移Lamdes，Austin(1994))。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提高宿主細(xì)胞和供體細(xì)胞之間的融合率。為此進(jìn)行了不同的注射方法試驗(yàn)和比較，包括斜穿肌纖維、垂直于肌纖維表面、平行于肌纖維、和僅限于肌肉的某一點(diǎn)。目的是以最少的注射獲得最多的細(xì)胞融合(圖6-8，also Law，P.K.，Myoblast Transfer，Lamdes，Austin，(1994))。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體外受精及胚胎分裂球重組技術(shù)能用于已知的杜興氏病攜帶者以增加其擁有正常孩子機(jī)會。(圖9～13；alsoLaw，P.K.，成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，Lamdes，Austin，(1994))。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供一種自動細(xì)胞處理器，一種生產(chǎn)大量(一個(gè)循環(huán)超過1000億)的活的、無菌的、遺傳功能正常的、功能性的生肌細(xì)胞的方法。它們是經(jīng)過基因轉(zhuǎn)化或細(xì)胞素轉(zhuǎn)導(dǎo)的。這種細(xì)胞處理器有一個(gè)保持不同人體組織的活組織的輸入系統(tǒng)。該細(xì)胞處理器的計(jì)算機(jī)可以編程，以處理組織、控制時(shí)間、空間、培養(yǎng)成分的比例以及設(shè)備儀器的功能。在該過程中可隨時(shí)監(jiān)測細(xì)胞狀況。輸出系統(tǒng)提供適于作細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療用的或商用的細(xì)胞產(chǎn)品。(圖14～15)。
另一個(gè)實(shí)施方案是成肌細(xì)胞和/或其自然的、遺傳的、化學(xué)的衍生物被用來治療癌癥。圖16-18說明暴露于成肌細(xì)胞融合介質(zhì)的黑素瘤癌細(xì)胞死亡。根據(jù)Greenwald，P.，Kramer，B.S.和Weed，D.L.編著的《癌癥預(yù)防和控制》(Marcel Dekker公司，紐約，1995)，雖然所有其它器官都曾發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移性，但骨骼肌似乎沒有癌腫。極少數(shù)的肉瘤病例報(bào)道是少見的例外現(xiàn)象。
MTT治療9個(gè)月后DMD患者肌肉的營養(yǎng)障礙蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)說明成肌細(xì)胞治療能引起長期的基因缺陷修復(fù)(圖19)。這一特性可用于治療II型糖尿病胰島素抗性功能異常的肌肉。作為一種通用的基因轉(zhuǎn)移載體，供體的成肌細(xì)胞插入全部正?；蚪M，使之能修復(fù)任何功能異常的骨骼肌細(xì)胞，使得它們恢復(fù)正常的胰島素敏感性(圖20)。
其它特性和優(yōu)越性通過和將通過優(yōu)選的實(shí)施方案和附圖的詳細(xì)描述來說明和表現(xiàn)。而且，這里描述的所有參考文獻(xiàn)都被引入作為參考。
附圖簡述圖1是DMD患者肌肉細(xì)胞不同于正常細(xì)胞的一些已知蛋白缺損簡圖。這些缺損蛋白包括DMD患者減少或缺失的膜結(jié)構(gòu)蛋白，如營養(yǎng)障礙蛋白(DIN)、營養(yǎng)障礙蛋白相關(guān)蛋白(DRP)和營養(yǎng)障礙相關(guān)糖蛋白(DAG)，在DMD患者血清水平升高的酶，如肌酸磷酸激酶(CPK)、醛縮酶(ALD)和天門冬酰胺轉(zhuǎn)移酶(AST)，以及線粒體蛋白(Mito)的不同型。雖然這些蛋白缺損是由于營養(yǎng)蛋白基因缺損而原發(fā)或繼發(fā)產(chǎn)生，但其修復(fù)即需要多基因(G1～G7)轉(zhuǎn)移。
圖2說明MHC陰性成肌細(xì)胞和MHC陽性成肌細(xì)胞。(A)表示用抗MHC I級抗體分析人成肌細(xì)胞并在熒光顯微鏡下觀察。箭頭指示MHC陰性成肌細(xì)胞。(B)是同樣涂片在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下觀察。箭頭指示MHC陰性成肌細(xì)胞。線長＝20μm。
圖3說明用細(xì)胞熒光計(jì)(cytofluorometry)分析成肌細(xì)胞。對照組沒有抗MHC I級抗體的成肌細(xì)胞反應(yīng)。樣本組有抗MHC I級抗體的成肌細(xì)胞反應(yīng)。
圖4是細(xì)胞熒光計(jì)表現(xiàn)的MHC-1抗原陰性的成肌細(xì)胞分離的散布簡圖。
圖5說明經(jīng)細(xì)胞熒光計(jì)分散后兩組成肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。(A)代表MHC陽性成肌細(xì)胞。(B)代表MHC陰性或微弱表達(dá)的成肌細(xì)胞。(A)和(B)經(jīng)同樣放大并且圖象經(jīng)過同樣過程處理。線長＝30μm。
