專利名稱：：轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的可調(diào)控型表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因治療導(dǎo)入的基因的調(diào)控，特定地調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。技術(shù)背景許多人類疾病是由基因的異常表達(dá)引起。當(dāng)基因表達(dá)不足時(shí)，或當(dāng)基因產(chǎn)物本身有缺陷時(shí)，相應(yīng)功能基因產(chǎn)物的缺失可通過將丟失的基因產(chǎn)物遞送至患者來治療。然而，蛋白質(zhì)的遞送通常有困難，且僅僅在有限的時(shí)間內(nèi)給予益處，意思指所述蛋白質(zhì)必須定期地重復(fù)再給藥，或許需要不定期給藥，如在存在慢性疾病的情況下。重復(fù)給藥費(fèi)用很高、不方便，并可能由于差的患者順應(yīng)性而使受痛苦。而且，在剛剛給藥一個(gè)劑量后的時(shí)間和給藥另一個(gè)劑量前的時(shí)間，基因產(chǎn)物的水平可顯著地改變。該水平的變化性對(duì)具有差的藥代動(dòng)力學(xué)(例如，半衰期短)或低療效指數(shù)的治療劑而言特別是問題?；蛑委熆捎糜趯⒒?，而不是基因產(chǎn)物遞送至顯示出最適度以下的那些基因的細(xì)胞。除了在補(bǔ)充表達(dá)不足的或有缺陷的內(nèi)源基因，基因治療也可以遞送其它的基因，所述其它的基因可能當(dāng)其在靶細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可具有有益效果的，例如細(xì)胞因子、激素、抗體或遺傳修飾的蛋白質(zhì)。在本文中，通過基因治療遞送的基因是指轉(zhuǎn)基因。當(dāng)轉(zhuǎn)基因在靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，基因治療具有不定期遞送穩(wěn)定水平的基因產(chǎn)物的潛能。與重復(fù)遞送基因產(chǎn)物自身相比，基因治療僅需要實(shí)施一次，或者至少很少發(fā)生。作為遞送治療蛋白質(zhì)至腦部的方法，基因治療是特別優(yōu)選的，因?yàn)橛捎谘X屏障，系統(tǒng)給藥蛋白質(zhì)將不可能進(jìn)入腦部，且直接立體定位注射進(jìn)入腦部對(duì)于重復(fù)給藥是不切實(shí)際的。嚴(yán)被瘋毒》，基鄉(xiāng)#已經(jīng)研究將病毒載體用于協(xié)助有效率的遞送轉(zhuǎn)基因至靶細(xì)胞，在本文中該方法稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。一種已被用于基因遞送的病毒系統(tǒng)為腺相關(guān)病毒(AAV)。AAV為屬于依賴病毒屬的細(xì)小病毒。AAV具有某些在其它病毒中未發(fā)現(xiàn)的有吸引力的特征。首先，AAV可以感染大量的宿主細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞。感染非分裂細(xì)胞的能力使AAV成用于轉(zhuǎn)導(dǎo)CNS組織例如大腦的特別好的選擇。第二，AAV可以感染來自不同種類的細(xì)胞。第三，AAV與任何人類或動(dòng)物疾病都無關(guān)，且似乎不會(huì)改變?cè)谡现械乃拗骷?xì)胞的生物學(xué)特性。甚至，有人據(jù)計(jì)80-85%的人類人群己經(jīng)暴露于該病毒。最后，AAV在大量物理和化學(xué)條件下是穩(wěn)定的，其便于生成、儲(chǔ)存和運(yùn)輸。AAV基因組為線性的單鏈DNA分子，長(zhǎng)度為約4681個(gè)核苷酸(nt)。AAV基因組通常包括通過在每個(gè)末端的反向重復(fù)(ITRs)連接的內(nèi)部非重復(fù)基因組。ITRs為約145nt長(zhǎng)。ITRs起DNA復(fù)制源和用于病毒基因組的包裝信號(hào)的作用。對(duì)于AAV的復(fù)制(rep)和殼體(cap)基因而言，基因組的內(nèi)部非重復(fù)部分包括兩個(gè)主要的可讀框。rep和cap基因編碼那些使病毒復(fù)制和將病毒基因組包裝成病毒體的蛋白質(zhì)。特別地，來自AAVrep區(qū)域的至少四個(gè)病毒蛋白質(zhì)家族被表達(dá)R印78、R印68、R印52和R印40，根據(jù)它們的表觀分子量命名。AAVcap區(qū)域編碼至少三個(gè)蛋白質(zhì)VPI、VP2禾QVP3。AAV為輔助依賴性病毒(helperd印endentvims)，艮P，為了形成AAV病毒體，它通常需要與輔助病毒(例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒)同時(shí)感染。在不存在與輔助病毒同時(shí)感染的情況下，AAV形成了潛伏狀態(tài)，其中病毒基因組持續(xù)作為附加體或者插入宿主細(xì)胞染色體，但是不會(huì)生成感染性的病毒體。隨后的輔助病毒的感染"救濟(jì)"整合的基因組，使其復(fù)制基因組并包裝成感染性的AAV病毒體。盡管AAV可感染來自不同種類的細(xì)胞時(shí)，輔助病毒必須具有相同的種類，如宿主細(xì)胞。因此，例如，人類AAV將在用犬科腺病毒同時(shí)感染的犬科細(xì)胞中復(fù)制。