專利名稱：海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種大型經(jīng)濟(jì)藻類--海帶種質(zhì)的海帶配子體固相保存方法。
背景技術(shù)：
海帶(Laminaria japonica Aresch)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)藻類，海帶生活史分兩個(gè)明顯的世代階段孢子體世代和配子體世代，配子體世代是海帶的單倍體階段，在該階段將雌配子體和雄配子體單個(gè)分離培養(yǎng)，可形成無(wú)性繁殖系。20世紀(jì)70年代方宗熙等成功分離培養(yǎng)了海帶雌雄配子體，建立了無(wú)性繁殖系，也稱克隆。崔竟進(jìn)等進(jìn)行了海帶配子體弱光保存的研究，吳超元等提出了適宜配子體克隆生長(zhǎng)的因子為溫度10-15℃，光照2000-3000lx，N6-8g/m3，P0.8-1g/m3。傳統(tǒng)的種質(zhì)保存技術(shù)就是將無(wú)性系繼代培養(yǎng)保存，傳統(tǒng)保存技術(shù)具有明顯的不足(1)液體培養(yǎng)是唯一的保存途徑，手段單一，限制了保存的規(guī)模和效率；(2)液體培養(yǎng)保存一般需要在半月內(nèi)更新一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質(zhì)污染及混雜的機(jī)會(huì)；(3)采孢子前無(wú)法對(duì)種海帶進(jìn)行無(wú)菌處理，整個(gè)保存過(guò)程都在有菌條件下，不能徹底杜絕微生物尤其雜藻的污染；(4)培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)異常、單性生殖等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，培養(yǎng)因子有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此，目前的保種技術(shù)是一種傳統(tǒng)的繼代培養(yǎng)保存的方法，無(wú)法完全排除混雜、污染、變異的可能性。
這些缺點(diǎn)限制了海帶配子體克隆作為海帶育苗與育種主要材料的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)已有技術(shù)的不足而提供一種不使用液體培養(yǎng)保存、保存時(shí)間長(zhǎng)，后期操作簡(jiǎn)單，為航天育種技術(shù)在海藻的育種中應(yīng)用提供了可能的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，是選取海帶雌雄配子體克隆進(jìn)行，其特點(diǎn)是該方法包括以下步驟固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、配子體克隆的粉碎、配子體的接種、固相培養(yǎng)、固相保存以及固相培養(yǎng)保存配子體的復(fù)蘇擴(kuò)培。
固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制是0.8-1％瓊脂的PESI培養(yǎng)基，高壓滅菌，待冷卻至60-70℃，加入終濃度為50-150μg/ml卡那霉素，用直徑9cm的培養(yǎng)皿倒平板。
配子體克隆的粉碎是取液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體20-40mg，無(wú)菌條件下進(jìn)行超聲粉碎，粉碎的條件，功率400W粉碎4-8次、每次8-10s，然后功率200W粉碎10-16次、每次8-10s，將配子體克隆粉碎為1-4個(gè)細(xì)胞。
配子體的接種是超凈臺(tái)中，用10ml一次性無(wú)菌注射器取2ml左右粉碎的配子體細(xì)胞，逐點(diǎn)注射入一個(gè)平板內(nèi)，接種后，用param膜密封培養(yǎng)皿。
固相培養(yǎng)是在溫度8-10℃，光強(qiáng)1500-2500lx，光時(shí)24h；或是溫度5℃冷藏柜中，保持自然光照。
固相保存是固相培養(yǎng)3個(gè)月后，在瓊脂上的藻斑直徑為2-3mm、表面略顯干燥、配子體克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)時(shí)，在瓊脂上加入4-5ml水，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入5℃冷藏柜中，進(jìn)入保存程序，每半月觀察一次，三個(gè)月?lián)Q水一次。