圖6表示決定成肌細(xì)胞分布的注射的角度(A)將成肌細(xì)胞斜向注射到受體肌細(xì)胞覆蓋盡可能廣的區(qū)域而且漏出最少，釋放供體成肌細(xì)胞，引起最多的嵌合纖維的形成。(B)橫向注射釋放供體成肌細(xì)胞至大量肌纖維，但覆蓋較小的區(qū)域并且似乎更容易引起注射滲漏。(C)縱向注射導(dǎo)致供體成肌細(xì)胞之間相互融合，形成較少的嵌合體肌纖維。(D)局部注射僅產(chǎn)生小范圍少數(shù)受體肌纖維可接受到供體成肌細(xì)胞。
圖7說明用熒光金(FG)標(biāo)記的供體成肌細(xì)胞核以及在MTT治療后7天出現(xiàn)在宿主肌肉中的情況。(A)帶有供體和受體肌細(xì)胞核的嵌合體肌纖維(黑箭頭)以及帶有供體肌細(xì)胞核的肌管(白箭頭)。(B)帶有供體(白箭頭)和受體(黑箭頭)肌核的嵌合體肌纖維。
圖8說明以FG標(biāo)記的供體成肌細(xì)胞在宿主肌肉的分布。即使斜形注射成肌細(xì)胞也能獲得供體成肌細(xì)胞分布(A，B)，或者供體成肌細(xì)胞核出現(xiàn)在斑中(C，D，白箭頭)，該斑漸漸地表現(xiàn)出越來越多的正常核和碎屑。(C)表示垂直注射以及(D)表示縱向注射。
圖9說明兩種不同形成機(jī)制的異型細(xì)胞的產(chǎn)生過程。
圖10說明了3種不同結(jié)果1是正常的，1是異型的，1是營養(yǎng)障礙的(自頂至底)。
圖11說明正常、異型和營養(yǎng)障礙的比目魚肌在80Hz電刺激時(shí)最大等長收縮和強(qiáng)直性緊張的生理記錄。異型肌收縮的記錄類似正常的、超過營養(yǎng)障礙肌收縮的記錄。
圖12說明異常鼠的比目魚肌橫斷面表現(xiàn)出DMD攜帶者肌肉特征的有核肌纖維(箭頭)。雖然大多數(shù)肌纖維仍表現(xiàn)正常，但也表現(xiàn)出一些退化特征，如纖維斷裂和中央核化。
圖13進(jìn)一步說明異常鼠的比目魚肌橫斷面表現(xiàn)出DMD攜帶者肌肉特征有有核肌纖維(箭頭)。雖然絕大多數(shù)肌纖維仍表現(xiàn)正常，但仍可見一些退化特征，如纖維斷裂和中央核化。
圖14說明自動細(xì)胞處理器的總體布局。
圖15說明培養(yǎng)和收獲自動操作的詳細(xì)設(shè)計(jì)。
圖16是用癌細(xì)胞生長介質(zhì)和成肌細(xì)胞生長介質(zhì)在培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞(CRL 6322)方面的比較。(A、C、E、G)低倍放大；(B、D、F、H)高倍放大。(A、B)黑素瘤細(xì)胞在癌細(xì)胞生長介質(zhì)中培養(yǎng)9天，其數(shù)量、伸長形狀和分化過程證明其表現(xiàn)仍然健康。(C、D)相同數(shù)量的黑素瘤細(xì)胞在成肌細(xì)胞生長介質(zhì)中種植和培養(yǎng)9天，數(shù)量更多并分化。(E、F)在癌細(xì)胞生長介質(zhì)中14天后，大量的黑素瘤細(xì)胞變?yōu)榍蛐尾谋砻婷撾x，表明細(xì)胞已死亡(E)。在高倍放大下，僅很少健康細(xì)胞殘存(F)。(G、H)在成肌細(xì)胞生長介質(zhì)中14天后，黑素瘤細(xì)胞仍表現(xiàn)較大數(shù)量并健康。
圖17說明成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞(濃度比2∶1)在成肌細(xì)胞生長介質(zhì)中共培養(yǎng)。(A，C)低倍放大；(B，D)高倍放大。(A，B)培養(yǎng)9天后，成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞數(shù)量多并保持分化。(C，D)培養(yǎng)14天后，成肌細(xì)胞占培養(yǎng)優(yōu)勢，黑素瘤細(xì)胞仍存活。
圖18說明成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞在成肌細(xì)胞生長介質(zhì)中共培養(yǎng)4天，然后在成肌細(xì)胞融合介質(zhì)中共培養(yǎng)。(A、C、E、G)低倍放大；(B、D、F、H)高倍放大。(A、B)成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞(1∶1濃度比)在成肌細(xì)胞融合介質(zhì)中培養(yǎng)5天后。許多黑素瘤變成球形并從表面脫離，在此介質(zhì)中不存活。成肌細(xì)胞仍健康并開始融合。(C、D)成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞(1∶1濃度比)在成肌細(xì)胞融合介質(zhì)中培養(yǎng)10天后出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞。僅少數(shù)能在此介質(zhì)中活存這么長時(shí)間，并且它們分離并死亡(D)。(E、F)成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞(1∶1濃度比)在成肌細(xì)胞融合介質(zhì)中培養(yǎng)19天后，活存的成肌細(xì)胞保持其紡錘形并相互緊密排列。黑素瘤細(xì)胞則變成球形并脫離。(G，H)成肌細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞(3∶1濃度比)在成肌細(xì)胞融合介質(zhì)中培養(yǎng)19天后，成肌細(xì)胞開始融合，形成肌管。