AAV載體經(jīng)設(shè)計(jì)通過刪除AAV基因組的內(nèi)部非重復(fù)部分(即rep和cap)和在ITRs之間插入異源基因("轉(zhuǎn)基因)來遞送感興趣的基因。轉(zhuǎn)基因可能與異源啟動(dòng)子有關(guān)。也可以包括終止信號(hào)，例如多腺苷酸化位點(diǎn)。為了產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)基因的感染性的重組AAV的原種(stock)，用AAV表達(dá)載體轉(zhuǎn)染適宜的生產(chǎn)細(xì)胞系，所述表達(dá)載體包含夾在AAVITRs之間的轉(zhuǎn)基因。AAV輔助功能和附屬功能也在生產(chǎn)者細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)野生型AAV(wtAAV)在由輔助病毒(例如腺病毒)共同感染的細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，輔助功能為通常由AAV編碼的基因(例如rep和帽)提供的那些功能，附屬功能為通常由輔助病毒提供的那些功能。在wtAAV中編碼輔助功能的基因必須分別提供，因?yàn)樵趓AAV載體的結(jié)構(gòu)中它們被轉(zhuǎn)移以給轉(zhuǎn)基因序列讓出空間。在存在輔助功能和附屬功能的情況下，包括轉(zhuǎn)基因和AAVITRs的載體結(jié)構(gòu)被復(fù)制并包裝形成重組AAV病毒體(rAAV)。rAAV原種的生成進(jìn)一步描述在美國(guó)專利Nos.5,622,856;6,001,650;6,027,931;6,365,403;6,376,237;5,945,335;6,004,797和6,482,633中，在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。因此，如此制備的rAAV原種可通過在不存在輔助病毒下用rAAV感染耙細(xì)胞而用于將轉(zhuǎn)基因引入體外靶細(xì)胞，或引入患者體內(nèi)。因?yàn)榛颊叩募?xì)胞缺乏rep和cap基因和附屬功能基因，所以，在靶細(xì)胞中，rAAV載體為復(fù)制有缺陷的；艮P，它們不能進(jìn)一步復(fù)制和包裝它們的基因組。類似地，在沒有rep和cap基因源下，在患者的細(xì)胞中不能形成wtAAV?？p凝這游縦AAV介導(dǎo)的基因治療和通常的基因治療的一個(gè)可能的缺點(diǎn)為一旦其被給藥，就沒有逆轉(zhuǎn)處理或調(diào)整其效果的能力。與傳統(tǒng)的藥物遞送不同，其可以任何時(shí)候根據(jù)需要中止，成功的基因治療在給藥載體后提供了穩(wěn)定的長(zhǎng)期基因表達(dá)。在治療人類患者中，停止轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力是重要的安全考慮。而且，下調(diào)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力將在保證患者中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的適當(dāng)藥理學(xué)控制(給藥)中有用。已經(jīng)研究了使用小分子誘導(dǎo)物來調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的各種系統(tǒng)。Rivera等(1996)A/af.Med2:1028-32;No等(1996)Proc.Wa〃.Acad.ScLUSA93:3346-51;Gossenanc/S"/'arc/(1992)Prac.腳.Acac/.Sc/"S>A89:5547-51;GeneSwitch⑧系統(tǒng)(Valentis,Inc.,Burlingame,California)。這些系統(tǒng)是基于利用設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因，所述設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子的活性可通過小分子藥物控制，所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通過調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)。一種這樣的系統(tǒng)，基于雷帕霉素誘導(dǎo)(在本文中稱為"二聚物(dimerizer)系統(tǒng)")，包括從兩個(gè)合成性融合蛋白質(zhì)形成功能性轉(zhuǎn)錄因子，取決于加入的雷帕霉素。Rivera等(1996)Nat.Med.2:1028-32.雷帕霉素為一種口服生物可利用的小分子藥物，其與天然產(chǎn)物免疫抑制劑FK506密切相關(guān)，其以高親合力(200pM)結(jié)合至細(xì)胞的蛋白質(zhì)FKBP12，然后，復(fù)合物結(jié)合FRAP。盡管雷帕霉素具有內(nèi)固有的免疫抑制活性，但是已經(jīng)研究了非免疫抑制類似物，其可與改性的FRAP基因序列使用在二聚物系統(tǒng)中的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而不會(huì)有不想要的免疫抑制。Pollock等(2000)Proc.Natl.Acad.SciUSA97:13221-26.。用于體內(nèi)遺傳調(diào)控的基于二聚物系統(tǒng)更詳細(xì)地描述在Rivera等的(1996)Nat.Med.2:1028-32中禾卩Pollock等的(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13221-26中。