專利名稱：腺苷脫氨酶活性測(cè)定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H2O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測(cè)定此波長(zhǎng)處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測(cè)定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?3128092.7、申請(qǐng)日為2003.05.29、名稱為《一種測(cè)定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國(guó)專利申請(qǐng)公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè)定反應(yīng)所需的還原型煙酰氨輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶或其類似物，及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰氨輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰氨輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為腺苷脫氨酶的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成腺苷脫氨酶反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)必定將還原型煙酰氨輔酶氧化成氧化型煙酰氨輔酶)的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的腺苷脫氨酶活性的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化物酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
通常步驟2)是將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，以測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶偶聯(lián)核苷磷酸酶生成次黃嘌呤，再偶聯(lián)黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤氧化生成尿酸鹽及過氧化氫，再偶聯(lián)經(jīng)過氧化物酶反應(yīng)生成乙醛，在氧化型輔酶的幫助下，醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸，同時(shí)氧化型輔酶還原成還原性輔酶，還原性輔酶在波長(zhǎng)340nm處有吸收峰，因此從測(cè)定主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，可以測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖劑 40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l乙醇1--30mmol/l過氧化物酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l
醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)源肌苷、及次黃嘌呤的污染試劑I緩沖液40--200mmol/l單價(jià)磷酸鹽0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過氧化物酶500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--50％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l穩(wěn)定劑10--50％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中試劑I的成分，乙醇、氧化型輔酶、過氧化物酶及醛脫氫酶等可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除肌苷及次黃嘌呤的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l
單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過氧化物酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中試劑I的成分，乙醇、氧化型輔酶等可以單獨(dú)或同時(shí)放在試劑II或試劑III中，單價(jià)磷酸鹽可以放在試劑II中；試劑II中的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶及醛脫氫酶等中任何單獨(dú)或任何組合也可以放在試劑I；過氧化物酶及醛脫氫酶等中單獨(dú)或二者可以放在試劑III中，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍為6.5-10.5。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑為總體積的10-80％(或者10--50mmol/l)，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷1--5mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2--10mmol/l核苷磷酸酶 5000--20000U/l黃嘌呤氧化酶5000--20000U/l乙醇5--10mmol/l過氧化物酶 10000--20000U/l氧化型輔酶 1--2mmol/l醛脫氫酶10000--20000U/l由于本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫的污染，消除內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試腺苷脫氨酶活性所需要的肌苷都是產(chǎn)生于腺苷脫氨酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑盒包括緩沖液 100mmol/l腺苷1mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2mmol/l核苷磷酸酶 10000U/l黃嘌呤氧化酶10000U/l乙醇5mmol/l過氧化物酶 20000U/l氧化型輔酶 1mmol/l醛脫氫酶10000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
本實(shí)施例應(yīng)用腺苷脫氨酶偶聯(lián)核苷磷酸酶生成次黃嘌呤，再偶聯(lián)黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤氧化生成尿酸鹽及過氧化氫，再偶聯(lián)經(jīng)過氧化物酶反應(yīng)生成乙醛，在氧化型輔酶的幫助下，醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸，同時(shí)氧化型輔酶還原成還原性輔酶，還原性輔酶在波長(zhǎng)340nm處有吸收峰，因此從測(cè)定主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，可以測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有試劑I緩沖液120mmol/l單價(jià)磷酸鹽8mmol/l乙醇 8mmol/l氧化型輔酶2mmol/l核苷磷酸酶20000U/l黃嘌呤氧化酶 20000U/l過氧化物酶10000U/l醛脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II
緩沖液 120mmol/l腺苷 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l測(cè)定腺苷脫氨酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測(cè)定步驟為腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 80mmol/l單價(jià)磷酸鹽 5mmol/l乙醇 7mmol/l氧化型輔酶 2mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l試劑II
緩沖液 80mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶5000U/l過氧化物酶 15000U/l醛脫氫酶15000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 80mmol/l腺苷3mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測(cè)定步驟為腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有
試劑I緩沖液 120mmol/l單價(jià)磷酸鹽 6mmol/l乙醇 8mmol/l氧化型輔酶 2mmol/l核苷磷酸酶 15000U/l黃嘌呤氧化酶 15000U/l過氧化物酶 15000U/l醛脫氫酶 15000U/l穩(wěn)定劑 40％(總體積)試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為2/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化物酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于被測(cè)樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，包括緩沖劑40——200mmol/l腺苷 0.2——20mmol/l單價(jià)磷酸鹽0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黃嘌呤氧化酶500——50000U/l乙醇1——30mmol/l過氧化物酶 500——50000U/l氧化型輔酶 0.5——20mmol/l醛脫氫酶500——50000U/l穩(wěn)定劑 10——50％
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種，pH范圍為6.5-10.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶為NADP+、NAD+、thio-NAD+還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1746316SQ20041004190
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中