固相培養(yǎng)保存配子體的擴(kuò)培是取瓊脂上生長(zhǎng)的藻斑于PESI液體培養(yǎng)基中，在溫度8-10℃、光強(qiáng)1500-2500lx、光時(shí)24h的條件下復(fù)蘇2天，然后取出，用機(jī)械法磨碎，再次放入PESI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可，30天長(zhǎng)成簇狀體后可再次粉碎擴(kuò)培。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點(diǎn)和積極效果采用本發(fā)明方法在溫度8-10℃，光強(qiáng)1500-2500lx，光時(shí)24h條件下，固相培養(yǎng)3天后，細(xì)胞邊緣變圓；10天后開(kāi)始有分支的新分裂的細(xì)胞出現(xiàn)；30天后，分支的細(xì)胞數(shù)為2-3個(gè)，分支數(shù)與原來(lái)細(xì)胞數(shù)相同，并在分支上出現(xiàn)新的分支；60天后，原分支細(xì)胞數(shù)4-6個(gè)，新分支仍在出現(xiàn)；90天長(zhǎng)成簇狀體，肉眼觀察表現(xiàn)為藻斑；液體對(duì)照培養(yǎng)的配子體明顯快于固相培養(yǎng)，3天后即出現(xiàn)新分支，10天后分支的新細(xì)胞數(shù)為4-5個(gè)；20天后新分支的細(xì)胞數(shù)達(dá)到2-3個(gè)；30天后長(zhǎng)成簇狀體；固相與液相培養(yǎng)海帶配子體生長(zhǎng)情況比較見(jiàn)下表。
四、具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1，海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，是選取海帶品種“早厚成”雌配子體克隆進(jìn)行，經(jīng)過(guò)固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、配子體克隆的粉碎、配子體的接種、固相培養(yǎng)、固相保存以及固相培養(yǎng)保存配子體的復(fù)蘇擴(kuò)培；固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制是0.8-1％瓊脂的PESI培養(yǎng)基，高壓滅菌，待冷卻至65℃，加入終濃度為100μg/ml卡那霉素，用直徑9cm的培養(yǎng)皿倒平板；配子體克隆的粉碎是取液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體30mg，無(wú)菌條件下進(jìn)行超聲粉碎，粉碎的條件，功率400W粉碎6次、每次9s，然后功率200W粉碎，粉碎12次、每次10s，將配子體克隆基本粉碎為1-4個(gè)細(xì)胞；配子體的接種是超凈臺(tái)中，用10ml一次性無(wú)菌注射器取2ml左右粉碎的配子體細(xì)胞，逐點(diǎn)注射入一個(gè)平板內(nèi)，接種后，用param膜密封培養(yǎng)皿；固相培養(yǎng)是在溫度8-10℃，光強(qiáng)1500-2500lx，光時(shí)24h；固相保存是固相培養(yǎng)3個(gè)月后，在瓊脂上的藻斑直徑為2mm、表面略顯干燥、配子體克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)時(shí)，在瓊脂上加入4ml水，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入5℃冷藏柜中，進(jìn)入保存程序，每半月觀察一次，三個(gè)月?lián)Q水一次；固相培養(yǎng)保存配子體的擴(kuò)培是取瓊脂上生長(zhǎng)的藻斑于PESI液體培養(yǎng)基中，在溫度8-10℃、光強(qiáng)1500-2500lx、光時(shí)24h的條件下復(fù)蘇2天，然后取出，用機(jī)械法磨碎，再次放入PESI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可，30天長(zhǎng)成簇狀體后可再次粉碎擴(kuò)培。
實(shí)施例2，海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，是選取海帶品種“早厚成”雄配子體克隆進(jìn)行，經(jīng)過(guò)固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、配子體克隆的粉碎、配子體的接種、固相培養(yǎng)、固相保存以及固相培養(yǎng)保存配子體的復(fù)蘇擴(kuò)培；固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制是0.8-1％瓊脂的PESI培養(yǎng)基，高壓滅菌，待冷卻至60℃，加入終濃度為95μg/ml卡那霉素，用直徑9cm的培養(yǎng)皿倒平板；配子體克隆的粉碎是取液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體35mg，無(wú)菌條件下進(jìn)行超聲粉碎，粉碎的條件，功率400W粉碎8次、每次10s，然后功率200W粉碎粉碎10次、每次8s，將配子體克隆基本粉碎為1-4個(gè)細(xì)胞；配子體的接種是超凈臺(tái)中，用10ml一次性無(wú)菌注射器取2ml左右粉碎的配子體細(xì)胞，逐點(diǎn)注射入一個(gè)平板內(nèi)，接種后，用param膜密封培養(yǎng)皿；固相培養(yǎng)是在溫度5℃冷藏柜中，保持自然光照；固相保存是固相培養(yǎng)4個(gè)月，在瓊脂上的藻斑直徑為3mm、表面略顯干燥、配子體克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)時(shí)，在瓊脂上加入5ml水，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入5℃冷藏柜中，進(jìn)入保存程序，每半月觀察一次，三個(gè)月?lián)Q水一次；固相培養(yǎng)保存配子體的擴(kuò)培是取瓊脂上生長(zhǎng)的藻斑于PESI液體培養(yǎng)基中，在溫度8-10℃、光強(qiáng)1500-2500lx、光時(shí)24h的條件下復(fù)蘇2天，然后取出，用機(jī)械法磨碎，再次放入PESI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可，30天長(zhǎng)成簇狀體后可再次粉碎擴(kuò)培。