二聚物系統(tǒng)適于與病毒載體使用以遞送基因至肌肉(Ye等(1999)Science283:88-91;Rivera等(1999)Proc.Natl.Acad.SciUSA96:8657-62;Johnston等(2003)Mol.Ther.7:493-7)、肝(Auricchio等(2002)GeneTher9:963-71)和眼部(Auricchio等(2002)Mol.Ther.6:238-42)。所述二聚物系統(tǒng)也是ARIADPharmaceuticals,Inc.(Cambridge,Massachusetts)的ARGENT轉(zhuǎn)錄技術(shù)平臺(tái)的組分。該技術(shù)進(jìn)一步公開在Crabtree等的美國(guó)專利No.6,043,082中和Clackson等的美國(guó)專利No.6,649,595中，在No.6,043,082中一般性描述了ARGENT基于二聚物系統(tǒng)，在No.6,649,595中描述了使用基于雷帕霉素或雷帕霉素類似物的二聚物系統(tǒng)，其包括合成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、p65轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和具有降低的免疫抑制的rapalogs。在本文中將美國(guó)專利.Nos.6,043,082和6,649,595中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。所述二聚物系統(tǒng)具有完全人源化的優(yōu)點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)錄激活融合蛋白質(zhì)的功能性組分的序列全部來源于人類蛋白質(zhì)，從而減少了在人類中不利的免疫應(yīng)答的可能。Rivera等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8657-62.齡，汰銜PDJ帕金森氏癥(PD)為可能會(huì)接受基因治療特別是AAV基因治療的疾病的實(shí)例。在美國(guó)，PD為第二種最常見的神經(jīng)變性疾病，影響了超過一百萬(wàn)人。PD的特征為自主運(yùn)動(dòng)減少、行走困難、姿勢(shì)不穩(wěn)定性、僵硬和顫動(dòng)。這些臨床征兆為在腦的基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域的黑質(zhì)中的著色的神經(jīng)元(即多巴胺能神經(jīng)元)退化的直接后果。黑質(zhì)漸進(jìn)性退化導(dǎo)致多巴胺的有效率降低，因?yàn)楹谫|(zhì)的著色的神經(jīng)元為合成該重要的兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)的部位。多巴胺為在黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的端神經(jīng)末端合成的，特別是在黑質(zhì)密部。計(jì)劃進(jìn)入紋狀體的多巴胺能神經(jīng)，特別地支配殼核和尾狀殼核。三種酶是用于多巴胺的有效生物合成所必需的酪氨酸羥化酶(TH)、鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶I(GCH)，和芳香L-氨基酸脫羧酶(AADC)。酪氨酸羥化酶將羥基加至氨基酸酪氨酸，構(gòu)建了L-二羥苯丙氨酸(左旋多巴)。GCH催化BH4生物合成的第一步和限速步驟，其為用于TH活性的必需的輔因子。最后，AADC除去左旋多巴的末端羧基，生成多巴胺。目前，PD的治療包括通?？诜o藥左旋多巴與AADC.的外周性抑制劑的組合。隨著PD的發(fā)展，大多數(shù)患者經(jīng)受著腦的受感染區(qū)域AADC含量(即黑質(zhì))的減少。因?yàn)锳ADC是用于將左旋多巴轉(zhuǎn)化成多巴胺所需要的，逐步升高劑量的左旋多巴是治療效果所需要的，但這通常會(huì)引起副作用增加。此外，隨著黑質(zhì)逐漸地變質(zhì)，AADC缺失繼續(xù)存在，通常達(dá)到給藥L左旋多巴的治療益處不再獲得的水平。一種治療PD的基于基因治療的方法為提供編碼一種或多種參與多巴胺生物合成的酶的基因，例如AADC。補(bǔ)充的AADC恢復(fù)了左旋多巴治療的功效。AAV衍生的載體和通過在哺乳動(dòng)物患者的腦中遞送和表達(dá)AADC治療PD的方法描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2002/0172664，在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。帕金森氏癥(PD)的特征在于黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性損失，和紋狀體中多巴胺的嚴(yán)重減少。Hornykiewicz(1975)/Vaf/./nsf.Drug/^wseRes.MonogA:Sen13-21。6-OHDA模型是通過化學(xué)損害從黑質(zhì)伸至紋狀體的甜腦內(nèi)側(cè)束產(chǎn)生的，組織病理類似于PD.Ungerstedt(1971)ActeP/7ys/'0/.Scand.St/pp/.367:69-93。