專利名稱：：檢測(cè)黑素瘤的方法和試劑的制作方法檢測(cè)黑素瘤的方法和試刑發(fā)明背景皮膚的惡性黑素瘤是一種發(fā)病率逐漸增加的常見的、迅速發(fā)展的癌癥。它是一種嚴(yán)重的健康問題，預(yù)計(jì)2004年美國將有超過55,100個(gè)新病例，死亡率將是大約14.5%CancerFactsandFigures2003。AmericanCancerSociety,2003。黑素瘤的發(fā)病率持續(xù)增長，超過任何其它惡性腫瘤'DeBraudetal.(2003)。盡管早期局部黑素瘤的預(yù)后是有利的，即，5年總體存活率高于90%,但局部淋巴結(jié)累及使總體存活率降低到10-46%。Balchetal.(2001),因此，局部淋巴結(jié)(LN)狀況成為黑素瘤患者存活率的最重要預(yù)后因素。崗哨淋巴結(jié)(SLN)技術(shù)的引入(Morton(1992))與單獨(dú)的H&E染色相比，增加了黑素瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的靈敏度。Yuetal.(1999);和Messinaetal.(1999)。然而，即使通過rac得到增強(qiáng)，組織分析仍然受到光學(xué)顯微鏡識(shí)別胂瘤細(xì)胞的能力的限制。最近提出了逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析，用于更靈敏檢測(cè)LN中的黑素細(xì)胞。當(dāng)采用充分表征的黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物如璐氨酸酶和MART-1時(shí)，很多研究證明了這些基因轉(zhuǎn)錄物存在于通過常規(guī)組織學(xué)和IHC發(fā)現(xiàn)是陰性的LNs中。Shiversetal.(1998);和Kuoetal.(2003)。但是，這些基因?qū)δ[瘤細(xì)胞不是特異性的，不能用于區(qū)分良性和惡性組織。實(shí)際上，它們?cè)诹夹择拇嬖谙聦?dǎo)致了假陽性結(jié)果，Takeuchietal,(2004);Starzetal.(2003);和Giitzmeretal.(2002)?？紤]到良性痣在黑素瘤SLN中并非少見，目前的RT-PCR分析對(duì)于黑素瘤微轉(zhuǎn)移的診斷并不是臨床有用的.最近的一項(xiàng)研究提出了多標(biāo)志物組，包括用于RT-PCR分析的癌癥特異性標(biāo)志物，以增加分析的特異性.Hoonetal.(2004)。新的黑素瘤特異性標(biāo)志物的鑒定仍然是黑素瘤研究的關(guān)鍵問題之一.已經(jīng)證明了某些蛋白與黑素瘤及其轉(zhuǎn)移相關(guān)。已經(jīng)將這些蛋白或其活性用于IHC中，以鑒定轉(zhuǎn)移，這些蛋白包括L1CAM(Thiesetal.(2002);Fogeletal.(2003));和S-100(Diegoetal.(2003))。已經(jīng)提出了增加檢測(cè)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的靈敏度的核酸測(cè)試。美國專利公開Nos.2002/0110820和2003/0232356。研究采用的標(biāo)志物包括MAGE3、輅氨酸酶、MART曙1，MITF-M或IL-1、Rl、內(nèi)皮縮血管肽-2、肝配蛋白-A5、IGF結(jié)合蛋白7、HLA-A0202重鏈、激活蛋白A(PA亞基)、TNFRH、SPC4、CNTFRa或gplOO(HMB45)基因，Bosticketal.(1999);Hoonetal.(2001);Palmierietal.(2001);Wrightsonetal.(2001);Gutzmeretal.(2002);Davidsetal.(2003);Starzetal.(2003);Rimboldietal.(2003);Cooketal(2003);Reintgenetal.(2004);美國專利公開Nos.2002/0098535;2003/0049701;美國專利Nos.5,512,437;5，512，444;5，612，201;5,759,783;5,844,075;6，025，474;6,057,105;6,235,525;6,291,430;6,338,947;6,369,211;6，426，217;6,475,727;6，500，919;6，527，560;6,599,699;WO96/29430。確定后，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物不足以在黑素瘤診斷中進(jìn)行確定的使用，Riccionietal.(2002);Gutzmeretal.(2002);Davidsetal.(2003);Goydosetal.(2003);和Prichardetal.(2003),也發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物中的許多表明了其它腫瘤，如ME20M(GP100)表明透明細(xì)胞肉瘤、膽管癌和胃癌。Hiragaetal.(1997);Okadaetal.(2001);Okamietal.(2001);Antonescuetal.(2002);Segaletal.(2003)。MAGE3也表明許多腫瘤，包括乳腺、肝細(xì)胞、腎、神經(jīng)、肺和食道腫瘤，Yamanakaetal.(1999);Ookaetal.(2000);Suzukietal.(2000);Cheungetal.(2001);和Weiseretal.(2001)。一些黑素瘤抗原編碼基因也在肺癌中表達(dá).Yoshimatsuetal.(1998)。證明了這些標(biāo)志物是靈敏但非特異性的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄渌┌Y和良性黑素細(xì)胞中也表現(xiàn)出陽性表達(dá)。此外，酪氨酸酶也在正常淋巴結(jié)中存在的施旺細(xì)胞中表達(dá).特異性的缺乏使得需要開發(fā)新的或額外標(biāo)志物的分析。H&E組織學(xué)和IHC仍然是"鑒定SLNs中的黑素瘤和痣細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)"。Starzetal.(2003)。手術(shù)中的檢測(cè)問題使得該需要更急迫。淋巴結(jié)累及在很多實(shí)體瘤中是最強(qiáng)的預(yù)后因素，而且淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)是病理學(xué)家和外科醫(yī)生最為關(guān)注的，目前的淋巴結(jié)評(píng)估涉及H&E染色組織切片的顯微鏡檢查，并有三個(gè)主要局限性(a)容易遺漏小的細(xì)胞灶；(b)不能快速獲得結(jié)果，意味著SLN程序的任何陽性結(jié)果需要第二次外科手術(shù)來切除腋窩淋巴結(jié)和(c)只研究了一個(gè)或兩個(gè)組織切片，因此每個(gè)淋巴結(jié)的大部分沒有被檢驗(yàn)。連續(xù)切片有助于克服取樣誤差問題，而IHC可有助于鑒定小的細(xì)胞灶.但是，這些方法的組合對(duì)于常規(guī)分析來說過于昂責(zé)和費(fèi)時(shí).局部淋巴結(jié)解剖的手術(shù)確定可以基于手術(shù)中的淋巴結(jié)冷凍切片分析；但是，這些方法的靈敏度相對(duì)較差，是標(biāo)準(zhǔn)H&E病理學(xué)的50-70°/。，導(dǎo)致另一次手術(shù)的可能性很大.因此，病理學(xué)家常規(guī)不進(jìn)行黑素瘤患者的手術(shù)中冷凍切片分析或接觸印跡細(xì)胞學(xué)分析。黑素瘤的手術(shù)中分析的靈敏度和特異性的改進(jìn)將對(duì)腫瘤學(xué)具有顯著益處.已經(jīng)將高密度微陣列用于同時(shí)監(jiān)測(cè)生物樣品中數(shù)千種基因的表達(dá)。研究導(dǎo)致鑒定了在良性和惡性病變中差異表達(dá)的基因，以及可能具有預(yù)后價(jià)值的基因'Luoetal.(2001);和Wangetal.(2004)。用含有8，150種cDNAs的探針的微陣列實(shí)現(xiàn)了惡性黑素瘤的基因表達(dá)謙分析。Bittneretal.(2000).這些研究者鑒定了一些可能與發(fā)展迅速的腫瘤行為相關(guān)的基因.在最近的研究中，比較了一些黑素瘤和正常黑色細(xì)胞系的基因表達(dá)諳，導(dǎo)致鑒定了在黑素瘤中差異表達(dá)的基因和受到調(diào)節(jié)的途徑。Takeuchietal.(2004).發(fā)明概述本發(fā)明提供了廣泛的一組臨床上相關(guān)的組織樣品的基因表達(dá)詳分析.在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)來自45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮趺痣和7個(gè)正常皮膚組織的總RNA進(jìn)行了雜交。鑒定了與良性組織相比，在惡性黑素瘤中差異表達(dá)的基因.差異表達(dá)的基因的途徑分析發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)組織發(fā)育相關(guān)的基因的超量表達(dá)，以及淀粉樣蛋白加工信號(hào)傳遞途徑的激活。用一步定量RT-PCR分析檢驗(yàn)一組臨床上相關(guān)的樣品中兩種黑素瘤特異性基因，即PLAB和L1CAM的組合，所述樣品包括原發(fā)性惡性黑素瘤、良性痣、黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和無黑素瘤的淋巴結(jié)樣品.本發(fā)明提供了通過以下步稞鑒定黑素瘤的方法獲得組織樣品；分析和測(cè)量樣品中編碼相應(yīng)于前列腺分化因子(PLAB，MIC1)(SEQIDNO:1)和Ll細(xì)胞粘附分子(L1CAM)(SEQIDNO:2);或PLAB、L1CAM和3型神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激蘇受體(NTRK3)(SEQIDNO:3)的mRNA的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過以下步聚鑒定黑素瘸的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼由引物/探針20組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的mRNA的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明也提供了通過以下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼PLAB和L1CAM;或PLAB、L1CAM和NTRK3的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明也提供了通過以下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中由引物/探針組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過以下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼PLAB和L1CAM;或PLAB、L1CAM和NTRK3的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過以下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中由引物/探針組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4畫6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了其它標(biāo)志物和對(duì)照基因，其表達(dá)輔助要求保護(hù)的方法.這些額外的基因包括受到上調(diào)的SEQIDNOs:29-467和受到下調(diào)的SEQIDNOs:468-978.一級(jí)標(biāo)志物可以是PLAB,并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:1,PLAB也由Paralkaretal.(1998)描述，并且由編號(hào)AF003934表示.PLAB也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:4-9識(shí)別的mRNA的基因。二級(jí)標(biāo)志物可以是L1CAM，并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:2。LICAM也由Haspeletal(2003)和美國專利No.6，107，476描述，并且由編號(hào)NM一000425表示。LICAM也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:10-15識(shí)別的mRNA的基因.本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于進(jìn)行分析以確定細(xì)胞中樣品黑素瘤存在的試劑盒，其中包含核酸擴(kuò)增和檢測(cè)試刑.本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增和檢測(cè)本發(fā)明的方法獲得的PCR產(chǎn)物的引物/探針組，這些組包括以下序列SEQIDNO:4(PLAB正向引物)ggcagaatcttcgtccgca5(PLAB反向引物)ggacagtggtccccgttg6(PLAB探針)cccagetggagttgcacttgcggcc7(PLAB上引物)gaacacegacctcgtccc8(PLAB下引物)ggcggcccgagagata9(PLAB探針)cgccagaagtgcggctgggatttSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQIDNO:IDNO:IDNO:IDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNO101112131415161718192021222324LICAM正向)gctgggactgggaacagaactLICAM反向)ggagcagagatggcaaagaaaLICAM探針)"ccccaccatctgctgtUCAM上)ccacagatgacatcagcctcaaLICAM下)ggtcacacccagctcttccttLICAM探針)tggcaagcccgaagtgcagttccttNTRK3引物)gccccggcaccctttaNTRK3引物)aaccctgccagtggtggatNTRK3探針)cagatgggtgttttcTyr上)actcagcccagcatcattcttcTyr下)atggetgttgtactcctccaatcTyr探針)cttctcctcttggcagattgtctgtagcttPBGD上)ccacacacagcctactttccaaPBGD下)tacccacgcgaatcactctcaPBGD探針)aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過本發(fā)明方法利用的PCR方法獲得的擴(kuò)增子.這些擴(kuò)增子包括以下序列SEQIDNO:25(PLAB擴(kuò)增子)cggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgccSEQIDNO:26(L1CAM擴(kuò)增子)gggatggtgtccacttcaaacccaaggaagagctgggtgtgaccSEQIDNO:27(酪氨酸蘇擴(kuò)增子)atSEQIDNO:28(PBGD擴(kuò)增子)ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaaaacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta。本文描述的其它基因包括受到上調(diào)的標(biāo)志物(SEQIDNOs:29-467)、受到下調(diào)的標(biāo)志物(SEQIDNOs:468-978)、PBGD(SEQIDNO:979)、MARTI(SEQIDNO:980)、ME20M(GP100;SEQIDNO:981)和MAGE-3(SEQIDNO:982)以及用于檢測(cè)其表達(dá)的多種引物和探針(SEQIDNOs:983-1011)。附困簡述圖l.數(shù)據(jù)分析的流程圖.困1對(duì)所有樣品中具有至少2次"存在"信號(hào)的15,795種基因的等級(jí)簇集(hierarchicalclustering).每一列是樣品，每一行是基因，紅色是上調(diào)，綠色是下調(diào).紫色黑素瘤樣品；黃色良性痣；藍(lán)色正常皮膚.圖3.選定的基因的微陣列表達(dá)(A)和實(shí)時(shí)RT-PCR證實(shí)數(shù)據(jù)(B)。從左側(cè)開始的前14種樣品是黑素瘸組織樣品(紅色)；隨后的7種是良性痣樣品(黃色)，最后5種是正常皮膚(藍(lán)色).對(duì)于微陣列曲線，x軸表示強(qiáng)度值；對(duì)于PCR曲線，x軸是2"T,其中ACt是Ct(靶基因)-CtPBGD.困4.淀粉樣蛋白加工途徑.獲自IngenuityTM途徑分析軟件應(yīng)用。在黑素瘤中上調(diào)的基因是紅色，在黑素瘤中下調(diào)的基因是綠色。每個(gè)23基因符號(hào)后面是黑素瘤和良性/正常樣品之間的表達(dá)水平改變倍數(shù)。圖5.PLAB和L1CAM(A)以及常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物gp100、酪氨酸酶(SEQIDNO:999)和MARTI(B)的一步定量RT-PCR分析。