專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
志賀氏菌是食品中常見(jiàn)的致病菌，是導(dǎo)致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。志賀氏菌屬中各菌株都有強(qiáng)烈的內(nèi)毒素，作用于腸壁，使通透性增高，從而促進(jìn)毒素的吸收。繼而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)，引起臨床上一系列毒血癥癥狀，如發(fā)熱、神志障礙，甚至中毒性休克。其毒素破壞粘膜，形成炎癥、潰瘍，呈現(xiàn)典型的痢疾膿血便。毒素作用于腸壁植物神經(jīng)，使腸道功能紊亂，腸蠕動(dòng)共濟(jì)失調(diào)和痙攣，尤其直腸括約肌最明顯，因而發(fā)生腹痛、里急后重等癥狀。志賀氏菌病常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播，與其相關(guān)的食品包括色拉(土豆、金槍魚(yú)、蝦、通心粉、雞)、生的蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、面包制品、漢堡包和有鰭魚(yú)類(lèi)。志賀氏菌在擁擠和不衛(wèi)生條件下能迅速傳播，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于人員大量集中的地方如餐廳、食堂。食源性志賀氏菌流行的最主要原因是從事食品加工行業(yè)人員患菌痢或帶菌者污染食品，食品接觸人員個(gè)人衛(wèi)生差，存放已污染的食品溫度不適當(dāng)?shù)?。?guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局的2002年第25和26號(hào)令中明確規(guī)定志賀氏菌為必檢項(xiàng)目。目前對(duì)該菌的檢測(cè)，國(guó)標(biāo)和行標(biāo)多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)的方法，這些方法步驟煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般至少要耗時(shí)4-6天，且由于多種干擾因素的影響，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性容易降低，給食品的進(jìn)出口帶來(lái)了非常不利的影響。因此，建立一種更加快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的致病菌檢測(cè)方法勢(shì)在必行。
目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于食源性病原菌檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)，主要分為三類(lèi)普通PCR技術(shù)、熒光PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)?；蛐酒椒z測(cè)效率高，但技術(shù)還不成熟，假陽(yáng)性率和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術(shù)成熟，也最早用于食源性病原菌的檢測(cè)，但需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，極易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，而且也有一定的非特異性擴(kuò)增。熒光PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性，并且由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了人工判斷的主觀性，又可進(jìn)一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，無(wú)須PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對(duì)性?xún)?nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動(dòng)化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測(cè)任何細(xì)菌的核酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列。
基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對(duì)，以及該引物對(duì)的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，向3’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基，向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物和一個(gè)特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，而在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)就可以由儀器檢測(cè)到，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。


圖1利用引物對(duì)SFipaHpf771/SfipaHpr863和探針SfipaHpb802檢測(cè)志賀氏菌陽(yáng)性樣品的熒光PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式
1.引物和探針設(shè)計(jì)通過(guò)分別對(duì)所有已知的志賀氏菌基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段(志賀氏菌ipaH基因，其序列見(jiàn)附錄)，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下上游引物SFipaHpf771AAATGCGTTTCTATGGCGTGT下游引物SFipaHpr863CCCCAGAGGGAGAACCAGTC探針SfipaHpb802AGCAAATGACCTCCGCACT2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得取志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液1ml進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6個(gè)稀釋度作為系列陽(yáng)性模板，分別提取基因組核酸，再分別用上述檢測(cè)序列區(qū)域中的最長(zhǎng)的擴(kuò)增片段的引物和探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并取其中Ct值24-27之間者作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時(shí)的模板。
2.1 引物濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將志賀氏菌的引物濃度分別從0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2μmol/L。
2.2 鎂離子濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定2.5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。
2.3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化 通過(guò)比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定2U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。
2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化 通過(guò)使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。
2.5 探針濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將志賀氏菌的探針濃度分別從0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.1μmol/L。
利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應(yīng)體系為40μl體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見(jiàn)表1。
表1 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

注a.在熒光PCR反應(yīng)體積不同時(shí)，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
b.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
3.儀器檢測(cè)通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對(duì)所用儀器中反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測(cè)通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。
4.PCR條件選擇如下95℃2min，1個(gè)循環(huán)；95℃5sec，60℃40sec，40個(gè)循環(huán)。