在一個(gè)半球上單側(cè)6-OHDA損害的大鼠產(chǎn)生了對(duì)治療量的左旋多巴或多巴胺受體激動(dòng)劑應(yīng)答的快速雙側(cè)旋轉(zhuǎn)活性。Ungerstedt(1971)。在帕金森氏癥(PD)動(dòng)物模型中，現(xiàn)有的研究顯示出將編碼人類AADC(hAADC)的基因遞送至大鼠或非人類靈長(zhǎng)類紋狀體和外源性遞送左旋多巴可恢復(fù)多巴胺至有效水平，和減少左旋多巴需求。Bankiewicz等(2000)￡xp.Ateura/.164:2-14;Sanchez-Pernaute等(2001)Mo/.7T7er.4:324-30。GDWF用于治療PD的另一個(gè)基于基因治療的方法為遞送能阻斷或延緩進(jìn)行中的衰退過程的基因。膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)為有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其已經(jīng)在體外和PD動(dòng)物模型體內(nèi)顯示出增加了DA神經(jīng)元存活率。(Bjorklund等BrainRes.(2000)886:82-98;Bohn,M.C.，/Wo/.7T7er(2000)1:494-496;等丄NeuralTransm.Suppl.(2000)58:181-191),在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。AAV衍生的載體和通過在哺乳動(dòng)物患者的腦中遞送和表達(dá)GDNF來治療PD的方法描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2003/0050273，在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。盡管AADC或GDNF在帕金森患者腦內(nèi)的表達(dá)可能有益，但是該基因的過度表達(dá)可導(dǎo)致危險(xiǎn)的副作用。在基因治療中使用的典型的載體是用來引入強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子(strongconstitutivepromoters)以確保治療效果，所述啟動(dòng)子是用來最大化在患者中的全面的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。許多之前的研究嘗試最大化那些被轉(zhuǎn)導(dǎo)的少數(shù)細(xì)胞的表達(dá)，當(dāng)預(yù)期轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對(duì)低時(shí)，且當(dāng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是由轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分泌進(jìn)入體循環(huán)時(shí)，其可能是合理的目標(biāo)。某些二聚物調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的之前研究已涉及這些分泌性蛋白質(zhì)。Rivera等(1996)A/af.Mecf.2:1028-32;Rivera等(1999)Prac.A/a〃.AcadSc/,USA96:8657-62;Ye等(1999)Sc/e"ce283:88-91;Pollock等(2000)Proc,A/af/.AcadSc/'.L/S/A97:13221-26;Auricchio等(2002)GeneTTer.9:963-71;Johnston等(2003)/Wo/.7T7e廠7:493-7;Auricchio等(2002)/Wo/.7T7er6:238-42。與產(chǎn)物在循環(huán)系統(tǒng)中聚積的分泌性蛋白質(zhì)不同，如果非分泌性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在某些細(xì)胞過表達(dá)，而在其它細(xì)胞中缺乏時(shí)，不能獲得治療益處。利用非分泌性蛋白質(zhì)的基因治療可需要將轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控至每個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)想要的水平，其使得在轉(zhuǎn)導(dǎo)后這樣的蛋白質(zhì)是可調(diào)控的這點(diǎn)特別重要。神經(jīng)變性的疾病及其它CNS障礙的基因治療為一個(gè)擴(kuò)大的領(lǐng)域(Tinsley和Eriksson(2004)ActaNeurol.Scand.109:1-8)，而且轉(zhuǎn)基因調(diào)控可能對(duì)于劑量給藥控制和安全的目的是必要的。雖然在AADC治療的情況下調(diào)控基因表達(dá)可能不是必需的，因?yàn)槎喟桶返漠a(chǎn)生組成型上可通過外源性遞送其前體左旋多巴來控制，但是調(diào)控可能有益于準(zhǔn)確地控制一定劑量酶的遞送或引起治療終止，如果需要的話。調(diào)控可能是用于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(例如GDNF)的基因遞送的必要條件，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子過表達(dá)可具有有害作用，可通過特殊應(yīng)用來確定需要的控制程度。存在用于調(diào)控通過基因治療引入到患者的CNS(例如腦)中的基因的表達(dá)的方法和啟動(dòng)這種調(diào)控的載體的需要。具體而言，存在用于轉(zhuǎn)基因在患有神經(jīng)變性疾病例如PD的患者中的腦中可調(diào)控型表達(dá)的方法的需要。優(yōu)選地，該調(diào)控系統(tǒng)在抑制的條件下具有低的轉(zhuǎn)基因表達(dá)基礎(chǔ)水平，并且顯示出高的誘導(dǎo)比值。最優(yōu)選的系統(tǒng)也將包括專門衍生自人類蛋白質(zhì)的功能性組分，所述組分能使在人類基因治療期間逆轉(zhuǎn)(adverse)免疫反應(yīng)的概率最小。