對(duì)于每個(gè)曲線，x軸代表新標(biāo)志物或常規(guī)標(biāo)志物的評(píng)分。標(biāo)出了每個(gè)樣品分類的中值評(píng)分.在每個(gè)曲線上標(biāo)出了基于正常(綠色)和良性(紅色)樣品的兩個(gè)截止水平。詳述本發(fā)明提供了定性和定量鑒定黑素瘤；區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞；診斷具有不明確的病理特征的黑素細(xì)胞病變；以及確定黑素瘤患者治療方案的方法.這些方法進(jìn)一步提供了對(duì)患者預(yù)后、患者監(jiān)測(cè)和藥物開發(fā)的輔助，這些方法依賴于分析和測(cè)量編碼本文提供的mRNAs的多種標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，其中超過預(yù)定截止水平的基因表達(dá)表明測(cè)定的樣品中存在惡性黑素細(xì)胞。皮膚的黑素瘤是一種發(fā)病率逐漸增加的常見的、迅速發(fā)展的癌癥。對(duì)黑素瘤特異性的受到下調(diào)的基因的鑒定可以提供用于LN分期分析和進(jìn)一步指示黑素瘤腫瘤發(fā)生的分子標(biāo)志物。在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)來自45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、l8個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織的總RNA進(jìn)行了雜交。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)了來自良性和正常標(biāo)本的黑素瘤樣品的明顯分離。鑒定了與惡性黑素瘤相關(guān)的新基因。用一步定量RT-PCR分析在原發(fā)性惡性黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品和惡性黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和無黑素瘤的淋巴結(jié)上檢測(cè)了兩種黑素瘤特異性基因，即PLAB和L1CAM的差異基因表達(dá)。將這些標(biāo)志物的性能與常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物如酪氨酸酶、gplOO和MARTI進(jìn)行比較，結(jié)果證明在RT-PCR分析中用PLAB和LICAM的組合區(qū)分含有良性或惡性黑素細(xì)胞的臨床上相關(guān)的組織樣品的能力。高密度cDNA和寡核苷酸微陣列使得能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)千種基因的表達(dá).微陣列技術(shù)提供了mRNA豐度的定量測(cè)量，并且被接受為基于基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的工具。在癌癥研究內(nèi)容中，微陣列分析鑒定了在良性和惡性病變、不同癌癥類型中差異表達(dá)，或具有預(yù)后意義的基因。Luoetal.(2001);Suetal.(2001);Henshalletal.(2003);和Wangetal.(2004)。惡性黑素瘤的笫一次基因表達(dá)謙分析采用了含有8，150種cDNAs的探針的微陣列，并且^定了可能與迅速發(fā)展的腫瘤行為相關(guān)的基因.Bittneretal.(2000).由于在它們的研究中分析的樣品不包括含有正?；蛄夹院谒丶?xì)胞的組織，沒有鑒定惡性黑素瘤中差異表達(dá)的基因.與正常皮膚相反，良性痣中的黑素細(xì)胞含量與黑素瘤中的含量接近.在另一種研究中，將來源于黑素瘤或良性痣組織的兩種合并的樣品與cDNA陣列雜交，并且發(fā)現(xiàn)了優(yōu)先在來源于黑素瘤或痣的樣品中表達(dá)的基因.Seykoraetal.(2003).其它研究者采用了扣除雜交或在黑素瘤細(xì)胞系上產(chǎn)生的SAGE文庫的分析，用于監(jiān)測(cè)黑素瘤中的基因表達(dá)，Hipfeletal.(2000);和Weeraratna(2004)。最近，對(duì)一些黑素瘤和黑素細(xì)胞系的基因表達(dá)詳?shù)谋容^導(dǎo)致鑒定了在黑素瘤中差異表達(dá)的基因和受調(diào)節(jié)的途徑。Hoeketal.(2004).盡管這些研究提供了黑素瘤遣傳學(xué)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，但還沒有明確區(qū)分黑素瘤和良性組織的標(biāo)志物。目前使用的一些標(biāo)志物，如駱氨酸酶和Mart-l，不能區(qū)分良性和惡性組織'Takeuchietal.(2004),因此，這些標(biāo)志物在諸如手術(shù)中基于淋巴結(jié)的疾病分期中的作用有限.從惡性黑素瘤和良性黑素細(xì)胞病變獲得足夠RNA樣品的困難、組織異質(zhì)性和黑色素在純化的DNA中的存在仍然是這些研究的主要挑戰(zhàn)'在此處所示的研究中，在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)從45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織分離的總RNA進(jìn)行了雜交。開發(fā)了改進(jìn)的RNA提取方法，以制備增加微陣列雜交信號(hào)的不含黑色素的RNA樣品。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)黑素瘤樣品與良性和正常標(biāo)本的顯著分離，微陣列(SAM)法的顯著性分析、t檢驗(yàn)和百分比分析鑒定出了黑素瘤樣品中的439種受到上調(diào)的(SEQIDNOs:29-467)和511種受到下調(diào)的(SEQIDNOs:468-978)基因。除了充分表征的基因，如me20m(gp100)、黑皮質(zhì)素受體1和L1CAM，鑒定了很多以前認(rèn)為與黑素瘤無關(guān)的新基因，包括NTKR3和PLAB。差異表達(dá)的基因的途徑分析發(fā)現(xiàn)基因的超量表達(dá)與神經(jīng)組織發(fā)育和功能、淀粉樣蛋白加工和整聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑的激活相關(guān)。進(jìn)行了RT-PCR分析，證實(shí)了選定的基因的差異表達(dá)。這里提供的方法具有檢測(cè)黑素瘤轉(zhuǎn)移的足夠的特異性和靈敏度。目前方法的比較表明H&E和IHC的傳統(tǒng)方法是臨床上可接受的，而在本發(fā)明之前，PCR方法是不能接受的.表l顯示了在此處要求保護(hù)的本發(fā)明之前，目前方法的缺陷和優(yōu)點(diǎn).表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在本發(fā)明中，基于與H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，特異性優(yōu)選是至少95°/。，更優(yōu)選地，特異性是至少97%，最優(yōu)選地，特異性是至少99%.優(yōu)選地，基于與H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，靈敏度是至少80%，更優(yōu)選地，靈敏度是至少85%,最優(yōu)選地，靈敏度是至少90%。優(yōu)選地，基于與H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，特異性和靈敏度是至少97%，基于與H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，特異性和靈敏度是至少85。/。。優(yōu)選地，預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中至少2倍超量表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選方法利用了從組織樣品提取核酸的快速技術(shù)和擴(kuò)增和檢測(cè)表明轉(zhuǎn)移的核酸片段的方法.核酸片段定性和定量測(cè)量了標(biāo)志物基因編碼的mRNA.組織樣品包括淋巴結(jié)，即局部和崗哨淋巴結(jié)、皮膚病變和其它活檢材料。本發(fā)明提供的方法使得能夠進(jìn)行微轉(zhuǎn)移的手術(shù)中檢測(cè)，使得醫(yī)生能夠確定是否切除額外的淋巴結(jié)并且立即采用合適的治療方案。如表2中所示，如果發(fā)現(xiàn)LN是黑素瘤陽性的，則切除局部淋巴結(jié)，并且可以建議干擾素治療.可以進(jìn)行一周的標(biāo)準(zhǔn)活檢方法，陽性結(jié)果需要額外的手術(shù)來除去LNs，并且伴隨干擾素治療的延遲。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>重要的是對(duì)用于進(jìn)行分析的組織進(jìn)行足夠的取樣。這包括適當(dāng)?shù)那谐图庸そM織樣品，以及提取RNA。一旦獲得，重要的是適當(dāng)?shù)丶庸そM織樣品，以便檢測(cè)存在的任何癌細(xì)胞，在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在手術(shù)中和手術(shù)外也關(guān)注淋巴結(jié)取樣。由于淋巴結(jié)中癌細(xì)胞的分布是非均勻的，優(yōu)選地是對(duì)淋巴結(jié)的多個(gè)切片進(jìn)行取樣。應(yīng)該對(duì)每個(gè)鑒定的SLN進(jìn)行病理評(píng)估。通常在福爾馬林中固定SLN材科，檢驗(yàn)福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織樣品。加工SLN的具有相同代表性的部分，用于分子分析(新組織)和組織學(xué)(固定的組織)。通用的LN取樣程序描述于Cochranetal,(2001);和Cochranetal.(2004)。實(shí)現(xiàn)基于分子的檢測(cè)和通過病理學(xué)檢驗(yàn)相同淋巴結(jié)樣品的一種方法是沿最長直徑解剖淋巴結(jié)。然后將每一半分成至少4個(gè)完整面的切片，至少一個(gè)外和內(nèi)切片作為固定材料用于病理學(xué)，至少一個(gè)外和內(nèi)切片用于分子檢測(cè)。由于轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的分布在淋巴結(jié)或其它組織中是不均勻的，應(yīng)該獲得足夠大的樣品，以便不遣漏轉(zhuǎn)移。本方法中的該取樣問題的一種方法是對(duì)大的組織樣品進(jìn)行勻漿，隨后稀釋用于隨后的分子檢測(cè)的充分混合的勻漿樣在LN組織樣品的情況下，優(yōu)選的是在細(xì)胞破壞之前除去任何脂肪組織?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行手工細(xì)胞和組織破壞，如美國專利4，715，545中描述的一次性組織研磨器或可商購的勻漿器如具有一次性探頭的OmniGLH115(OmniInternational,Warrenton，VA)。勻漿時(shí)間是1-2分鐘內(nèi)，更優(yōu)選是30-45秒，然后可以加工樣品，以純化RNA，然后分析和測(cè)量標(biāo)志物表達(dá)水平。合適的RNA純化方法包括柱子，如(例如RNeasymini柱，QIAshredder,QIAGENInc.，Valencia,CA或合適的替代物).多種技術(shù)可以用于從組織樣品提取核酸。典型的可商購核酸提取試劑盒用至少15分鐘來提取核酸.在本發(fā)明的優(yōu)選手術(shù)中方法中，在少于8分鐘，優(yōu)選少于6分鐘的時(shí)間內(nèi)提取核酸.完整RNA的成功分離通常包括4步有效破壞細(xì)胞或組織，核蛋白復(fù)合體的變性、內(nèi)源性核糖核酸酶(RNase)的滅活和污染DNA和蛋白的去除。異硤氛酸胍(GITC)和p-巰基乙醇(p-me)滅活第一步的優(yōu)選試劑。當(dāng)與諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)的表面活性劑聯(lián)合使用時(shí)，實(shí)現(xiàn)了核蛋白復(fù)合體的破壞，使得RNA能夠釋放到溶液中，并且經(jīng)過分離而不含蛋白.在含有GITC的裂解緩沖液中對(duì)組織進(jìn)行勻漿，乙醇的加入建立了使RNA結(jié)合二氣化硅膜的合適條件。離心可以使沉淀的蛋白和細(xì)胞DNA的裂解液澄清，優(yōu)選是通過柱子進(jìn)行的。RNA純化優(yōu)選在含有二氧化硅或其它材料的旋轉(zhuǎn)柱上進(jìn)行的。按照上文所述通過旋轉(zhuǎn)柱沉淀RNA,離心時(shí)間優(yōu)選不超過30秒。典型地，用等體積的70%乙醇稀釋樣品，在加樣到柱子前徹底混合。洗滌后，通過離心干燥柱子，在無RNase的水中洗脫RNA，通過離心收集。該快速方案的總時(shí)間是少于8分鐘，優(yōu)選少于6分鐘。概言之，快速RNA提取方法包括以下步寐獲得組織樣品:將組織勻漿，產(chǎn)生勻漿物；使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA,該快速提取方法中涉及的試劑可以是制造商提供的那些，或可以是例如裂解/結(jié)合緩沖液(優(yōu)選4.5MGITC，lOOmMNaP04)，洗滌緩沖液I(優(yōu)選溶于5MGITC，20mMTris-HCl中的37%乙醇)，洗滌緩沖液II(優(yōu)選溶于20mMNaCl，2mMTris-HCl中的80%乙醇)，和用于洗脫的無核酸酶的無菌雙蒸水。在一種方法中，在上文描述的分離核酸的過程之前，將組織樣品稱重，放在8或14ml的聚丙烯培養(yǎng)試管中，并且在干水上預(yù)先冷卻。然后在不解凍的條件下將冷凍的組織樣品分成大約50mg或更少的片。所有緩沖液是QIAGEN在RNeasymini試劑盒中提供的那些?；诒?，將一定體積的勻漿(裂解)緩沖液加入組織。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*將多于550mg的組織分成相等的部分，加工為各個(gè)樣品。計(jì)算超過100mg的組織的裂解援沖液體積的一種替代方法是每50mg組織加入lml;對(duì)于少于100mg的組織，采用2ml。然后例如通過電源設(shè)置為6級(jí)的OmniGLH115，適配器A1000和一次性探頭對(duì)組織樣品勻漿。然后將勻漿物與等體積的70%乙醇混合，然后例如通過在設(shè)置為10速(最大)的VWRModelG560上渦旋大約10秒或通過抽吸4-5次而徹底混合'然后根據(jù)表4的體積將勻漿物/乙醇混合物加入安裝在真空集合管上的RNeasymini柱，使得加栽一致量的原始組織(大約5mg/柱)，從而對(duì)于每個(gè)組織樣品產(chǎn)生相似的RNA產(chǎn)率。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>然后給柱子施加真空，以除去液體。停止真空，進(jìn)行兩次700ml的洗滌，第一次用RWI緩沖液，笫二次用RPE緩沖液，每次都通過過濾除去。每種情況下的真空都是在8CMM200mBar。然后將柱子置于1.5ml的收集管中，在Eppendorf5415D離心機(jī)中以13,200rpm離心30秒到干燥.將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的收集管中。將50^1無RNase的水直接加入膜，在Eppendorf5415D離心機(jī)中以13,200rpm將柱子離心30秒，以洗脫RNA,用AgilentBioanalyzer確定RNA的質(zhì)量，將RNA在-70TC儲(chǔ)存。黑色素可以不利地影響逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)的效率，因此，當(dāng)懷疑樣品含有顯著量的黑色素(如在原發(fā)性黑素瘤或良性皮膚痣的樣品的情況下)時(shí)，進(jìn)行黑色素去除程序，當(dāng)在SLN上進(jìn)行分析時(shí)，不用太注意該程序，因?yàn)楹谒丶?xì)胞含量低。如果必要，除去黑色素，以便增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄和/或核酸擴(kuò)增.典型地，在上文提供的過濾步驟中除去黑色素。在具有高黑色素濃度的組織的情況下，應(yīng)該采用較少的組織，即每個(gè)QiagenRNeasymini柱大約5mg。如果采用另一個(gè)在樣品中產(chǎn)生殘留黑色素的方法，則除去步碟包括使用采用了聚合物珠系統(tǒng)，如Bio-GelP-60(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)的基質(zhì),所述方法描述于Satyamoorthyetal.(2002)?；旧?，該方法包括制備Bio-Gel材料在10mM醋酸鈉(pH4.2)中的50%(w/v)混合物.將大約300il混合物置于微量離心管中，在1000rpm離心1分鐘。棄去上清液，將珠子罝于微柱或相似的容器中。然后使勻漿物通過裝有珠子的容器(在第一次在容器中溫育它們之后)。收集上清液.用額外的10mM醋酸鈉的100pl等分物進(jìn)一步洗滌珠子，如果對(duì)于充足的分析體積是必要的，可以用于捕獲額外體積的不含黑色素的樣品.暗黑色素在保留在容器中的珠子上是明顯可見的。如Wangetal.(2001)的描述，也可以用其它基于二氣化硅的過濾器除去黑色素。本發(fā)明的手術(shù)中方法的一個(gè)重要方面是快速標(biāo)志物檢測(cè)。前提是可以在手術(shù)中分析可接受的時(shí)間段(即不超過大約35分鐘)中進(jìn)行所述方法，可以使用任何可靠、靈敏和特異的方法.