圖19是人肌肉營養(yǎng)障礙蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)。在正常對照肌肉出現(xiàn)營養(yǎng)障礙蛋白定位于肌纖維膜(A)，而在DMD肌肉則不然(B)。(C，D)取自MTT受試者的DMD肱二頭肌，在組織活檢前9個(gè)月該受試者一側(cè)肱二頭肌注射MTT，而另一側(cè)注射安慰劑。由于盲法試驗(yàn)要持續(xù)到該研究結(jié)束，所以MTT肌肉的標(biāo)示還沒有顯露出來。然而，僅一個(gè)肌肉表現(xiàn)出營養(yǎng)障礙蛋白的肌纖維定位。(B)，(C)和(D)是有意過度曝光以表明免疫反應(yīng)的背景因素與肌纖維膜無關(guān)。
圖20說明(a)正常骨骼肌細(xì)胞通過胰島素的葡萄糖代謝。(b)對于II型糖尿病，主要的胰島素抗性后遺癥是降低了肌肉對葡萄糖的攝取。肌肉內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常是可能的。已知胰島素介導(dǎo)的酪氨酸激酶激增和自動磷酸化被減弱。后面的這些缺陷能夠通過MTT的正?；虮磉_(dá)來修正。(代謝6∶6，1993)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述這里所描述的組合物和方法將被用于治療患有遺傳性神經(jīng)肌肉疾病的患者的說明。但本發(fā)明的組合物和方法也可能被用于治療其它宿主和其它疾病。
A.受控的細(xì)胞融合成肌細(xì)胞有與其它細(xì)胞融合的獨(dú)特的能力。通過使用正常的成肌細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞融合將全部正?；虺煞謱?dǎo)入任何遺傳功能異常的細(xì)胞內(nèi)。例如，遺傳異常細(xì)胞可以是肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或甚至腦細(xì)胞。該設(shè)想是將全部正?；虺煞洲D(zhuǎn)移到異常細(xì)胞，并因此在基因水平，而不是在激素或生化水平治療遺傳性疾病。
對于治療由于結(jié)構(gòu)蛋白異常而不是調(diào)節(jié)蛋白異常的遺傳性疾病，當(dāng)成肌細(xì)胞注射到體內(nèi)時(shí)、控制、啟動或促進(jìn)細(xì)胞融合是有用的。已知在低血清濃度培養(yǎng)時(shí)成肌細(xì)胞已可以融合。在體內(nèi)環(huán)境中該過程更為復(fù)雜。當(dāng)成肌細(xì)胞在肌肉內(nèi)注射至細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)時(shí)，注射創(chuàng)傷導(dǎo)致基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和大6-硫酸軟骨素蛋白多糖(LC6SP)的釋放(Young，H.E.，et al.，J.Morph.，20185-103(1989))。后面得到的這些生長因子刺激成肌細(xì)胞增殖，不幸的是，它們也刺激那些在營養(yǎng)障礙肌肉中已經(jīng)存在的大量激增的成纖維細(xì)胞的增殖。因此有必要用MTT方法注射盡可能純凈的成肌細(xì)胞而不污染纖維細(xì)胞。
通過在轉(zhuǎn)移部位人為地增加LC6SP的局部濃度至內(nèi)源性水平以上，可以獲得控制下的細(xì)胞融合。在肌肉內(nèi)，可以通過在轉(zhuǎn)移介質(zhì)中加入約5μM的LC6SP來實(shí)現(xiàn)。此外，胰島素在體外促進(jìn)該發(fā)展的進(jìn)程，并可導(dǎo)致在成肌細(xì)胞注射后迅速形成肌管。在轉(zhuǎn)移介質(zhì)中LC6SP的使用(從約5μM到大約5mM)將可能導(dǎo)致MTT的巨大成功。
B.成肌細(xì)胞通用的基因轉(zhuǎn)移載體由于MTT導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移時(shí)遺傳性鑲嵌的形成，體外異核體的產(chǎn)生具有廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。這可以通過使用成肌細(xì)胞控制細(xì)胞融合來達(dá)到。