5.檢測(cè)步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測(cè)模板，可采用酚-氯仿法提取各種來(lái)源樣品中志賀氏菌的基因組DNA；(3)反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測(cè)通道；(5)上機(jī)檢測(cè)。
6.實(shí)施例選取引物對(duì)SFipaHpf771/SfipaHpr863和探針SfipaHpb802，將待檢的志賀氏菌培養(yǎng)液用酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)將待檢的志賀氏菌增菌液(約1ml)加入1.5ml的離心管中，12000rpm離心5分鐘，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。
(3)加入等體積的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混勻后離心，13000rpm離心5分鐘。
(4)將上清液移入另一個(gè)1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000rpm離心5分鐘。
(5)將上清液移入另一個(gè)1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心5分鐘。
(6)棄上清后用70％乙醇沖洗，13000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的離心管中加入50ul DNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。在40ul熒光PCR反應(yīng)體系中，加入以上提取的志賀氏菌基因組DNA 2ul，根據(jù)前述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，若待檢培養(yǎng)液中含有志賀氏菌則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1000個(gè)拷貝/ml；若待檢培養(yǎng)液中不含有志賀氏菌則無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的靈敏度和特異性。
7.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1000個(gè)拷貝/ml，說(shuō)明其具有良好的靈敏度。
(2)本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)于不含有志賀氏菌的檢測(cè)樣本均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明其具有良好的特異性。
(3)由于本發(fā)明采用志賀氏菌的內(nèi)源基因ipaH作為擴(kuò)增的目的基因，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。
(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其他核酸檢測(cè)方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性結(jié)果；由于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了監(jiān)測(cè)時(shí)間，節(jié)約了人力物力。
附錄志賀氏菌ipaH基因atgattaaat caaccaatat acaggcaatc ggttctggta ttatgcatca aataaacaat 60atatactcgt taactccatt tcctttacct atggaactga ctccatcttg taatgaattt 120tatttaaaag cctggagtga atgggaaaag aacggtaccc caggcgagca acgcaatatc 180gccttcaata ggctgaaaat atgtttacaa aatcaagagg cagaattaaa tttatctgag 240ttagatttaa aaacattacc agatttaccg cctcagataa caacactgga aataagaaaa 300aacctattaa cacatctccc tgatttacca ccaatgctta aggtaataca tgctcaattt 360aatcaactgg aaagcttacc tgccttaccc gagacgttag aagagcttaa tgcgggtgat 420aacaagataa aagaattacc atttcttcct gaaaatctaa ctcatttacg ggttcataat 480aaccgattgc atattctgcc actattgcca ccggaactaa aattactggt agtttctgga 540aacagattag acagcattcc cccctttcca gataagcttg aagggctggc tatggctaat 600aattttatag aacaactacc ggaattacct tttagtatga acagggctgt gctaatgaat 660aataatctga caacacttcc ggaaagtgtc ctgagattag ctcagaatgc cttcgtaaat 720gttgcaggta atccactgtc tggccatacc atgcgtacac tacaacaaat aaccaccgga 780ccagattatt ctggtcctcg aatatttttc tctatgggaa attctgccac aatttccgct 840ccagaacact ccctggctga tgccgtgaca gcatggttcc cggaaaacaa acaatctgat 900gtatcacaga tatggcatgc ttttgaacat gaagagcacg ccaacacctt ttccgcgttc 960cttgaccgcc tttccgatac cgtctctgca cgcaatacct ccggattccg tgaacaggtc 1020gctgcatggc tggaaaaact cagtgcctct gcggagcttc gacagcagtc tttcgctgtt 1080gctgctgatg ccactgagag ctgtgaggac cgtgtcgcgc tcacatggaa caatctccgg 1140aaaaccctcc tggtccatca ggcatcagaa ggccttttcg ataatgatac cggcgctctg 1200ctctccctgg gcagggaaat gttccgcctc gaaattctgg aggacattgc ccgggataaa 1260gtcagaactc tccattttgt ggatgagata gaagtctacc tggccttcca gaccatgctc 1320gcagagaaac ttcagctctc cactgccgtg aaggaaatgc gtttctatgg cgtgtcggga 1380gtgacagcaa atgacctccg cactgccgaa gccatggtca gaagccgtga agagaatgaa 1440tttaaggact ggttctccct ctggggacca tggcatgctg tactgaagcg tacggaagct 1500gaccgctggg cgcaggcaga agagcagaag tatgagatgc tggagaatga gtactctcag 1560agggtggctg accggctgaa agcatcaggt ctgagcggtg atacggatgc ggagagggaa 1620gccggtgcac aggtgatgcg tgagactgaa cagcagattt accgtcagtt gactgacgag 1680gtactggccc tgcgattgtc tgaaaacggc tcaaatcata tcgcataa 1730
序列表<110>深圳太太基因工程有限公司<120>一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1aaatgcgttt ctatggcgtg t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccccagaggg agaaccagtc 20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3agcaaatgac ctccgcact19
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對(duì)，以及該引物對(duì)的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，向3’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基，向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC。
3.一種用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)志賀氏菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT。
全文摘要
一種用于志賀氏菌核苷酸片段的PCR擴(kuò)增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對(duì)，以及該引物對(duì)的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，向3’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基，向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針SFipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1831141SQ20051012089
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者肖性龍, 張經(jīng)緯 申請(qǐng)人:深圳太太基因工程有限公司