在測(cè)量mRNA水平以確定基因表達(dá)的情況下，可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行分析，并且包括諸如PCR、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和其它的方法.涉及的快速分子診斷是最優(yōu)選的定量PCR方法，包括QRT-PCR?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域/^知的任何方法進(jìn)行檢測(cè)，包括微陣列、基因芯片和熒光，典型的PCR包括多個(gè)擴(kuò)增步驟，或選擇性擴(kuò)增靶核酸種類的循環(huán).典型的PCR包括三個(gè)步驟變性步驟，其中把核酸被變性；退火步驟，其中一組PCR引物(正向和反向引物)與互補(bǔ)DNA鏈退火；和延伸步驟，其中耐熱DNA聚合酶使引物延伸.通過重復(fù)該步驟多次，擴(kuò)增DNA片段，以產(chǎn)生相應(yīng)于靶DNA序列的擴(kuò)增子。典型的PCR包括20或更多個(gè)變性、退火和延伸的循環(huán).通常，可以同時(shí)進(jìn)行退火和延伸步猓，在此情況下循環(huán)僅僅包括兩個(gè)步驟。在本發(fā)明的采用RT-PCR的優(yōu)選方法中，在適于手術(shù)中診斷的時(shí)間中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，這些步驟中每一個(gè)步壤的長度可以是在秒的范圍，而不是分鐘的范圍.具體地，由于某些新的熱循環(huán)儀能夠產(chǎn)生每秒至少約5TC的熱斜率，采用30分鐘或更少時(shí)間的RT-PCR擴(kuò)增。更優(yōu)選地，在少于25分鐘的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增?？紤]到這一因素，對(duì)PCR的每一步驟提供的以下時(shí)間不包括斜率時(shí)間，變性步驟可以進(jìn)行10秒或更少的時(shí)間，實(shí)際上，一些熱循環(huán)儀設(shè)置為"o秒"，這可以是變性步驟的最優(yōu)持續(xù)時(shí)間。也就是說，它足夠熱循環(huán)儀到達(dá)變性溫度。退火和延伸步驟最優(yōu)選是均少于io秒，當(dāng)在相同溫度下進(jìn)行時(shí)，組合的退火/延伸步驟可以是少于io秒。一些同質(zhì)探針檢測(cè)方法可能需要獨(dú)立的延伸步驟，使快速分析性能最高。為了使總擴(kuò)增時(shí)間和非特異性副反應(yīng)形成最少，退火溫度典型地高于50t:。更優(yōu)選地，退火溫度高于55TC。RT-PCR需要單獨(dú)合并的反應(yīng)，而沒有試驗(yàn)干預(yù)，這是因?yàn)閹讉€(gè)原因(1)實(shí)驗(yàn)誤差的風(fēng)險(xiǎn)減少；(2)靶或產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)減少；和(3)分析速度增加。反應(yīng)可以有一種或兩種聚合醉。在兩種聚合酶的情況下，這些聚合酶中的一種典型地是基于RNA的DNA聚合物(逆轉(zhuǎn)錄酶)，并且一種是耐熱的基于DNA的DNA聚合酶。為了使分析性能最高，優(yōu)選對(duì)這些酶的功能采用"熱啟動(dòng)"形式。美國專利5,411,876和5，985，619提供了不同"熱啟動(dòng)"方法的實(shí)例。優(yōu)選方法包括采用一種或多種熱激活方法，該方法掩蔽了有效DNA聚合所需的一種或多種成分。美國專利5，550，044和5,413,924描述了制備用于所述方法的試劑的方法。美國專利6，403，341描述了掩蔽方法，涉及PCR試劑成分之一的化學(xué)改變。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA和DNA依賴性聚合酶均存在于單一酶中.有效擴(kuò)增所需的其它成分包括三磷酸核苷，二價(jià)鹽和緩沖液成分.在某些情況下，非特異性核酸和酶穩(wěn)定劑可能是有益的.在優(yōu)選的RT-PCR中，某些逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR成分的量是非典型的，以便利用某些熱循環(huán)儀的更快的斜率時(shí)間.具體地，引物濃度非常向。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的典型基因特異性引物濃度是小于約20nM。為了使快速逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)以1-2分鐘的數(shù)量級(jí)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄酶引物濃縮升高到大于20nM，優(yōu)選至少約50nM，典型約100nM。標(biāo)準(zhǔn)PCR引物濃縮是100nM-300nM?？梢詫⒏邼饪s用于標(biāo)準(zhǔn)PCR中，以補(bǔ)償Tm變化。但是，為了此處的目的，例如，提到的引物濃度是不需要Tm補(bǔ)償?shù)臐舛取？梢詰{經(jīng)驗(yàn)確定成比例更高的引物濃度，并且如果Tm補(bǔ)償是必須或需要時(shí)，采用該更高的引物濃度。為了實(shí)現(xiàn)快速PCR，PCR引物濃度典型地是大于250nM，優(yōu)選大于約300nM，32典型地約500nM.商用的診斷劑也優(yōu)選采用一種或多種內(nèi)部陽性對(duì)照，其證實(shí)了陰性結(jié)果時(shí)特定擴(kuò)增反應(yīng)的運(yùn)行，在RT-PCR中必須控制的假陰性結(jié)果包括RNA量不足、RNA的降解、RT的抑制和/或PCR和實(shí)驗(yàn)者誤差。在測(cè)量蛋白水平以確定基因表達(dá)的情況下，任何本領(lǐng)域公知的方法都是合適的，前提是它導(dǎo)致足夠的特異性和靈敏度。例如，可以通過結(jié)合于蛋白的特異性抗體或抗體片段和測(cè)量抗體結(jié)合的蛋白量而測(cè)量蛋白水平，可以用放射性、熒光或其它可檢測(cè)試劑標(biāo)記抗體，以促進(jìn)檢測(cè)，檢測(cè)方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和免疫印跡^支術(shù)。本發(fā)明提供了足以鑒定組織樣品中的惡性黑素細(xì)胞的特異性和靈敏度。該方法通過測(cè)量標(biāo)志物編碼的mRNA而確定特定標(biāo)志物基因的表達(dá)。相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，本發(fā)明優(yōu)選的標(biāo)志物在具有惡性黑素細(xì)胞的組織中表現(xiàn)出至少2倍的超量表達(dá)。這里示出的結(jié)果表明，一級(jí)標(biāo)志物不足以提供臨床上相關(guān)的信息，但當(dāng)與一種或多種二級(jí)標(biāo)志物組合時(shí)，獲得的信息可以與臨床醫(yī)生目前依賴的H&E和IHC的"金標(biāo)準(zhǔn)"相比.三級(jí)標(biāo)志物和對(duì)照基因可以增強(qiáng)一級(jí)和二級(jí)標(biāo)志物，以進(jìn)一步增加特異性和/或靈敏度。如以下實(shí)施例所述，通過圖1描述的方案鑒定了標(biāo)志物。因此，本發(fā)明提供了通過圖1的方法和此處提供的實(shí)施例鑒定黑素瘤特異性標(biāo)志物的方法，一級(jí)標(biāo)志物可以是PLAB，并且在此處定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:1.PLAB也由Paralkaretal.(D98)描述，并且由編號(hào)AF003934表示。PLAB與前列腺癌(Liuetal(2003);Karanetal.(2003);和Nakamuraetal.(2003);美國專利Nos.5,994,102;6,107,476;6，465，181;6，500，638;6,521,227;美國專利公開Nos.2002/0048784;2003/0013097;和2003/0059431)和結(jié)直腸癌(Brownetal.(2003);Buckhaultsetal.(2001);和美國專利公開No.2002/0160382)的發(fā)病相關(guān)。二級(jí)標(biāo)志物可以是LICAM，并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:2,LICAM也由Haspeletal(2003)和美國專利Nos.5,872,225和5,969,124描述,并且由由編號(hào)NM一000425表示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了屬于一些功能分類的三級(jí)標(biāo)志物。因此，可以采用這些功能分類中的額外標(biāo)志物。如實(shí)施例中更詳細(xì)的描述，黑素瘤特異性的受到上調(diào)的基因?qū)儆谏窠?jīng)組織發(fā)育和細(xì)胞周期控制的功能分類，黑素瘤特異性的受到下調(diào)的基因?qū)儆诮M織發(fā)育和細(xì)胞分化的功能分類，三級(jí)標(biāo)志物包括SEQIDNOs:3、29-978和999。多種三級(jí)標(biāo)志物描述于表5，并且所有三級(jí)標(biāo)志物概括于表15。NTRK3描述于Strausbergetal.(2002);Marchettietal.(2003);Hisaokaetal.(2002);McGregoretal.(1999);Rydenetal.(1996);美國專利Nos.5，348，856;5,844,092;5，910，574;以及美國專利公開Nos.2002/0155480和2003/014283，并且由編號(hào)BC013693或S76476.1表示。NTRK3也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:16-18識(shí)別的mRNA的基因。酪氨酸酶描述于Mandelcom-Monsonetal.(2003)和美國專利No.6，153，388，并且由編號(hào)NM_000372表示.輅氨酸酶也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:19-21識(shí)別的mRNA的基因.<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>MAP2K2Chenetal.(2004)NM030662MAP2K4Wooetal.(2004)NM003010MAP3K11ZhangeUl.(2004a)NM002419MAPK8Fujiietal.(2004)NM—13卯49MYLKOuryetal.(2004)NM053032NRASReifenbergeretal.(2004)NM002524PAK1Sellsetal,(l卯7)HSU24I52PAK2Kirchhoffeta1.(2004)NM002577PAK3Kitanoetal.(2003)NM002578PAK4-Baracetal.(2004)NM005884PAK6Chingeta.(2003)NM020168PAK7Jaffereta1.(2002)1NM020341PTK2Golubovskayaetal.(2004)NM005607PXNSaitoetal.(2004)NM002859RAC1Pontowetal.(2004)NM198829RAF1Akulaetal.(2004)NM002880RAP1ANomuraetal.(2004)雨002884RAP2BEvellinetal.(2002)NM002886SHCIY咖onietal.(2004)NM183001S0S1Buchsetal.(2004)NM005633SRCEncinasetal.(2004)NM198291TLN1Tr咖uthetal.(2004)NM006289VASPTokuoetal,(2004)NM003370VCLIzardetal.(2004)NM003373WASPIPLuthietal.(2003)NM003387ZYXIietal.(2004)NM003461三級(jí)標(biāo)志物能夠替代和/或補(bǔ)充一級(jí)或二級(jí)標(biāo)志物，前提是得到的分析具有足夠的靈敏度和特異性。任何給定的基于擴(kuò)增的分子診斷的靈敏度很大程度，但不是完全依賴于引物組的身份.引物組是成對(duì)的正向和反向寡核苷酸引物，它們退火于靶DNA序列，以便允許靶序列的擴(kuò)增，從而產(chǎn)生靶序列特異性擴(kuò)增子。引物必須能夠擴(kuò)增目的疾病狀態(tài)的標(biāo)志物。在本發(fā)明的情況下，這些標(biāo)志物針對(duì)黑素瘤，反應(yīng)也必須包括檢測(cè)特異性信號(hào)的一些工具，這優(yōu)選是通過采用檢測(cè)來源于目的靶序列的聚合的DNA序列區(qū)域的試劑而實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選的檢測(cè)試劑在與特異性的目的核酸序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)差異.通常，這些方法包括在與目的序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生增加的熒光的核酸探針。典型地，通過分析每個(gè)PCR引物組的擴(kuò)增子產(chǎn)生的相對(duì)速率而監(jiān)測(cè)本發(fā)明方法的反應(yīng)進(jìn)程。37本發(fā)明進(jìn)一步包括引物/探針組及其在要求保護(hù)的方法中的用途，這些序列是4(PLAB正向引物)ggcagaatc"cgtccgca5(PLAB反向引物)ggacagtggtccccgttg6(PLAB探針)cccagctggagttgcacttgcggcc7(PLAB上引物)gaacaccgacctcgtccc8(PLAB下引物)ggcggcccgagagata9(PLAB探針)cgccagaagtgcggctgggattt10(L1CAM正向)gctgggactgggaacagaact11(L1CAM反向)ggagcagagatggcaaagaaa12(LICAM探針)ttccccaccatctgctgt13(LICAM上)ccacagatgacatcagcctcaa14(L1CAM下)ggtcacacccagctcttcctt15(L1CAM探針)tggcaagcccgaagtgcagttcctt16(NTRK3引物)gccccggcacccttta17(NTRK3引物)aaccctgccagtggtggat18(NTRK3探針)cagatgggtgttttc19(Tyr上)actcagcccagcatcattcttc20(Tyr下)atggctgttgtactcctccaatc21(Tyr探針)cttctcctcttggcagattgtctgtagctt22(PBGD上)ccacacacagcctactttccaa23(PBGD下)tacccacgcgaatcactctca24(PBGD探針)aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt可以通過多種檢測(cè)試劑和方法實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增子產(chǎn)生的監(jiān)測(cè)，包括但不限于，熒光引物和熒光探針，以及結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料。也可以采用分子信標(biāo)、Scorpions和其它檢測(cè)方案.監(jiān)測(cè)PCR的常規(guī)方法采用熒光水解探針分析。該方法利用某些耐熱DNA聚合酶(如Taq或TflDNA聚合酶)的5，核酸酶活性，在PCR過程中裂解寡聚探針'本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過本發(fā)明方法利用的PCR方法獲得的擴(kuò)增子.這些擴(kuò)增子包括以下序列SEQIDNO:25(PLAB擴(kuò)增子)SE(JIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOcggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgccSEQIDNO:26(L1CAM擴(kuò)增子)gggatggtgtccacttcaaacccaaggaagagctgggtgtgaccSEQIDNO:27(輅氨酸酶擴(kuò)增子)atSEQIDNO:28(PBGD擴(kuò)增子)ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaaaacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta。選擇寡聚物，在延伸條件下與擴(kuò)增的靶序列退火.探針典型地在其5'末端具有熒光報(bào)道分子，在3，末端具有報(bào)道分子的熒光猝滅劑。只要寡聚物是完整的，來自報(bào)道分子的熒光信號(hào)被猝滅，但是，當(dāng)在延伸過程中消化寡聚物時(shí)，熒光報(bào)道分子不再臨近于猝滅劑.給定擴(kuò)增子的游離熒光報(bào)道分子的相對(duì)聚集可以與對(duì)照樣品的相同擴(kuò)增子的聚集和/或?qū)φ栈蚶纾幌抻赑-肌動(dòng)蛋白或PBGD的聚集相比較，以確定RNA群體中給定RNA的給定cDNA產(chǎn)物的相對(duì)豐度。焚光水解探針分析的產(chǎn)物和試劑容易商購，例如，購自AppliedBiosystems。合適的檢測(cè)試劑通常稱作"Scorpions"，并且描述于美國專利6,326,145和5，525，494。這些試劑包括一種或多種包含具尾的引物和整合的信號(hào)傳遞系統(tǒng)的分子.引物具有模板結(jié)合區(qū)和包含接頭和靶結(jié)合區(qū)的尾。尾中的靶結(jié)合區(qū)與引物的延伸產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交。這種靶特異性雜交亊件與信號(hào)系統(tǒng)連接，其中雜交導(dǎo)致可檢測(cè)的改變。