本研究涉及在培養(yǎng)器中將供體成肌細(xì)胞正常胞核的全部正常基因轉(zhuǎn)移到遺傳性正常和/或異常的細(xì)胞，例如心肌細(xì)胞。該進(jìn)展尤其重要的是，考慮到在大約10％的DMD患者中，心肌病癥發(fā)生在青春期。到18歲，所有DMD患者發(fā)展至心肌病。無疑，取代已退變的和正在退變的心肌細(xì)胞的能力對于甚至正常人群的心臟治療都具有巨大的影響，因?yàn)楣┮浦驳男呐K非常短缺。
正常心肌細(xì)胞在體內(nèi)和在體外具有非常有限的增殖能力。心臟病或遺傳性心肌病造成的心肌損傷不能通過再生來自我修復(fù)。通過整合骨骼肌細(xì)胞特征，有絲分裂，異核體的心肌細(xì)胞將能在體外增殖。
正常成肌細(xì)胞和正常心肌細(xì)胞間受控的細(xì)胞融合可導(dǎo)致異核體表現(xiàn)出兩種父輩生肌細(xì)胞型的特征。細(xì)胞移植后，在經(jīng)過體外有絲分裂形成橋粒、間隙連接和同步強(qiáng)烈收縮的能力基礎(chǔ)上，可選擇克隆。
在描繪出損傷點(diǎn)的圖譜后，這些超級遺傳細(xì)胞可以通過Jaikman WM等描述的導(dǎo)管釋放(InZipes DP，and Jalife J.eds.心臟電生理。從細(xì)胞到臨床，費(fèi)城WB Saunders Company，491-502(1990))。由于這些心肌細(xì)胞的能大量生長的能力，使得能夠先在營養(yǎng)障礙的、心肌病的倉鼠，繼而在人體檢測到心肌病的結(jié)構(gòu)性、電生理性和收縮性的異常的修復(fù)。
用體外控制的細(xì)胞融合將成肌細(xì)胞的有絲分離性質(zhì)遺傳到心肌細(xì)胞，使得異核體的心肌細(xì)胞能夠增殖、生長至足夠數(shù)量的細(xì)胞供有效的細(xì)胞移植。
最近有報(bào)道胎鼠心肌細(xì)胞移植到有性生殖的宿主的心肌在宿主和供體細(xì)胞之間形成初生的間介性盤。(Soonpaa MH，et al.，科學(xué)，26498-(1994))。用胚胎細(xì)胞供細(xì)胞移植已經(jīng)并將繼續(xù)引起倫理問題。事實(shí)仍是胚胎細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠心肌細(xì)胞以修復(fù)心肌梗死?？紤]到有研究報(bào)道被轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞的重組基因至少能表達(dá)6個(gè)月，并且被體液信號正常調(diào)節(jié)，因此用成肌細(xì)胞使心臟細(xì)胞有絲分裂的生物工程提供了一種解決問題的方法。
鑒于成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)障礙的心肌，繼而在體內(nèi)控制的細(xì)胞融合可能在梗死時(shí)提供一種結(jié)構(gòu)障礙，考慮到心泵功能會打散來自宿主心肌的發(fā)展中的細(xì)胞，成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞良好的整合仍有待證明。
C.美容性應(yīng)用在更廣泛的意義上，細(xì)胞治療概念可以對整形外科領(lǐng)域有顯著貢獻(xiàn)。使用細(xì)胞治療可避免硅膠植入。成肌細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞可用來更自然的方法取代硅膠注射用于面部、胸部和臀部的豐隆。修飾的脂肪組織含有混合的和/或雜交的成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，可用來控制身體部位的大小、形狀和堅(jiān)松度。由于肌肉細(xì)胞不象脂肪細(xì)胞那樣易于消亡，良好的效果可以長時(shí)間維持。如今的健美者們正尋找在恰當(dāng)?shù)牟课辉鰪?qiáng)肌肉群和功能。用成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移來增強(qiáng)肌肉群是一種自然解決方法。
D.超級細(xì)胞系建立成肌細(xì)胞的超級細(xì)胞系是個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的挑戰(zhàn)，但其益處是顯著的。這些細(xì)胞應(yīng)該是高度生肌性、非致腫瘤性、非抗原性并能發(fā)展成非常強(qiáng)壯的肌肉。
成肌細(xì)胞的一個(gè)特有的性質(zhì)是在其融合后迅速失去其主要組織相容性I級表面抗原。這對于在成細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療后應(yīng)用免疫抑制具有重要影響。(See HuardJ.et al.，肌肉神經(jīng)，17224-34(1994)；Roy R.et al.，移植進(jìn)展，25995-7(1993)；and Huard J.et al.，移植進(jìn)展，243049-51(1992))。免疫抑制期依賴于MTT后成肌細(xì)胞失去其MHC-I抗原的迅速程度。更理想的是建立MHC-I抗原缺失的成肌細(xì)胞系，這樣允許MTT沒有免疫抑制。