發(fā)明內(nèi)容本領(lǐng)域中的這些及其它需要可通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)，其提供用于AAV介導(dǎo)的基因治療的載體、方法和試劑盒，其中轉(zhuǎn)基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的靶細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可使用誘導(dǎo)物來調(diào)控。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組AAV(rAAV)載體，其中在轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入患者的CNS(例如腦)后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)是可以調(diào)控的。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控是使用包含兩種多肽組分的轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的，僅僅當(dāng)兩種組分互相結(jié)合時(shí)，所述轉(zhuǎn)錄因子才是有活性的，其中在存在誘導(dǎo)物的情況下，所述組分分別獨(dú)立地結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩種多肽包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合和活化結(jié)構(gòu)域融合。一種示例性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合包括來自人類轉(zhuǎn)錄因子Zif268的兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、源自O(shè)ct-1的同源結(jié)構(gòu)域和三個(gè)來自胞質(zhì)的FK506受體的藥物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。示例性的活化結(jié)構(gòu)域融合包括融合至源自NFKB的p65亞基的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的人類FRAP雷帕霉素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一rAAV載體包括轉(zhuǎn)基因，第二rAAV載體包括轉(zhuǎn)錄因子組分的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)rAAV載體包括轉(zhuǎn)錄因子組分的序列和轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控是通過給藥誘導(dǎo)物實(shí)現(xiàn)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)物為二聚物，例如雷帕霉素或其非免疫抑制類似物，例如AP21967。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用rAAV載體治療患者的方法，其中在轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入患者的CNS(例如腦)后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)是可以調(diào)控的。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法包括給藥誘導(dǎo)物，例如二聚物，比如雷帕霉素或其非免疫抑制類似物，例如AP21967。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建本發(fā)明的載體或?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括具有聚合接頭區(qū)域第一rAAV載體，其用于克隆使用者感興趣的轉(zhuǎn)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括編碼轉(zhuǎn)錄因子的第二rAAV載體，其可以調(diào)控克隆進(jìn)入第一rAAV載體的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括一種誘導(dǎo)物，例如二聚物，比如雷帕霉素或其非免疫抑制類似物，例如AP21967。