在PCR中，靶結(jié)合區(qū)和尾區(qū)有利地安排，使得尾區(qū)保持單鏈，即，未復(fù)制.因此，尾區(qū)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是不可擴(kuò)增的.接頭包含阻斷部分，其防止引物模板上的聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸。最優(yōu)選的檢測(cè)試劑是TaqMan⑧探針(RocheDiagnostics,Branchburg，NJ)，它們描述于美國專利5,210,015;5,487,972和5，804，375?；旧?，這些探針包括通過分離探針上的熒光-猝滅劑組合而進(jìn)行核酸檢測(cè)，所述分離是通過用于PCR中的聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。任何合適的熒光團(tuán)都可以用于任何標(biāo)志物或?qū)φ?。?9述焚光團(tuán)包括，但不限于，TexasRed、CalRed、Fam、Cy3和Cy5.在一種實(shí)施方案中，以下熒光團(tuán)對(duì)應(yīng)于指出的標(biāo)志物PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶CI;PBGD:Cy5.容易獲得用于在PCR和QRT-PCR中控制和監(jiān)測(cè)擴(kuò)增子聚集的設(shè)備和軟件，包括購自CepheidofSunnyvale,California的SmartCycler熱循環(huán)儀和購自AppliedBiosystems的ABIPrism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)，在基因表達(dá)分析的情況下，優(yōu)選采用在目的組織中組成型表達(dá)的基因。由于以下幾種原因，通常將PBGD用作內(nèi)部對(duì)照它不含人類的已知假基因，它在人組織中組成型表達(dá)，并且它以相對(duì)低水平表達(dá)，因此較不容易導(dǎo)致目的靶序列擴(kuò)增的抑制。采用PBGD作為對(duì)照，使假陰性結(jié)果的所有可能來源產(chǎn)生的報(bào)道誤差最少或消除誤差。在上述QRT-PCR的方法的商品化中，某些用于檢測(cè)特定核酸的試劑盒特別有用。在一種實(shí)施方案中，試劑盒包括擴(kuò)增和檢測(cè)標(biāo)志物的試劑。任選地，試劑盒包括樣品制備試劑和/或物品(如試管)，以從淋巴結(jié)組織提取核酸。該試劑盒也可以包括使樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)最小的物品(如用于淋巴結(jié)切開和制備的一次解剖刀和表面)。在優(yōu)選的試劑盒中，包括了上述單管QRT-PCR方法的必要試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、相應(yīng)的PCR引物組(優(yōu)選針對(duì)標(biāo)志物和對(duì)照)、耐熱DNA聚合酶，如Taq聚合酶，和合適的檢測(cè)試劑，例如，但不限于scorpion探針、用于熒光水解探針分析的探針、分子信標(biāo)探針、雙鏈DNA的特異性單染料引物或熒光染料，如溴化乙錠。引物的量優(yōu)選產(chǎn)生上述高濃度。耐熱DNA聚合酶通常和商業(yè)上獲自多個(gè)制造商。試劑盒中的額外材料可以包括合適的反應(yīng)試管或管形瓶、屏障組分，典型地是蠟珠，任選包括鎂；逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物(典型是10x)，包括必要的緩沖液和試劑，如dNTPs;不含核酸酶或不含RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對(duì)照核酸、任何額外的緩沖液、化合物、輔因子、離子組分、蛋白和酶、聚合物等，它們可以用于QRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或PCR階段。任選地，試刑盒包括核酸提取試劑和材料。試劑盒中也優(yōu)選包括說明書。提供了以下實(shí)施例來說明，但不是限制要求保護(hù)的發(fā)明，在此全文引入提到的所有參考文獻(xiàn)作為參考。實(shí)施例1組織制備從GenomicsCollaborative,Inc.(Cambridge,MA)，Asterand(Detroit,MI)，Clinomics(Pittsfield，MA)和Proteogenex(LosAngeles,CA)，Ardais(Lexington,MA)以及Impath(Westborough，MA)獲得新鮮冷凍的惡性黑素瘤、良性皮膚痣、正常皮膚、黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移物和無黑素瘤的淋巴結(jié)樣品，所有組織的出售者宣稱用于研究中的組織標(biāo)本是根據(jù)nstitutionalReviewBoard批準(zhǔn)的相應(yīng)醫(yī)院的方案和生物倫理學(xué)原則而采集的。也收集了患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和病理學(xué)信息。評(píng)定了每個(gè)樣品的組織病理學(xué)特征，以證實(shí)診斷，并且估計(jì)樣品保存和腫瘤含量。選擇用于微陣列分析的黑素瘤和良性痣原代組織的黑素細(xì)胞含量超過50%,沒有混合的組織學(xué).從惡性黑素瘤患者采集黑素瘤陽性淋巴結(jié)；通過H&E和IHC(S100和HMB45)的組合證實(shí)黑素瘤的診斷，采用S100和HMB45的抗體，通過H&E和IHC證實(shí)了來自于臨床病史沒有黑素瘤，并且目前沒有黑素瘤的患者的不含黑素瘤的淋巴結(jié)。將來自總共70個(gè)原代組織樣品的RNA用于基因表達(dá)謙分析和黑素瘤特異性基因鑒定.樣品包括45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織.研究中包括的大多數(shù)原發(fā)性黑素瘤代表疾病的早期階段，厚度小于4mm,這與標(biāo)準(zhǔn)黑素瘤患者群體一致。Aitkenetal.(2004)。表6中示出了患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和病理學(xué)特征，并且概括于表7。此外，將T7個(gè)惡性黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和18個(gè)無黑素瘤的LN組織樣品用于一步定量PCR分析。黑素瘤陽性淋巴結(jié)包括腋窩淋巴結(jié)、頸淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)，其中的轉(zhuǎn)移灶是來自上皮樣和紡錘狀細(xì)胞原發(fā)性黑素瘤。在18個(gè)無黑素瘤的LN中，10個(gè)是從其它癌癥患者采集的，但病理學(xué)家沒有從這些淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，并且8個(gè)LN來自非惡性病變。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例2從惡性黑素瘤和良性皮膚痣樣品分離RNA采用QiagenRNeasyTMMini試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)，用改進(jìn)的方案使RNA樣品中的殘留黑色素最少，對(duì)于含有黑素細(xì)胞的組織，釆用了來自各個(gè)患者的四份重復(fù)的組織樣品，其重量是大約5mg，分開使用和處理各個(gè)樣品，用機(jī)械勻漿器(UltraTurrexT8，IKA-Werke，Staufen，Germany)在含有100-巰基乙醇(SigmaChemicalCo"St.Louis,MO)的1.0mlRLT緩沖液(QIAGEN)中對(duì)組織樣品進(jìn)行勻漿。勻漿后，將樣品加入QIAGENRneasyTM柱，然后離心.棄去流通液后，加入700mlRW1緩沖液；使柱子在室溫下保持5分鐘，然后離心.將該步稞重復(fù)3次。然后采用標(biāo)準(zhǔn)QIAGENRneasyTM方案。為了從硅膠膜上除去RNA，進(jìn)行兩步洗脫.合并來自相同個(gè)體患者組織的總RNA，用于進(jìn)一步分析，將標(biāo)準(zhǔn)Trizol程序用于從不含顯著比例的黑素細(xì)胞的組織分離RNA。在Trizol試劑(lnvitrogen，Carlsbad,CA)中對(duì)組織進(jìn)行勻漿。離心后，收集最上層的液相，在-20TC下用異丙醇沉淀總RNA。用75。/o的乙醇洗滌RNA沉淀，溶解在水中，在-801C下儲(chǔ)存直到使用，用Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano分析(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)檢驗(yàn)RNA量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制造商的程序制備標(biāo)記的cRNA，與高密度寡核苷酸陣列Hul33A基因芯片(Affymetrix，SantaClara,CA)雜交，所述陣列總共含有22,000個(gè)探針組。用Affymetrix程序和掃描儀掃描陣列。對(duì)于隨后的分析，認(rèn)為每個(gè)探針都是分離的基因。采用Affymetrix基因芯片分析軟件MAS5.0計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)值。所有芯片滿足三個(gè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)"存在"信號(hào)高于35%，，當(dāng)標(biāo)度為600的靶強(qiáng)度時(shí)，尺度因子小于12，背景水平小于150。選擇低于"存在"信號(hào)截止值的通常百分比，因?yàn)楹茈y從皮膚細(xì)胞分離RNA(Hipfeletal,(1998))，使得總體基因表達(dá)水平較低.實(shí)施例3數(shù)據(jù)分析過濾基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以便在2個(gè)或更多樣品中僅僅包括稱作"存在"的基因.該過濾器被用于除去在樣品中的表達(dá)不改變的基因。在陣列上存在的22，000種基因中，15/795種通過該過濾器，并且用于等級(jí)簇集。在簇集之前，用每個(gè)基因表達(dá)信號(hào)除以數(shù)據(jù)組中所有樣品中的中值表達(dá)。該標(biāo)準(zhǔn)化步猓使基因表達(dá)強(qiáng)度的效果最小，并且將簇集分析中具有相似表達(dá)模式的基因分組在一起。采用GeneSpring6.1，在基因和樣品上都進(jìn)行了采用Pearson關(guān)聯(lián)的平均連鎖等級(jí)簇集。為了鑒定差異表達(dá)的基因，我們分別比較了黑素瘤樣品與良性痣和正常皮膚樣品。第一次分析由45個(gè)黑素瘤和7個(gè)正常皮膚樣品組成；第二次分析由45個(gè)黑素瘤和18個(gè)痣樣品組成。在圖1所示的以下程序中分別分析了這兩個(gè)數(shù)據(jù)組，在基因選擇中采用微陣列的顯著性分析(SAM;Tusheretal.(2001))和斯氏T檢驗(yàn).SAM的參數(shù)設(shè)置為厶=2.5，倍數(shù)改變=2.0，具有1，000次交換.FDR是1%。沒有遺漏的數(shù)據(jù)，采用了缺省隨機(jī)數(shù)。進(jìn)行了隨后的百分比分析。對(duì)于受到上調(diào)的基因，將黑素瘤樣品中的30%與正常樣品或痣樣品的最大值進(jìn)行比較.也進(jìn)行了具有Bonferroni校正的斯氏T檢驗(yàn)，其截止p<0.05，以確保選定的基因在兩組樣品之間具有顯著的差異表達(dá)。作為最終步驟，我們鑒定了黑素瘤/良性和黑素瘤/正?；蛄斜碇g共同的基因，得到圖1所示的在黑素瘤中受到上調(diào)的基因的單一列表，其中439種共同基因相應(yīng)于表15中描述的SEQIDNOs:2S>-467，其結(jié)果示于表8.表8PSID黑素瘤中的中值表達(dá)改變倍數(shù)(癌與良性)改變倍數(shù)(癌與皮膚)200078sat395423200601at92542了200612sat23962200644at72406200660at1465934200707at3153251200736sat73053200737at24232200783sat102822200825sat37463200827at159322200837at581725200838at19225817200839aat283537200859xat9637200910at778024200950at84197200954at31322200966xat2738823200967at615424200968sat55872746<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>220864sat841633220948sat1179423220973sat49743220974xat2S4022220980sat359832221059sat2438.53221483sat簡33221484at383433221538sat39713221558sat23563221577jcat48972838221641sat119924221688sat374024221710xat72822221732at931221759at1261421221797at43027221799at16013221815at329317144221882satH4456221902at249144221卯9at2432217221962sat113226222116sat420824222153at44538222155sat1264310222175sat2415'36222196at22436222J99sat215223222206sat383412222212sat371534222231sat272432222234sat754412222240sat133133222294sat2193.3532811at41942340560at162944783sat850314646665at7835455093at30324453825at10096147487100at737670我們選擇了與良性標(biāo)本相比，在黑素瘤中具有至少10倍過量表達(dá)的一'卜部分基因.完整的陣列數(shù)據(jù)組提交于NCBI/GenbankGEO數(shù)據(jù)庫(系列條目未決)。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)了四個(gè)不同的簇(圖2)。兩個(gè)簇由大多數(shù)黑素瘤樣55品(45個(gè)中的43個(gè))組成；第三個(gè)簇包括大多數(shù)良性痣樣品(18個(gè)中的15個(gè))，笫四個(gè)包括所有7個(gè)正常皮膚標(biāo)本.黑素瘤樣品自身形成兩個(gè)簇，笫一個(gè)簇中有35個(gè)樣品，另一個(gè)簇中有IO個(gè)樣品.形成小簇的樣品僅僅代表上皮樣黑素瘤，可觀察到含有較少的黑色素，并且證明具有更高的FRAME和MIA基因表達(dá)(p<0.05),極少數(shù)的HI和IV期腫瘤都分組到了小簇中。大簇表現(xiàn)出NTRK3和巢蛋白(NES)的較高表達(dá)(p<0.05).所有黑素瘤和良性痣樣品都表現(xiàn)出已知黑素細(xì)胞標(biāo)志物如酪氨酸酶和MART-1的相同高的表達(dá)，證明在這些樣品中存在相似的黑素細(xì)胞含量.我們的數(shù)據(jù)表明，黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品具有不同的基因表達(dá)詳，并且可以在分子量基礎(chǔ)上分離.在黑素瘤中高表達(dá)的選定基因及其相關(guān)的功能分類概括于表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例4筌定在黑素瘤中差異表達(dá)的基因?qū)⒖偣?0個(gè)基因表達(dá)謙用于分析。黑素瘤、良性和正常樣品組的"存在信號(hào)"的中值百分比分別是43.8%、46.9%和41.7%,60個(gè)微陣列(86%)具有最小值3倍范圍內(nèi)的尺度因子。具有超過3的尺度因子的10個(gè)芯片相等分布在樣品類目，即黑素瘤、良性和正常之間.非監(jiān)督的等級(jí)簇集結(jié)果揭示了黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品的不同分離(圖2).我們觀察了4個(gè)簇，包括兩個(gè)主要由黑素瘤樣品(45個(gè)中的43個(gè))組成的簇，含有所有7個(gè)正常皮膚、3個(gè)良性痣和2個(gè)黑素瘤標(biāo)本的第三個(gè)簇，和包括18個(gè)良性痣樣品中的14個(gè)樣品的第四個(gè)簇。樣品的來源不影響簇集。根據(jù)樣品類型(黑素瘤、良性或正常)將來自不同來源的標(biāo)本簇集在一起。為了進(jìn)一步測(cè)試簇集模式的穩(wěn)定性，我們?cè)诖胤治鲋霸诨蜻^濾上采用替代的截止值。具體地，我們保留了在黑素瘤、良性痣和皮膚樣品的每一個(gè)樣品中具有至少10%"存在"信號(hào)的基因。采用該截止值，我們獲得了15,306種基因，并且重復(fù)了等級(jí)簇集?；颊邩悠飞系拇啬Ｊ脚c來自2個(gè)"存在"信號(hào)的15，795種基因的模式相同，證實(shí)了簇集穩(wěn)定性，與黑素瘤樣品簇集在一起的單個(gè)痣樣品是不存在原位黑素瘤的不典型痣(中度)。與正常皮膚簇集在一起的所有三種痣樣品是混合痣樣品，其中之一的黑素細(xì)胞含量低于其它痣樣品。黑素瘤樣品自身形成了兩個(gè)簇，大簇中具有34個(gè)樣品，小簇中具9個(gè)樣品.