在我們的研究中，人成肌細(xì)胞的培養(yǎng)是取自正常肌肉活組織，根據(jù)Law，P，K.，et al.，細(xì)胞移植，1235(1992)和Law，P.K.，et al.，細(xì)胞移植，2485(1993)的公開的方法進(jìn)行的。成肌細(xì)胞表達(dá)的MHC-I抗原是利用熒光免疫分析來表現(xiàn)的。成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化是通過在生長介質(zhì)中加入秋水仙堿并保溫48小時(shí)來進(jìn)行的。用于實(shí)驗(yàn)的成肌細(xì)胞準(zhǔn)備劑用量用單克隆抗體(MAb)anti-Leu-19免疫染色分析，純度98％。
成肌細(xì)胞與抗MHC-I單克隆抗體(鼠1∶25稀釋，Silenus實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)一起在室溫下保溫。洗脫后，成肌細(xì)胞與FITC連接的抗鼠IgG(Sigma)一起保溫45分鐘并在用寬帶紫外線(UV)激發(fā)濾片的熒光顯微鏡下檢查。細(xì)胞熒光計(jì)與在488mM下工作的Becton-Dickinson細(xì)胞分類計(jì)一起使用。成肌細(xì)胞控制通過在免疫分析中忽略第一抗體作為自動熒光背景來進(jìn)行。
91.7％的成肌細(xì)胞MHC-1 MAb反應(yīng)。反應(yīng)由強(qiáng)到弱不等。剩下的8.3％成肌細(xì)胞呈MHC-1抗原表達(dá)陰性。圖2說明MHC陰性成肌細(xì)胞和MHC陽性成肌細(xì)胞。MHC陰性成肌細(xì)胞被細(xì)胞熒光計(jì)成功地分離，這在圖3、4說明。然后兩組成肌細(xì)胞培養(yǎng)3周在增殖方面沒有顯著區(qū)別。
這些成肌細(xì)胞缺乏MHC-1抗原可促進(jìn)在MTT后這些成肌細(xì)胞在受體體內(nèi)的存活。圖5說明細(xì)胞熒光計(jì)分離后的MHC陽性成肌細(xì)胞、MHC陰性或弱表達(dá)的成肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
免疫抑制劑環(huán)孢菌素有許多副作用，并通過抑制免疫系統(tǒng)，造成感染盛行。沒有MHC-1抗原表達(dá)的成肌細(xì)胞可能成為一種新的細(xì)胞系，比普通成肌細(xì)胞更能夠在宿主存活。這種超級細(xì)胞系將減少使用免疫抑制劑的必要，并將提供給病人一種準(zhǔn)備好的制品而不需要供體。
這些超級細(xì)胞系必須來源于原代成肌細(xì)胞培養(yǎng)的克隆，因?yàn)橐x擇其特有的特性。遺憾的是據(jù)顯示所有的成肌細(xì)胞克隆如果允許過度增殖，最終都產(chǎn)生腫瘤。因此這些細(xì)胞系不應(yīng)允許其增殖超過30代。
E.成肌細(xì)胞注射方法除供體細(xì)胞在免疫學(xué)敵對性宿主的存活外，細(xì)胞融合是增強(qiáng)MTT后營養(yǎng)障礙性肌肉的關(guān)鍵。為增強(qiáng)宿主和供體細(xì)胞間的融合率，對目的在于使供體成肌細(xì)胞廣泛分布的不同注射方法進(jìn)行了試驗(yàn)和比較。這些方法包括斜穿肌纖維，垂直于肌纖維表面，平行于肌纖維，和在一個(gè)點(diǎn)注射劑肌纖維。圖6說明注射再對成肌細(xì)胞分布的作用。目的是以最少的注射次數(shù)獲得最大的細(xì)胞融合。
熒光金(FG，0.01％)標(biāo)記的人或鼠(C57BL/6J-gpi-1c/c)成肌細(xì)胞(0.05ml的105細(xì)胞/ml溶液)被注射到20只3月齡的正常鼠(C57BL/6J-gpi-1b/b)的腓腸肌內(nèi)。宿主鼠被每日皮下注射環(huán)孢菌素50mg/kg體重進(jìn)行免疫抑制。各組鼠在細(xì)胞注射后7、14、24、34和44天被分別處死，用熒光顯微鏡檢查注射的肌肉的轉(zhuǎn)移部分。通過計(jì)算帶有供體細(xì)胞核的宿主肌纖維占該供體細(xì)胞覆蓋區(qū)域的肌纖維總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來估計(jì)細(xì)胞融合率。用瓊脂糖凝膠電泳(200V，3h，pH8.6)檢查注射肌肉的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(GPI)。在組織區(qū)段首先出現(xiàn)嵌合體肌纖維是在細(xì)胞注射后7天內(nèi)。這在圖7中說明。最高融合率達(dá)到72.2％。GPI電泳圖顯示肌肉標(biāo)本中宿主供體的和嵌合的GPI至少至MTT后44天。斜穿肌纖維注射的成肌細(xì)胞隨著注射針從注射肌纖維拔針而廣泛和均勻分布。如圖8。垂直注射到肌纖維的成肌細(xì)胞則呈局部地分布，而通過肌肉的核心縱向注射的成肌細(xì)胞和與肌纖維平行注射的分布很少，與之相似，單點(diǎn)注射的分布和融合都很少?？紤]到小體積高濃度比相對較大體積較低濃度引起較少的肌肉損傷，并考慮到注射引起的創(chuàng)傷降低營養(yǎng)障礙肌肉的再生能力，成肌細(xì)胞的釋放技術(shù)是MTT成功的基礎(chǔ)。