在本發(fā)明固相培養(yǎng)的條件下，3個(gè)月藻斑直徑可以達(dá)到2-3毫米，海帶配子體克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)，加液體培養(yǎng)基后可在冷藏柜中長(zhǎng)時(shí)間保存，復(fù)蘇后海帶配子體的生物特性保持不變。
權(quán)利要求
1.海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，是選取海帶雌雄配子體克隆進(jìn)行，其特征是該方法包括以下步驟固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、配子體克隆的粉碎、配子體的接種、固相培養(yǎng)、固相保存以及固相培養(yǎng)保存配子體的復(fù)蘇擴(kuò)培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制是0.8-1％瓊脂的PESI培養(yǎng)基，高壓滅菌，待冷卻至60-70℃，加入終濃度為50-150μg/ml卡那霉素，用直徑9cm的培養(yǎng)皿倒平板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是配子體克隆的粉碎是取液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體20-40mg，無(wú)菌條件下進(jìn)行超聲粉碎，粉碎的條件，功率400W粉碎4-8次、每次8-10s，然后功率200W粉碎10-16次、每次8-10s，將配子體克隆粉碎為1-4個(gè)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是配子體的接種是超凈臺(tái)中，用10ml一次性無(wú)菌注射器取2ml左右粉碎的配子體細(xì)胞，逐點(diǎn)注射入一個(gè)平板內(nèi)，接種后，用param膜密封培養(yǎng)皿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是固相培養(yǎng)是在溫度8-10℃，光強(qiáng)1500-2500lx，光時(shí)24h；或是溫度5℃冷藏柜中，保持自然光照。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是固相保存是固相培養(yǎng)3個(gè)月后，在瓊脂上的藻斑直徑為2-3mm、表面略顯干燥、配子體克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)時(shí)，在瓊脂上加入4-5ml水，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入5℃冷藏柜中，進(jìn)入保存程序，每半月觀察一次，三個(gè)月?lián)Q水一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，其特征是固相培養(yǎng)保存配子體的擴(kuò)培是取瓊脂上生長(zhǎng)的藻斑于PESI液體培養(yǎng)基中，在溫度8-10℃、光強(qiáng)1500-2500lx、光時(shí)24h的條件下復(fù)蘇2天，然后取出，用機(jī)械法磨碎，再次放入PESI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可，30天長(zhǎng)成簇狀體后可再次粉碎擴(kuò)培。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了海帶配子體固相培養(yǎng)保存方法，是選取海帶雌雄配子體克隆進(jìn)行，包括以下步驟固相培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、配子體克隆的粉碎、配子體的接種、固相培養(yǎng)、固相保存以及固相培養(yǎng)保存配子體的復(fù)蘇擴(kuò)培，本發(fā)明具有使用液體培養(yǎng)保存、保存時(shí)間長(zhǎng)，后期操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，為航天育種技術(shù)在海藻的育種中應(yīng)用提供了可能。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1793337SQ20051012327
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日
發(fā)明者唐永政, 張全勝, 張壯志, 孫娟, 金瑜, 王萍 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司, 煙臺(tái)大學(xué)