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療人類神經(jīng)變性疾病例如帕金森氏癥(PD)。在某些實(shí)施方案中，可調(diào)控型轉(zhuǎn)基因?yàn)锳ADC或GDNF，盡管通?？烧{(diào)控型轉(zhuǎn)基因可以為其在靶組織中的表達(dá)是想要的任意基因。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，根據(jù)在本文中公開的內(nèi)容，本發(fā)明的這些及其它實(shí)施方案將很容易地進(jìn)行。圖1A為編碼用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活化和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的rAAV載體(AAV-CMV-TF)的示意圖。在本文中，這樣的載體稱為轉(zhuǎn)錄因子載體。圖1B為編碼hAADC(AAV-Z12hAADC)的重組AAV載體的示意圖，所述載體的表達(dá)可通過加入雷帕霉素或其衍生物來調(diào)控。在本文中，這樣的載體稱為表達(dá)載體。圖1C為編碼hAADC(AAV-CMV-hAADC)的重組AAV載體的示意圖，所述載體的表達(dá)由組成型的CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。圖2顯示了下述試驗(yàn)的結(jié)果其中用多種rAAV構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)D7-4細(xì)胞，隨后用0、5或25nM的雷帕霉素類似物AP21967處理。也顯示了非轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)照。"OD"值指使用由用參照量AAV-CMV-hAADC2轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的相對(duì)AADC表達(dá)(如在AADC表達(dá)ELISA中通過00405檢測(cè))。圖3為如下試驗(yàn)的時(shí)間線其中對(duì)左旋多巴的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答是在6-OHDA損害的大鼠中測(cè)定的雷帕霉素處理的函數(shù)。圖4顯示了6-OHDA損害的大鼠對(duì)5mg/kg左旋多巴的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答，每小時(shí)在對(duì)側(cè)的旋轉(zhuǎn)中的表達(dá)，其為沿著在圖3中顯示的時(shí)間線的時(shí)間的函數(shù)。大鼠為用賦形劑單獨(dú)(對(duì)照)或者用編碼可調(diào)hAADC的載體和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子灌注的。在第一周和第二周沒有出現(xiàn)數(shù)據(jù)。輸注在第0天進(jìn)行，如在圖3中圖解的，其為由其開始測(cè)定周的數(shù)量的日期(例如"3周"指灌注后第21天)。為簡(jiǎn)單起見，在圖3中顯示的每日注射4次雷帕霉素("rap")的組在圖4中表示為單箭頭。圖5A顯示了在用AAV載體灌注后7周用雷帕霉素處理的大鼠的紋狀體內(nèi)AADC的免疫組織化學(xué)的結(jié)果，所述AAV載體載有用于hAADC的雷帕霉素可調(diào)控型表達(dá)所必需的序列。比例尺條表示75nm。圖5B顯示了類似于在圖5中顯示的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，但是其中大鼠沒有用雷帕霉素處理。圖6顯示了在灌注后7周獲得的來自三個(gè)處理組中的代表性大鼠的整個(gè)包埋大腦(mountedbrain)部分中AADC的免疫組織化學(xué)結(jié)果A:載體-灌注的(+)rap;B:載體灌注的(-)rap;C:賦形劑-灌注的(+)rap。如圖4所示，大鼠為單獨(dú)用賦性劑(圖6C)或者用編碼可調(diào)hAADC的載體和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(圖6A和6B)灌注的。隨后，用雷帕霉素處理在圖6A和6C中的動(dòng)物(如在圖3中所示)，但是不處理在圖6B中的動(dòng)物。左大腦半球?yàn)?-OHDA損害和紋狀體內(nèi)的載體(或賦形劑)灌注的部位，右大腦半球顯示出來自完整的大鼠AADC陽(yáng)性纖維的內(nèi)源性染色。圖7顯示出在參照?qǐng)D6中討論的三個(gè)處理組中，在灌注后7周AADC的表達(dá)，如通過蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定。上面圖譜為在來自三個(gè)處理組的每個(gè)中的代表性動(dòng)物腦中的蛋白質(zhì)凝膠電泳中觀察到的AADC和e肌動(dòng)蛋白帶的圖像，e肌動(dòng)蛋白被包括作為對(duì)照。