雖然斜行注射已被用于我們的臨床試驗(yàn)，但所有改進(jìn)的余地。因?yàn)槿梭w的肌肉很大并且不同肌肉群的肌纖維方向有必要由負(fù)責(zé)成肌細(xì)胞注射的矯形外科專家去深入研究。根據(jù)過去的鼠研究判斷，在營養(yǎng)障礙的肌纖維，有20％的正常肌核能夠保持正常的表型。
F.訓(xùn)練和物理治療強(qiáng)力訓(xùn)練會導(dǎo)致營養(yǎng)障礙性肌纖維損傷。營養(yǎng)障礙蛋白導(dǎo)致肌纖維膜脆弱，易在肌收縮時(shí)撕碎。其它細(xì)胞型某種程度上與退化無關(guān)，因?yàn)樗鼈儾皇湛s。因此，對DMD病人健美就是補(bǔ)償失去的肌群并使之強(qiáng)健。
然而使用與MTT有關(guān)的訓(xùn)練還沒有研究。在營養(yǎng)障礙的動物，眾所周知訓(xùn)練促進(jìn)肌纖維退化并因此惡化營養(yǎng)障礙狀況，這僅限于營養(yǎng)障礙性的肌肉纖維而已。這情況與MTT不同，在MTT，試圖產(chǎn)生一種含有正常的、嵌合的和營養(yǎng)障礙的肌纖維的嵌合性肌肉。MTT立足于重建其遺傳性并改善營養(yǎng)障礙肌肉的表型。因此，強(qiáng)度訓(xùn)練可能誘導(dǎo)宿主釋放衛(wèi)星細(xì)胞，使之與正常成肌細(xì)胞融合，產(chǎn)生嵌合性纖維。無疑，這種營養(yǎng)障礙性退化將誘導(dǎo)正常的肌肉的再生。植入的成肌細(xì)胞不僅與損傷的肌纖維的新愈合區(qū)融合，而且作為衛(wèi)星細(xì)胞生存?？梢栽O(shè)計(jì)在MTT后較短時(shí)間進(jìn)行一些溫和的鍛練，以促進(jìn)成肌細(xì)胞混合，排列和融合，并給所形成的纖維提供物理治療。在新形成纖維受神經(jīng)支配后進(jìn)行中等強(qiáng)度的訓(xùn)練似乎可以增進(jìn)正常的和嵌合的纖維的發(fā)展。廢用在營養(yǎng)障礙性肌肉的技術(shù)性退化中起重要作用，常給肌營養(yǎng)障礙患者以物理治療。廢用或缺乏橋式相互作用導(dǎo)致鈣結(jié)合能力降低，結(jié)果過多的細(xì)胞內(nèi)鈣促進(jìn)營養(yǎng)障礙性肌肉的損害。
G.肌管轉(zhuǎn)移在DMD的晚期，仍殘存少數(shù)成肌纖維可被MTT修復(fù)。新的肌纖維形成以補(bǔ)充退化細(xì)胞被過度的結(jié)締組織和脂肪組織的存在進(jìn)一步復(fù)雜化。供體肌核被結(jié)合進(jìn)營養(yǎng)障礙性纖維供修復(fù)需要大約1～3周，供體成肌細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)展新生的成熟的正常纖維以補(bǔ)充失去的細(xì)胞需要4個(gè)月，而形成肌管并被血管化、神經(jīng)支配化和與肌腱連結(jié)方面的障礙都威脅著其生存。足夠的營養(yǎng)對發(fā)展肌纖維以建造收縮性的肌球蛋白和肌動蛋白是必要的。無論是電生理的還是收縮性運(yùn)動都不是肌纖維發(fā)展正常的，這正是肌管移植會起作用的時(shí)候。
本發(fā)明者顯示了將新生的正常的肌肉或肌管移植到dy2Jdy2J營養(yǎng)障礙性鼠的肌肉以產(chǎn)生正常肌肉功能和結(jié)構(gòu)。(See Law，P.K.and Yap，J.L.，肌肉神經(jīng)，2356-63(1979))。通過將融合的培養(yǎng)物暴露于融合介質(zhì)的自然成肌細(xì)胞融合可容易地獲得肌管。事實(shí)上，在培養(yǎng)中，小肌肉同時(shí)由收縮纖維產(chǎn)生。新生纖維表現(xiàn)肌節(jié)和肌球蛋白陽性免疫著色。
肌管轉(zhuǎn)移可以用大號針頭注射給藥。更好的方法是，可以將其手術(shù)植入到被外科醫(yī)生解剖或取出的脂肪和結(jié)締組織層。由于肌肉可發(fā)展得非常有力量，而疤痕組織是無活力的，成長發(fā)展的肌肉會在其存在的整個(gè)過程壓迫周圍疤痕組織。
肌管轉(zhuǎn)移提供了體外的生物工程的新生纖維。這些纖維失去了其MHC-I表面抗原并因而無抗原性。肌管轉(zhuǎn)移將不再需要使用環(huán)孢菌素。對以前感染過巨細(xì)胞病毒(CMV)或其它病毒的病人，肌管移植將是可選的。
此外，對于常染色體疾病，如面肩胛骨營養(yǎng)障礙(FSH)、先天性肌強(qiáng)直、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)障礙和肢帶性營養(yǎng)障礙，嵌合性纖維的形成可能是沒有用的，因?yàn)楹说幕パa(bǔ)可能是無效的。而用完全正常的肌管通過肌管移植將無疑開創(chuàng)了治療的新紀(jì)元。