形成小簇的樣品僅僅代表上皮樣黑素瘤，并且可以觀察到含有較少的黑色素。我們的研究中用到的很少數(shù)的ni和iv期肺瘤，都分組在小簇中。大簇包括混合組織學(xué)標(biāo)本的上皮樣、紡錘狀細(xì)胞和黑素瘤，具有更顯著的黑色素存在.大簇僅僅包含i期和n期標(biāo)本。發(fā)現(xiàn)不同的基因簇與黑素瘤相關(guān)。這可以通過黑素瘤樣品中上調(diào)(圖2，A，B,C)和下調(diào)的(圖2，E)基因表征。同時(shí)，黑素瘤和良性痣樣品表現(xiàn)了已知黑素細(xì)胞標(biāo)志物如MART-1的高表達(dá)(圖3，D)，證實(shí)了這些樣品中黑素細(xì)胞的類似含量，以及黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物不能區(qū)分它們.我們的數(shù)據(jù)表明，黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品具有不同的基因表達(dá)詳，并且可以基于它們的分子進(jìn)行分離。為了鑒定在惡性黑素瘤中受到上調(diào)的基因，我們采用了SAM與具有Bonferroni校正的t檢驗(yàn)和百分比分析的組合(圖1)。用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)和百分比分析分別解決多個(gè)檢驗(yàn)問題和腫瘤樣品的異質(zhì)性。作為這些分析的結(jié)果，選擇了439種基因，在表15中概括為SEQIDNOs:29-467。在黑素瘤中受到上調(diào)的439種基因中，我們選擇了少數(shù)的33種基因，其在黑素瘤樣品中比在良性樣品種具有10倍的超量表達(dá)。這些包括很多與惡性黑素瘤具有已知關(guān)聯(lián)的基因，如NTRK3(Xuetal.(2003))，L1CAM(Fogdetal.(2003);和Thiesetal.(2002))，me20m(Ademaetal.(1994)，以及新基因表10種列出了在黑素瘤中具有超過10倍的超量表達(dá)的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>樣品，所述樣品是從相同組織分離的，用于微陣列研究.將每種基因的表達(dá)值歸一化到管家對(duì)照基因PBGD.L1CAM、NTRK3、PLAB和gplOO的RT-PCR和微陣列結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.86、0.87和0.88。該結(jié)果表明，RT-PCR結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)高度一致。實(shí)施例5差異表達(dá)的基因的途徑分析用IngemiityTM途徑分析軟件(Ingenuity,MountainView,CA)進(jìn)行黑素瘤中差異表達(dá)的基因的功能分析.選擇了具有小于0.05的p-值的功能類目或規(guī)范途徑.用隨機(jī)選擇的基因測(cè)試規(guī)范途徑鑒定的特異性。為了進(jìn)一步觀察區(qū)分黑素瘤與良性和正常組織的可能機(jī)制，我們用Ingenuity途徑分析軟件鑒定與黑素瘤相關(guān)的規(guī)范途徑。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白加工中的很多基因在黑素瘤樣品中受到上調(diào)，為了證實(shí)我們的觀察結(jié)果的特異性，我們從AffymetrixHul33A微陣列選擇了3個(gè)隨機(jī)的基因列表，對(duì)它們進(jìn)行Ingenuity途徑分析。這些列表都沒有產(chǎn)生與淀粉樣蛋白加工或任何其它規(guī)范途徑的顯著關(guān)聯(lián)。為了證實(shí)黑素瘤中這一規(guī)范途徑的激活，檢索了途徑中所有基因的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。計(jì)算了黑素瘤和良性/正常組織之間差異表達(dá)的改變倍數(shù)和p-值。在淀粉樣蛋白加工途徑中包括的34種基因中(Esleretal.U001);和Giancottietal.(1999))，25種表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，對(duì)于其中的19個(gè)(56%)，差異表達(dá)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p-值〈0.05;圖4)。作為額外的對(duì)照，我們隨機(jī)選擇了具有相似基因數(shù)目的兩個(gè)代謝途徑。在丙氨酸合成途徑的63種基因中，其中的8個(gè)(13%)表現(xiàn)出顯著上調(diào)，其p-值小于0.05。在組氨酸合成途徑中的47種基因中，用相同標(biāo)準(zhǔn)僅僅發(fā)現(xiàn)了2種基因(4%).我們的數(shù)據(jù)第一次強(qiáng)烈表明淀粉樣蛋白加工途徑的激活參與惡性黑素瘤。實(shí)施例6微陣列結(jié)果的RT-PCR證實(shí)根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen，Carlsbad,CA)，用DNA酶I處理10微克來自每個(gè)樣品的總RNA，并且采用SuperscriptH逆轉(zhuǎn)錄病毒，用寡聚(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.以前測(cè)試了對(duì)照基因PBGD，并且報(bào)道為管家基因，Vandesompeleetal.(2003),用PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)設(shè)計(jì)me20m(gpl00)、LICAM、NTRK3和對(duì)照基因PBGD的引物和MGB-探針。PLAB(MIC1)基因探針是基于FAM-TAMRA的，引物序列不足以設(shè)計(jì)基于MGB的探針。引物/探針序列如下所示表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>PBGD正向CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA986PBGD反向CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA987PBGD探針(6-FAM)CCTGAGGCACCTGGAAGOAGGCTGCAOTOT(TAMRA)988為了達(dá)到高于90%的最佳擴(kuò)增效率，檢驗(yàn)了所有引物和探針，標(biāo)準(zhǔn)曲線包括靶基因PCR產(chǎn)物的6個(gè)10倍稀釋，拷貝數(shù)是10-106.在含有50ng模板cDNA、2xTaqManuniversalPCR主混合物(12.5pi)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)、500nM正向和反向引物和250nM探針的20Ml反應(yīng)混合物中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在ABIPRISM7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)條件是50TC下2分鐘的AmpEraseUNG激活，951C下10分鐘的聚合酶激活和50個(gè)循環(huán)的95TC下15秒和退火溫度(60"C)下60秒.在每次分析中，對(duì)于目的基因和對(duì)照基因，包括了標(biāo)準(zhǔn)曲線和非模板對(duì)照以及雙份的模板cDNA。每個(gè)靶基因的相對(duì)量表示為ACt，其等于靶基因的Ct減去對(duì)照基因的Ct.為了證實(shí)通過微陣列分析鑒定的黑素瘤特異性基因，選擇了四種基因(L1CAM，NTRK3，PLAB和gp100)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證(圖4).將每種基因的表達(dá)值歸一化到管家基因?qū)φ誔BGD。L1CAM、NTRK3、PLAB和gp100的RT-PCR和微陣列結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.86、0.87和0,88,表明RT-PCR結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)高度一致.實(shí)施例7采用RNA特異性引物進(jìn)行的一步qRTPCR分析和截止值建立采用來自原發(fā)性黑素瘤、良性痣、正常皮膚、黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶和無黑素瘤的淋巴結(jié)的RNA，用一步RT-PCR進(jìn)行選定基因的表達(dá)評(píng)估。P-肌動(dòng)蛋白用作管家基因，控制反應(yīng)中RNA的輸入量和質(zhì)量。不采用DNA酶處理。相反，設(shè)計(jì)引物或探針，使它們跨內(nèi)含子，以便不在基因組DNA上報(bào)道.將8ng總RNA用于RT-PCR。用包含在TaqManOneStepPCRMasterMixReagents試劑盒(Applied62Biosystems,FosterCity,CA)中的40XMultiscribe和RNA酶抑制劑混合物逆轉(zhuǎn)錄總RNA.然后用不含UNG的2x主混合物處理cDNA，用10pl的反應(yīng)體積，以384孔區(qū)塊形式在ABI7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)上進(jìn)行RNA擴(kuò)增。引物和探針濃度分別是4iliM和2.5f^M.將反應(yīng)混合物在481C下溫育30分鐘，以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行AmpUtaq激活步驟，該步驟包括95TC下IO分鐘，最后40個(gè)周期的95TC下15秒變性和60t:下1分鐘退火和延伸.在每個(gè)板上建立從8pg到80ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2值大于0.99時(shí)，接受循環(huán)閣值(Ct)。用于反應(yīng)中的序列如下，每個(gè)序列都是從5，到3，方向記栽的。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>PLAB反向COCAGGTGCAGGTGGC歸PLAB探針GATACTCACGCCAGAAGTGCGGCT1011對(duì)于每個(gè)樣品，計(jì)算了ACt-Ct(靶基因)-Ctp-肌動(dòng)蛋白。厶Ct被廣泛用于臨床RT-PCR測(cè)定，并且選作直接方法，Croninetal.(2004)。在黑素瘤和非黑素瘤樣品，包括原發(fā)和LN樣品之間的ACt上進(jìn)行T檢驗(yàn).我們?nèi)缓笥肁Ct構(gòu)建每個(gè)患者的兩個(gè)評(píng)分。一個(gè)評(píng)分來自兩種黑素瘤特異性基因PLAB和LICAM的組合；另一評(píng)分來自3種常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物，即酪氨酸酶、gpl00和MARTI的組合。評(píng)分定義為測(cè)試的基因的ACt值的加權(quán)和，相應(yīng)的t統(tǒng)計(jì)值作為權(quán)重。對(duì)兩個(gè)評(píng)分進(jìn)行歸一化以具有相同的平均值，以便以相同的尺度對(duì)它們進(jìn)行比較。我們通過RT-PCR檢驗(yàn)了多種臨床組織樣品中的兩種在黑素瘤中高度超量表達(dá)基因，即，PLAB和L1CAM，所述組織樣品包括惡性黑素瘤細(xì)胞(原發(fā)性黑素瘤和黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶)、良性黑素細(xì)胞(良性皮趺痣)和正常樣品(正常皮膚和無黑素瘤的LN)。主要組織與用于微陣列研究的組織相同，只是所有的LN標(biāo)本都來自于獨(dú)立的患者。也在相同樣品上檢測(cè)了常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物，如酪氨酸酶、gpl00和MARTI作為對(duì)照，因?yàn)樗鼈兪悄壳暗呐R床研究中最常用于黑素瘤分子分析的標(biāo)志物。Rimboldietal.(2003);Abrahamsenetal.(2005);和Kammulaetal.(2004)。PLAB和LICAM的計(jì)算的評(píng)分示于圖4A，酪氨酸酶、gpl00和MARTI的計(jì)算的評(píng)分示于圖4B結(jié)果證明了惡性黑素瘤樣品(原發(fā)性和LN轉(zhuǎn)移灶)和良性痣以及正常LN之間PLAB和LICAM的表達(dá)的顯著差異。相反，三種常規(guī)標(biāo)志物表現(xiàn)出良性和惡性樣品中的相似表達(dá)水平。為了進(jìn)一步證明基因標(biāo)志物區(qū)分良性和惡性組織的能力，我們檢驗(yàn)了兩個(gè)截止值；笫一個(gè)確立為原代正常樣品中的最高值，第二個(gè)為良性痣樣品中的最高得分。對(duì)于每一個(gè)截止值，我們?cè)u(píng)估了LN樣品中靈敏度。采用在正常樣品上確定的截止值，新的標(biāo)志物和常規(guī)標(biāo)志物分別產(chǎn)生卯％和83%的靈敏度，采用在良性樣品上確定的截止值，新的和常規(guī)標(biāo)志物的靈敏度是88%和42%。結(jié)果表明，新的標(biāo)志物可能具有更好的區(qū)分含有良性和惡性黑素細(xì)胞的組織的能力.實(shí)施例8多路分析材料和方法每個(gè)反應(yīng)的終體積是25pl，含有以下成分:正向引物400nM反向引物500nMPLAB探針50nM酪氨酸醉探針300nML1CAM探針200nMPBGD探針200nMTth5UAbTP6-251貼甘油10%Tns-HCl，*T—、ifj.,mmN汰C14mMEDTA0.004mMTween-200.22%NP-400.02%DTT0.04mM氫氣化鉀20.5mMN-二羥乙基甘氨酸50mM醋酸鐘115mM牛白蛋白海條糖0.15MdNTP各0.2mMMgCl20.5mMMnS043.5mM引物各300nM探針各200nM引物和探針序列示于表13。表13SEQIDNO序列5'-3'功能43_gaacaccgacctcgtcccPLAB上引物44gpcggcccgagagataPLAB下引物45Fani"Cgccagaagtgcggctgggat-BHQI-ttPLAB探針55actcagcccagcatcattcttcTyr上引物56atggctgttgtactcctccaatcTyr下引物57Q570-cttctcctcttggcagattgtctgtagcBHQ2-ttTyr探針49ccacagatgacatcagcctcaaLICAM上引物50ggtcacacccagctcttccttLICAM下引物51CalRed-tggcaagcccgaagtgcagttcc-BHQ2-ttLICAM探針58ccacacdcagcctacfttccaaPBGD上引物59tacccacgcgaatcactctcaPBGD下引物60Q670-aacggcaatgcggctgcaacggcggaa-BHQ2-ttPBGD探針用PLAB在Fam通道中，酪氨酸酶在Cy3通道中，L1CAM在TexasRed通道中，和PBGD在Cy5通道中進(jìn)行反應(yīng)。采用的循環(huán)方案如下所述，并且用30分鐘完成。951Cx15秒65TCx420秒40個(gè)以下循環(huán)95X:5秒621C15秒-熒光讀數(shù)采用的閾值在Fam通道中是30，在Cy3通道中是20，在TexasRed通道中是20，在Cy5通道中是20。在Cy3和Texasred通道中采用的閾值可以降低。獲得的結(jié)果概括于表H。表14最佳標(biāo)志物組合標(biāo)志物%靈敏度(95%CI)%特異性(95%CI)L1CAM+PLAB82(73'89)96(87-100)酷氨酸酶+ME20M(GP100)63(52-72)100(94-100)LICAM+PLAB+璐氨酸酶87(79-93)96(87-100)Ct截止值L1CAM2766PLAB29駱氨酸酶23ME20M(GP100)23.5注這些數(shù)據(jù)僅僅是對(duì)H&E病理的基準(zhǔn).4個(gè)反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增效率都很高，反應(yīng)在5個(gè)對(duì)數(shù)范圍內(nèi)也是線性的(通過R2值判斷，其在所有病例中都>0.99)。因此，這些數(shù)據(jù)證明了起作用的4路、快速測(cè)定.這些數(shù)據(jù)表明，PLAB是一級(jí)標(biāo)志物，并且由LACAM實(shí)現(xiàn)的補(bǔ)充進(jìn)一步增加了靈敏度.如果需要，加入酪氨酸酶作為第三標(biāo)志物，進(jìn)一步補(bǔ)充了L1CAM和PLAB，并且增加了靈敏度。如果需要，實(shí)驗(yàn)中可以去掉酪氨酸酶，而不影響其余標(biāo)志物的性能。討論我們進(jìn)行了原發(fā)性黑素瘤、良性痣和正常皮膚組織標(biāo)本的基因表達(dá)諳分析，以便找到可能用于LN分子分期分析的黑素瘤特異性基因標(biāo)志物。鑒定了在惡性黑素瘤樣品中高度和差異表達(dá)的新基因.在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中引入良性痣對(duì)于我們的研究是關(guān)鍵的。與正常皮膚相比，良性痣中的黑素細(xì)胞含量與黑素瘤中的黑素細(xì)胞含量接近。除通過組織學(xué)評(píng)估外，這是通過黑素瘤和痣組織標(biāo)本中諸如酪氨酸酶和MART的常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物的相同高的表達(dá)水平而證實(shí)的。