H.異型鼠異型鼠或鼠嵌合體是帶有2種或更多基因型的鼠嵌合體。它們通過分裂球重組(See Hogan，B.，et al.，鼠胚操作手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，(1986))或者人工聚合來源于2種不同鼠株的胚胎來產(chǎn)生。除了作為研究體節(jié)克隆起源及其肌肉衍生的重要樣本外，異型鼠還被本發(fā)明人及其他人用來表現(xiàn)當(dāng)遺傳性正常和營養(yǎng)障礙性生肌并存時(shí)自然發(fā)展的營養(yǎng)障礙抑制。
通過如圖9所示聚合正常(129株)和營養(yǎng)障礙(C57BL/6Jdy2Jdy2J株)鼠的各一半胚胎，產(chǎn)生了含有嵌合體鼠及其正常和營養(yǎng)障礙性同胞的異型對(圖10)。雖然根據(jù)基因型標(biāo)記分析，營養(yǎng)障礙性基因存在于肌纖維中，這些異型鼠表現(xiàn)出正常的行為、壽命和圖11所示的基本正常肌肉功能和圖12、13所示的正常肌肉結(jié)構(gòu)。
這些異型鼠的肌纖維高度相似于那些杜興氏病的雌性攜帶者。鑒于營養(yǎng)障礙性比目魚肌含有70％或更多的退化纖維，僅3～5％的異型的肌纖維異常的。象杜興氏攜帶者一樣這些異常的肌纖維中許多可見“核”。通過自然細(xì)胞融合，正常成肌細(xì)胞與營養(yǎng)障礙細(xì)胞融合以形成嵌合性肌管，它發(fā)展為表型正常的纖維。
I.使杜興氏攜帶者能有正常的孩子可以想象，體外受精技術(shù)和用于異型鼠研究的分裂球重組織技術(shù)可以用于人類。已知的攜帶者可因此而獲得生育正常孩子的更好的機(jī)會。
據(jù)此，可獲取從攜帶者和正常女性得到的卵細(xì)胞，與來源于攜帶者的丈夫的精細(xì)胞在體外受精。攜帶者的受精卵正?；驙I養(yǎng)障礙的機(jī)會是50/50。不管其基因型如何，其與正常受精卵混合將確保發(fā)育為正常表型。在胚胎培養(yǎng)至胚泡期后，可將其移植至攜帶者的子宮內(nèi)。攜帶者的子宮可用人促腺激素來誘導(dǎo)假孕，以使移植易于實(shí)現(xiàn)。
用體外受精可保護(hù)母親?？蓙G棄分裂球重組后異常發(fā)育的胚胎，而且，不需要移出分裂球作遺傳分析。
由于攜帶者的受精卵有50％的機(jī)率可能是正常的?？蓮娜寺雅萜诘呐咛ド弦迫〔糠址至亚颍肞CR方法分析營養(yǎng)障礙蛋白的信使RNA。不幸的是，這存在著因在胚胎發(fā)育早期移去部分胚胎而造成胚胎損傷的危險(xiǎn)。
J.自動細(xì)胞處理器由于大量需要正常成肌細(xì)胞、肌管和新生肌肉，細(xì)胞培養(yǎng)、收獲和分裝勞動強(qiáng)度大、費(fèi)用高，以及人操作不精確易犯錯(cuò)誤等，需要自動細(xì)胞處理器。這種處理器將能夠生產(chǎn)大量的，每流程1000億，活存的、無菌的、遺傳性能確定的以及具有生物學(xué)表現(xiàn)功能的細(xì)胞，例如，生肌細(xì)胞。
這種自動細(xì)胞處理器將是現(xiàn)代計(jì)算機(jī)科學(xué)、機(jī)械工程和細(xì)胞遺傳學(xué)的極其重要的產(chǎn)物之一(圖14)。其輸入的將是不同的人體活檢組織。計(jì)算機(jī)將用程序處理組織，同時(shí)時(shí)間、空間、培養(yǎng)成分的比例和設(shè)備操作可精確控制。細(xì)胞的狀況可在處理過程中的任何時(shí)刻進(jìn)行監(jiān)控，并具有一定的彈性以允許變化。培養(yǎng)、控制細(xì)胞融合、收獲和分裝的不同方案都可以編程到軟件中。輸出將供應(yīng)細(xì)胞，將是已準(zhǔn)備好的供運(yùn)輸或供細(xì)胞療法注射用的細(xì)胞產(chǎn)品。該自動細(xì)胞處理器將被封閉在一個(gè)足夠大的可以包容在其內(nèi)部進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和操作的硬件的無菌密閉體內(nèi)，(圖15)。
本發(fā)明建立了一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)，能夠保持被包裹的成肌細(xì)胞在室溫下存活并具生肌性3天以上，當(dāng)成肌細(xì)胞處于冷凍狀態(tài)時(shí)可存活達(dá)7天以上。這將使得細(xì)胞包裹可送達(dá)世界上遙遠(yuǎn)的應(yīng)用地點(diǎn)。
自動細(xì)胞處理器將輕易地取代現(xiàn)在的龐大的低級的培養(yǎng)設(shè)備和繁重的人力，對人類健康的貢獻(xiàn)將無疑是顯著的，并且造價(jià)估計(jì)也相對較低。
K.細(xì)胞庫自動細(xì)胞處理器將只構(gòu)建細(xì)胞庫的一部分。理想地，可從8～22歲的年輕人獲得供體肌肉活檢組織作為自動細(xì)胞處理器的輸入“種子”。這將取決于是否有健康的志愿者供體。每個(gè)供體必須承受一次費(fèi)時(shí)并且昂貴的試驗(yàn)的創(chuàng)痛。在試驗(yàn)結(jié)果和供體的生理狀況的基礎(chǔ)上，才能確定供體細(xì)胞是否有遺傳性缺陷或感染了病毒和/或細(xì)菌。這些是從成年人的成熟組織取得活檢組織的優(yōu)點(diǎn)。然而，主要的缺點(diǎn)是，成熟細(xì)胞通常不分裂，即使分裂，在變成致瘤性或有絲分裂之前能繁殖產(chǎn)生的數(shù)量也有限。
人胎兒組織可潛在提供無限的分裂細(xì)胞來源。但除了倫理學(xué)原因外，盡管存在不同于篩檢許多人類遺傳病的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，確定這些細(xì)胞遺傳正常性仍然困難。
至于肌肉營養(yǎng)障礙病，用源于遺傳背景清楚的體外受精的牛胎的肌肉原基，可能是一種選擇。精子和卵子選自那些肌肉強(qiáng)大有力的牛近交系。體外受精后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)并移植到假孕的牛的子宮內(nèi)。在胚胎的特殊發(fā)育期通過Sicilian切開術(shù)移出胚胎。然后便能將富含成肌細(xì)胞的肌肉原基切碎，輸入自動細(xì)胞處理器。
將牛細(xì)胞移植進(jìn)人體構(gòu)成了異種移植。由于人和牛的免疫系統(tǒng)有著顯著差別，這些異種移植似乎可以在受體體內(nèi)成活、發(fā)展并實(shí)現(xiàn)正常功能而不需要免疫抑制劑。但是這種方法將被使用或不使用免疫抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
L.成肌細(xì)胞衍生物與癌癥進(jìn)化是一種伴隨大量統(tǒng)計(jì)的長期的連續(xù)性實(shí)驗(yàn)。在骨骼肌中幾乎沒有癌的轉(zhuǎn)移說明成肌細(xì)胞及其衍生物的生理的、電學(xué)的、機(jī)械的、化學(xué)的存在預(yù)防或消滅癌癥。
在我們的研究中表明，在細(xì)胞融合期成肌細(xì)胞的生理的和生化的條件導(dǎo)致黑素瘤癌細(xì)胞的死亡(圖16至18)。這并不排除類似的或不同的條件，這包括其它在不同發(fā)育期的生肌性細(xì)胞和電學(xué)的、機(jī)械的可能影響。
應(yīng)該理解對這里所描述的現(xiàn)行優(yōu)選的實(shí)施方案的不同變化和修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。而采取的這些變化和修飾沒有離開本發(fā)明的精神和范圍。并且沒有減少其相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。因此，這意味著這些變化和修飾將歸入所附的權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1.一種控制細(xì)胞融合的方法，其包括增加細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)或轉(zhuǎn)移介質(zhì)中大6-硫酸軟骨素蛋白多糖的濃度，使其足以超過內(nèi)源性大6-硫酸軟骨素蛋白多糖的濃度5μM至5mM。
2.權(quán)利要求1的方法，其中大6-硫酸軟骨素蛋白多糖的濃度是在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中增加的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中大6-硫酸軟骨素蛋白多糖的濃度是在供其轉(zhuǎn)移到病人或宿主的介質(zhì)中增加的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中大6-硫酸軟骨素蛋白多糖的濃度是5μM至5mM。
5.用于控制身體部位的大小、形狀或密度的組合物，它是用下述方法制備的培養(yǎng)至少十億源于哺乳動物的成肌細(xì)胞，培養(yǎng)來自哺乳動物的脂肪細(xì)胞，將成肌細(xì)胞和培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞混入共同的培養(yǎng)物中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種當(dāng)成肌細(xì)胞注射到退化病患者體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)肌肉后控制、啟動或促進(jìn)細(xì)胞融合的方法。通過人為地增加大6－硫酸軟骨素蛋白多糖(LC6SP)的濃度至患者內(nèi)源性濃度水平之上，便能增強(qiáng)和控制被轉(zhuǎn)移的供體成肌細(xì)胞之間或其與其它類型細(xì)胞之間的融合。本發(fā)明還提供用于控制身體部位的大小、形狀或密度的組合物，其中含有培養(yǎng)的成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
文檔編號C12N5/16GK1477190SQ03101588
公開日2004年2月25日 申請日期1995年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月13日
發(fā)明者彼得·K·羅, 彼得 K 羅 申請人:彼得·K·羅, 彼得 K 羅