相似的細(xì)胞組成使我們能夠監(jiān)測(cè)與黑素瘤惡性轉(zhuǎn)化特異性相關(guān)(而不僅僅與黑素細(xì)胞系分化相關(guān))的基因表達(dá)。作為結(jié)果，我們鑒定了在黑素瘤中特異性超量表達(dá)的新基因.新的高度超量表達(dá)的黑素瘤基因之一，即前列腺分化因子(PLAB，MIC1)，是轉(zhuǎn)化生長因子-P超家族的成員，并且已知與其它惡性腫瘸相關(guān)。Baeetal.(2003);和Welshetal.(2003)。PLAB減少了細(xì)胞粘附(Yamauchietal.(2003))，表明了它在黑素瘤進(jìn)展中的可能作用.在黑素瘤中超量表達(dá)的基因的途徑分析表明了許多這樣的基因與神經(jīng)組織功能和發(fā)育相關(guān)，表明黑素細(xì)胞的去分化和過程的激活與對(duì)黑素瘤發(fā)育和進(jìn)展可能是重要的多能前體細(xì)胞相關(guān)。此外，規(guī)范途徑的分析表明，神經(jīng)組織相關(guān)的淀粉樣蛋白加工在黑素瘤中受到顯著調(diào)節(jié)。以前沒有將淀粉樣蛋白加工(APP)途徑自身與黑素瘤發(fā)育和進(jìn)展進(jìn)行關(guān)聯(lián)，APP途徑中的許多基因，如P-和Y-分泌酶家族(BACE2，PSEN2)的成員也參與Notch途徑，并且在Notch和APP中都起到裂解整合膜蛋白的作用.Esleretal.(2001)。Notch阻抑了分化，并且?guī)椭S持神經(jīng)峰干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)(Gangemietal.(2004)),Notch在黑素瘤中的參與，特別是y-分泌酶的作用是很多研究的焦點(diǎn).Hoeketal.(2004);Baldietal.(2003);和Wilsonetal.(2000)。我們比較了我們的結(jié)果和Haqqetal(2005)最近的研究，在他們的工作中，用含有20,862個(gè)探針的cDNA陣列對(duì)良性痣、原發(fā)性黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤標(biāo)本進(jìn)行語分析。樣品組包括轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性黑素瘤以及良性痣.在它們的研究中發(fā)現(xiàn)了區(qū)分良性痣和原發(fā)性惡性黑素瘤組織的相似簇集結(jié)果。在兩個(gè)研究中報(bào)道的可以區(qū)分黑素瘤和良性痣的共同基因包括驅(qū)動(dòng)蛋白樣5(KNSL5)、前列腺分化因子(PLAB)、CITED1、骨橋蛋白(SPP1)、組織蛋白酶B(CSTB)、鈣粘著蛋白3(CDH3)、早老蛋白2(PSEN2).我們的一步RT-PCR分析證明，新的黑素瘤特異性基因PLAB和L1CAM不僅在原發(fā)性黑素瘤組織中表達(dá)，也在黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶中表達(dá).此外，區(qū)分惡性黑素瘤和良性痣的能力使得它們是比常規(guī)用于對(duì)黑素瘤診斷進(jìn)行分子測(cè)試的常規(guī)標(biāo)志物更好的候選物。在臨床研究中進(jìn)一步驗(yàn)證后，這些基因可以開發(fā)為用于分子分期分析的特異性標(biāo)志物，以便在崗哨淋巴結(jié)(SLN)活檢程序中檢測(cè)黑素瘤微轉(zhuǎn)移，所述基因的另一可能應(yīng)用是診斷具有不確定的病理學(xué)特征的黑素細(xì)胞病變。盡管為了清楚理解的目的通過說明和舉例以一定詳細(xì)程度描述了上文的發(fā)明，但這些描述和舉例不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍。表15序列說明、名稱和序列編號(hào):<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>138203557Sat剛一000281PCBD肝細(xì)胞核因子lcc的6-丙胡酰四氫嚷吟合酶二聚化輔因子139203570atNM005576LOXU賴氨酰氧化酶樣1140203590一atNM—006141DNCLI2動(dòng)力蛋白，細(xì)胞質(zhì)，輕中間多肽2141203643atNM006494ERFEts阻遏因子142203663satNM0042.55C0X5A細(xì)胞色素c氧化酶亞基Va143203668at剛006715MAN2C1甘露糖苷蘇，a,2C類，成員1144203693satNM001949E2F3E2F轉(zhuǎn)錄因子3145203695satNM004403DFNA5耳聾，常染色體顯性5146203723at細(xì)002221ITPKB肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B147203729atNM001425EMP3上皮膜蛋白3148203730丄atBF196931ZFP95與小鼠中的Zfp95同源的鋅指蛋白149203731satNM014569ZFP95150203775atNM014251SLC25A13溶質(zhì)栽體家族25,成員13151203827atNM017983FU10055假定蛋白FLJ10O55152203878s8tNM005940MMP"基質(zhì)金屬蛋白酶"153204014atNM001394DUSP4雙特異性褲酸酶4154204015satBC002671DDSP4155204033atNM004237TRIP13甲狀腺素受體相互作用蛋白13156204092satNM003600STK15絲氨酸蘇氨酸激酶15157204099一atNM_003078SMARCD3SWISNF相關(guān)的，基質(zhì)相關(guān)的，染色質(zhì)的肌動(dòng)蛋白依賴性調(diào)節(jié)刑，亞家族d，成員3158204170satNM001827CKS2CDC28蛋白激酶2159204197satNM004350圓X3runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3160204198satAA54簡圓X3161204202atNM017604,1023KIAA1023蛋白162204228atNM006347USA-CYP親環(huán)蛋白163204244satNM006716ASKS期激酶的激活刑164204247satNM004935CDK5細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5165204252atM68520cdc2相關(guān)蛋白激醉166204262satNM000447PSEN2早老蛋白2轉(zhuǎn)錄變體1167204423—atNM_013255MKLN1muskellin1，含有kelch基序的細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)168204436atNM025201PP1628假定蛋白PP1628169204458atAU10209DKFZp564A01221702044673atNM000345SNCA突觸核蛋白，a轉(zhuǎn)錄變體NACP140171204584一atAI653981UCAM丄l細(xì)胞粘附分子，MASA轉(zhuǎn)錄變體172204585sat剛000425L1CAM173204647at剛004838HOMER-3同聚體，神經(jīng)元立即早期基因，3174204654satNM003220TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子AP-2a175204709sat剛004866KNSL5驅(qū)動(dòng)蛋白樣5176204778x8tAW102783H0XB7同源盒B7177204779satNM004502H0XB7178204857atNM003550MAD1L1MAD1樣1179204932atBF433902TNF受體超家族，成員lb180204973atNM000化6GJB1間隙連接蛋白，Pl,32kD181204995—atAL567411細(xì)胞詢期蛋白依賴性激酵5,調(diào)節(jié)亞基1(p35)182205051satNM000222KITv-kitHardy-Zuckerman4貓科動(dòng)物72肉瘸病毒癌基因同源物<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>320213496atAW592663KIAA0455基因產(chǎn)物321213573atAA861608核周蛋白(輸入蛋白)B1322213587satAI884明7核糖體蛋白L26323213638atAW054711染色體6p24上的PAC257A7324213670xatAI768378KIAA0618基因產(chǎn)物325213720_s_atAI831675SWISNF相關(guān)的，基質(zhì)相關(guān)的，染色質(zhì)的肌動(dòng)e蛋白依賴性調(diào)節(jié)劑，亞家族a,成員4326213746satAW051856細(xì)絲蛋白A，ai，一"/213836s8tAW052034KiAAlOOl蛋白328213895atBF445047上皮膜蛋白蛋白1329213960atT87225克隆=IMAGE:22392330214023xatAL533B38微管蛋白，e多肽331214068atAF070610克隆24505332214104atAI703188.G蛋白偶聯(lián)的受體333214201xatAA742237HLA-B相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物-2334214581xatBE568134死亡受體6335214614atAI738662同源盒HB9336214632atM295257神經(jīng)氈蛋白2337214656xatBE790157M蛋白IB338214687xatAK026577FLJ22924fis339214708atBG484314肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白，ei340214710salBE407516細(xì)胞周期蛋白Bl341214714atAK022360FLJ12298fis342214717atAL137534DKFZp434H1419343214752xatA1625550細(xì)絲蛋白A，a344214778_at'A即簡1MEGF8345214841atAF070524克隆24453346214893丄atAI421964超極化激活的環(huán)狀核苷酸門控的鉀通道2347214696atAL109671EUROIMAGE29222348215025atS76476trkC(可變剪接的)349215115xatAI6額5ets變體基因6(TEL癌基因)350215126—atAL109716EUROIMAGE208948351215155at細(xì)78'HEXA異常P-氨基己糖苷酶a鏈352215311atAL109696EUROIMAGE21920353215812satU4"63SLC6A10肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白354215836satAK026188FLJ22535fis355216194一s一atAD001527來自含有CAPNS和P0L2RI的染色體19-粘粒(24590的DNA356216973satS49765同源盒B7357217033一x一atS76475trkC神經(jīng)營養(yǎng)格氨酸激酶，受體，3型358217104atAL109714.EUROIMAGE327506359217226satM95929PH0X1成對(duì)的間皮同源盒l(wèi)360217297satAF143684MY09b非常規(guī)的肌球蛋白Ixb361217377_x_atAF041811ETV6-NTRK3融合體ETS相關(guān)的蛋白生長因子受體私氨酸激酶融合蛋白362217419xatAK021586FLJ11524fis363217624atM464753ESTs364217799xatNM003344UBE2H遍在蛋白綴合酶E2H365217827satNM016630ACP33酸寇蛋白33366217867xatNM01210SBACE2P習(xí)位點(diǎn)APP裂解酶276<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>593204718at剛004445EPHB6EphB6594204719一atNM一007鄉(xiāng)ABCA8ATP結(jié)合盒，亞家族A成員8595204734atNM002275KRT15角蛋白15596204749atNM004538NAP1L3核小體組裝蛋白l-樣3597204753satA舊簡2肝白血病因子598204754atAI810712肝白血病因子599204755xatM95585HLF白血病因子600204765—atNM一006435ARHGEF5Rbo鳥氨酸核苷酸交換因子5601204773atMM004512IU1RA白介素U受體，a602204773atNM—004512IL11RA603204855一atNM_002639SERPINB5絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白醉抑制劑，進(jìn)化枝B,成員5604204872atNM007005BCE-1BCE-1蛋白605204937satNM016325ZNF274鋅指蛋白274606204942—s_atNM_000695ALDH3B2搭脫氫酵3家族成員B2607204952一at剛一014400C4.4AGPI錨定的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白同源物608204971atNM005213CSTA半錄酸蛋白酶抑制劑A(stefinA)609204975atNM001424EMP2上皮膜蛋白2610204990satNM000213ITGB4整聯(lián)蛋白，04611205014atNM005130HBP17肝素結(jié)合生長因子結(jié)合6122050198atNM004624VIPR1血管活性腸肽受體1613205081atNM001311CRIP1富含半胱氨酸的蛋白1(腸)614205109一s一atNM一015320ARHGEF4Rho鳥氨酸核苷酸交換因子(GEF)4615205128xatNM000962PTGS1前列腺素內(nèi)過氣化物合酶l616205185atNM—006846SP,絲氨酸蛋白酶抑制劑，Kazalt，5617205200at剛003278TNA四連蛋白618205206at剛000216KAL1Kallmann綜合征1序列619205236xatNM003102S0D3超氧化物歧化蘇3，細(xì)胞外620205251atNM022817PER2period同源物2轉(zhuǎn)錄變體1621205259_at既000901NR3C2核受體亞家族3，C組，成員2622205286atU85658轉(zhuǎn)錄因子ERF-l623205349atNM002068GNA15鳥氨酸核苷酸結(jié)合蛋白，ccl5624205363一atNM_003986BB0X1丁酰甜菜堿(Y)，2-氧化戊二酸二加氧酶1625205382satNM001928DF補(bǔ)體的D成分(肥胖菌素)626205384一atNM一005031FXYD1含有FXYD結(jié)構(gòu)域的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)物l'變體a627205403atNM004633IUR2白介素l受體，H型628205404atNM005525HSD"B1羥基甾體類脫氫酵l629205407一atNM一021"1RECK具有kazal基序的謙導(dǎo)回復(fù)突變的富含半胱氨酸的蛋白630205440satNM000909NPY1R神經(jīng)肽Y受體Yl631205455atNM002447MST1R巨噬細(xì)胞刺激l受體632205464—atNM000336S固1BNa通道，非電壓門控的1，e633205470satNM006353KLK"激肽釋放酵1163420S4卯XatBF060667連接蛋白間隙接合蛋白，P3，31kD635205498atNM000163GHR生長激素受體636205559satNM006200PCSK5原蛋白轉(zhuǎn)4匕酶subtilisinkexin5型82<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>參考文獻(xiàn)WO96/294302003/02323562002/01603822002/01554802002/01108202002/00985352003/00594312003/00497012002/00487842003/0142832003/00130976,500,9194,715,5455,210,0155,348,8565,411,8765,413,9245,487,9725,512,4375,512,4445,525,4945,550,0445,612,2015,759,7835,804,3755,844,0755,844,0925,872,2255,910,5745,969,1245,985,6195,994,1026,025,4746,057,1056,107,4766,153,3886,235,5256,291,4306,326,1456,338,9476,369,2116,403,3416,426,2176,465,1816,475,7276,500,6386,521,2276,527,5606,599,699Abrahamscnetal.(2004)Quantificationofme咖mamRNAmarkersinsentinelnodes:pre-clinicalevaluationofasingle-stepreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionassayJMolecDiag6:253-259Abrahamsenetal.(2005)Pathologicassessmentofmelanomasentinelnodes:aroleformolecularanalysisusingquantitativereal-timereversetr咖cription-PCRforMARTIandtyrosinasemessengerRNAClinCancerRes11:1425-1433Ademaetal.(1994)Molecularcharacterizationofthemelanocytelineagespecificantigengpl00JBiolChem69:20126-20133Ahmedetal.(2004)Cdc42-dependentnucleartranslocationofnon-receptortyrosinekinase,ACKbiochem.Biophys,Res,Commun.314:571-579Aitkenetal,(2004)Populationscreeningformelanoma:currentevidenceandacommunitybasedrandomizedtrial,to"TextbookofMelanoma"Ed.byJFThompson,DLMortonandBBRKroon.MartinandDunitzAkulaetal.(2004)Rafpromoteshumanheipesvirus-8(HHV-8/KSHV)infectionOncogene23:5227-5241Alexaetal.(2004)ContributionofdistinctstructuralelementstoactivationofcalpainbyCa2+ionsJ.Biol.Che審.279:20118-20126Altznaueretal,(2004)Calpain-1regulatesBaxandsubsequentSraac-dependentcaspase-3activationin加utrophilapoptosisJ.Biol.Chem.27^:5947-5957Antonescuetal,(2002)Moleculardiagnosisofclearcellsarcoma:detectionofEWS-ATF1andMITF-Mtranscriptsandl^istopathologicalandultrastructuralanalysisof12casesJ.Mol.Diag.4:44-52Arozarenaetal.(2004)ActivationofH-RasintheendoplasmicreticulumbytheRasGRFfamilyguaninenucleotideexchangefactorsMol.Cell.Biol.24:1516-1530Baeetal.(2003)GeneexpressionpatternsaspotentialmolecularbiomarkersformalignanttransformationinhumankcratinocytestreatedwithMNNG,arsenicorametalmi血eToxicolSci74:32-42Balchetal.(2001)FinalversionoftheAmericanJointCommitteeoncancerstagingsystemforcutaneousmelanomaJClinOncol19:3635-3648Baldietal.(2003)Identificationofgenesdown-regulatedduringmelanomaprogression:acDNAarraystudyExpDermatol12:213-218Baracetal.(2004)Directinteractionofp21-activatedkinase4withPDZ"RhoGEF,aGprotein-linkedRhoguani'neexchangefactorJ.Biol.Chem.279:6182-6189臺(tái)endottietal.(2004)Activatedp38MAPKisanovelcomponentoftheintracellularinclusionsfoundinhumanamyotrophiclateralsclerosisandmutantSODltransgenicmiceJ.Neuropatbol.Exp.Neurol.63:113-119Bittneretal.(2000)MolecularclassificationofcutaneousmalignantmelanomabygeneexpressionprofilingNature406:536-540Bosticketal.(1999)Prognosticsignificanceofoccultmetastasesdetectedbysentinellymphadencctomyandreversetranscriptase-polymerasechainreactioninearly-stagemelanomapatientsJ.Clin.Oncol.17:3238-324^Brownetal.(2003)MIC'lSerumLevelandGenotype:AssociationswithProgressandPrognosisofColorectal(parcinomaClin.CancerRes.9:2642-2650Buckhaultsetal.(2001)SecretedandcellsurfacegenesexpressedinbenignandmalignantcolorectaltumorsCancerRes.61:6996-7001Burzioetal.(2002)BiochemicalandcellularcharacteristicsofthefoursplicevariantsofproteinkinaseCKlalphafromzebrafish(Daniorerio)J.Cell,Bioch咖.86:805-814Buchsetal.(2004)Normalp21Ras/MAPkinasepathwayexpressionandftmctioninPBMCfrompatientswithpoiycysticovarydise助eInt.J.Mol.ML13:595-599CancerFacts;andFigures2003.AmericanCancerSociety,2003,Careetal.(1996)HOXB7constitutivelyactivatesbasicSbroblastgrowthfactorin咖l咖masMol.Cell.Biol.16:4842-4851Carlsonctal.(2003)Biomarirersinmelanoma:staging,prognosisanddetectionofearlymetastasisExpertRevMolDiagn3:89-116Catalaetal.(2002)GeneticcontrolofcaudaldevelopmentClin.Ge加t.61:89-96Chenetal.(2003)Molecularcharacterizationofhumannineinprotein:twodistinctsubdomainsrequiredforcentrosomaltargetingandregulatingsignalsincellcycleBioche邁.Biophys.Res.Commun.308:975-983Karanctaj.(2003)DysrcgulatedexpressionofMIC-1/PDFinhumanprostatetumorcellsBiochim.Biop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(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。53.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%.54.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。55.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。56.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量.57.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中通過從樣品提取的RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).58.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè)，59.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。60.權(quán)利要求59的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3.61.權(quán)利要求60的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5,62.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT陽PCR)。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。64.權(quán)利要求57的方法，其中通過以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。65.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素.66.權(quán)利要求65的方法，其中通過以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。68.權(quán)利要求66的方法，其中所述基質(zhì)包括二氣化硅。69.權(quán)利要求64的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。70.權(quán)利要求64的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。71.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中通過測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá)。72.權(quán)利要求71的方法，其中通過蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白，73.區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法，包括以下步驟a.獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中編碼PLAB(SEQIDNO:1)和L1CAM(SEQH)NO:2);或PLAB、LICAM和NTRK3(SEQIDNO:3)的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在惡性黑素瘤。74.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼輅氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平。75.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。77.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。78.權(quán)利要求73、74、75、76或T7的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。79.權(quán)利要求"的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié).80.權(quán)利要求73、"、75、76或77的方法，其中所述樣品獲自活檢，81.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。82.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移。83.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。84.權(quán)利要求83的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。85.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%。86.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%。87.權(quán)利要求83的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。88.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。89.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%.卯.90.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。91.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá).92，權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。93.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中通過從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).94.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).95.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。96.權(quán)利要求95的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3,97.權(quán)利要求96的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。98.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR).99.權(quán)利要求93的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑.100.權(quán)利要求93的方法，其中通過以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。101.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素，102.權(quán)利要求101的方法，其中通過以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。104.權(quán)利要求102的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。105.權(quán)利要求100的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。106.權(quán)利要求100的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。107.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中通過測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).108.權(quán)利要求107的方法，其中通過蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。109.區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法，包括以下步驟a,獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中選自SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4陽6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18的引物/探針組識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在惡性黑素細(xì)胞。110.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼賂氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平，111.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平.112.權(quán)利要求110的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。113.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平.114.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。115.權(quán)利要求114的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。116.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述樣品獲自活檢，117.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。118.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移。119.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。120.權(quán)利要求119的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。121.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%,122.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%。123.權(quán)利要求119的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。124.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%.125.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。126.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。127.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá).128.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。129.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中通過從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá)，130.權(quán)利要求129的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).131.權(quán)利要求129的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。132.權(quán)利要求131的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3,133.權(quán)利要求132的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。134.權(quán)利要求128的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR).135.權(quán)利要求134的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。136.權(quán)利要求129的方法，其中通過以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA,137.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素。138.權(quán)利要求136的方法，其中通過以下步稞減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。139.權(quán)利要求136的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。140.權(quán)利要求136的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。141.權(quán)利要求136的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。142.權(quán)利要求136的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的.143.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中通過測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).144.權(quán)利要求143的方法，其中通過蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白，145.確定患者治療方案的方法，包括以下步驟a.從患者獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中編碼PLAB(SEQIDNO:1)和L1CAM(SEQIDNO:2);或PLAB、L1CAM和NTRK3(SEQIDNO:3)的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤。146.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼璐氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平。147.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平，148.權(quán)利要求147的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。149.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。150.權(quán)利要求l45、146、l47、148或149的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。151.權(quán)利要求1S0的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。152.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中所述樣品獲自活檢。153.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行.154.權(quán)利要求l45、146、147、148或149的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移.155.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移.156.權(quán)利要求I55的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。157.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%。158.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%,159.權(quán)利要求155的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。160.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%,161.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。162.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。163.權(quán)利要求l45、146、H7、148或149的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。164.權(quán)利要求l45、l46、147、148或149的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。165.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中通過從樣品提取的RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).166.權(quán)利要求165的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè)。167.權(quán)利要求165的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。168.權(quán)利要求167的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3。169.權(quán)利要求168的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。170.權(quán)利要求152的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。171.權(quán)利要求no的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑.172.權(quán)利要求165的方法，其中通過以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。173.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素.174.權(quán)利要求173的方法，其中通過以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。175.權(quán)利要求174的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。176.權(quán)利要求174的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅.177.權(quán)利要求的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的.178.權(quán)利要求172的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。179.權(quán)利要求"5、"6、U7、148或149的方法，其中通過測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).180.權(quán)利要求的方法，其中通過蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。181.確定患者治療方案的方法，包括以下步驟a.從患者獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中由選自SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18的引物/探針組識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤。182.權(quán)利要求181的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼酪氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平，183.權(quán)利要求181的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平.184.權(quán)利要求181的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979).185.權(quán)利要求184的方法，進(jìn)一步包括測(cè)童至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。186.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié).187.權(quán)利要求1S6的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。188.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述樣品獲自活檢。189.權(quán)利要求1M、1M、l83、184或l85的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。190，權(quán)利要求1M、l82、l83、或185的方法，其中所述黑191.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。192.權(quán)利要求191的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。193.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%.194.權(quán)利要求1M的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%.195.權(quán)利要求191的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。196.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%.197.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。198.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。199.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。200.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。201.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中通過從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá)。202.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).203.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán).204.權(quán)利要求203的方法，其中突光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3.205.權(quán)利要求204的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。206.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。207.權(quán)利要求206的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。208.權(quán)利要求201的方法，其中通過以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。209.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素。210.權(quán)利要求209的方法，其中通過以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。211.權(quán)利要求210的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠.212.權(quán)利要求210的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。213.權(quán)利要求208的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。214.權(quán)利要求208的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的，215.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中通過測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá)。216.權(quán)利要求215的方法，其中通過蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。217.包含至少一種選自SEQIDNOs:4-6，SEQIDNOs:7-9，SEQIDNO:46-48，SEQIDNOs:13-15，SEQIDNOs:16-18，SEQIDNOs:19-21和SEQIDNOs:22-24的引物/探針組的組合物。218.包含至少一種選自SEQIDNOs:25-28的擴(kuò)增子的組合物。219.進(jìn)行分析以確定組織樣品中黑素瘤的存在的試劑盒，包含核酸擴(kuò)增和檢測(cè)試劑。220.權(quán)利要求219的試劑盒，其中所述試劑包括引物，該引物具有用于檢測(cè)編碼選自SEQIDNOs:1-3的mRNA的至少一種基因的表達(dá)的序列。221.權(quán)利要求219的試劑盒，包含RT-PCR試劑。全文摘要通過確定特定基因的差異表達(dá)是否表示黑素瘤超過截止值而進(jìn)行鑒定惡性黑素細(xì)胞的分析。該分析可以在手術(shù)中在淋巴結(jié)組織上進(jìn)行。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101258249SQ200580027824公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2005年6月24日優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日發(fā)明者A·馬祖姆德,D·塔蘭托夫,Y·王申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司