柱狀圖顯示了用于每個(gè)處理組中三只動(dòng)物的AADC帶的蛋白質(zhì)帶的平均值集合的圖像強(qiáng)度(averageintegratedimageintensities)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖8A為rAAV載體(AAV-TF-Z8-hGDNF)圖，所述載體包括編碼轉(zhuǎn)錄因子的活化結(jié)構(gòu)域融合和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、編碼轉(zhuǎn)基因hGDNF的可調(diào)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中hGDNF表達(dá)可通過加入雷帕霉素或其衍生物來調(diào)控。圖8B為類似于在圖8A中顯示的載體的圖，不同在于轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)是由獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上SV40啟動(dòng)子而不是活化結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)的，活化結(jié)構(gòu)域?yàn)橛上喾存?即在相反方向上)表達(dá)。圖8C為編碼hGDNF的重組AAV載體的示意圖，所述載體的表達(dá)由組成型的CMV啟動(dòng)子(AAV-CMV-hGDNF)驅(qū)動(dòng)。圖9顯示了用可調(diào)控型TF-GDNF質(zhì)粒(AAV-TF-Z8-hGDNF)或組成型的CMV-GDNF質(zhì)粒(AAV-CMV-hGDNF)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLaD7-4細(xì)胞的GDNF表達(dá)，以微微克(pg)計(jì)，其為0、5或者25nM雷帕霉素處理的函數(shù)(function)。具體實(shí)施方式除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這樣的技術(shù)為在文獻(xiàn)中充分說明的。參見，伊j々口，T.E.Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishersInc.,currentaddition);Sambrook，etal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ndEdition,1989);MethodsInEnzymology(S.ColowickandN.Kaplaneds.，AcademicPress,Inc.);Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEdition(Easton,Pa.:MackPublishingCompany,1990)。I定義除非另有說明，在本申請(qǐng)中使用的所有科學(xué)術(shù)語(yǔ)和專業(yè)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域常規(guī)使用的含義。如在本申請(qǐng)中使用的，下述詞語(yǔ)或短語(yǔ)具有指定的含義。必須指出，如在本說明書和附加權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"和"所述的"包括復(fù)數(shù)含義，除非含量另有明確地規(guī)定。因此，例如，"載體"包括兩種或多種這樣的載體的混合物等。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"指任意可被遞送至靶細(xì)胞的基因，而不考慮轉(zhuǎn)基因的來源，在某些實(shí)施方案中包括已經(jīng)存在于靶細(xì)胞中內(nèi)源基因的另外的拷貝或序列變異體。轉(zhuǎn)基因可以是從任意生物體獲得的基因序列或部分基因序列、這種基因的遺傳工程變異體或合成的(非天然存在的)DNA序列。轉(zhuǎn)基因可由編碼蛋白質(zhì)或可編碼生物學(xué)活性RNA分子的信使RNAs直接生成，所述生物學(xué)活性RNA分子例如反義、核酶、形成三螺旋、RNAi或其它RNA序列。如本文使用的"可調(diào)型基因(regulatable)"為將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞的基因后，其表達(dá)可通過給藥誘導(dǎo)物改變。治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控提供了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物水平的藥理學(xué)控制。"表達(dá)盒(Expressioncassette)"指能夠指導(dǎo)感興趣的序列或基因表達(dá)的組件。表達(dá)盒包括其可操作地連接(以便于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)感興趣的序列或基因的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，通常也包括多聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在本文中描述的表達(dá)盒可包含在腺相關(guān)病毒構(gòu)建物內(nèi)。如本文用于描述核酸分子的"重組"指基因組的、cDNA、病毒、半合成的、或合成源的多核苷酸，根據(jù)其來源和操作，其與它天然組合的所有或部分多核苷酸無關(guān)。如使用的與蛋白質(zhì)多肽有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"重組"指通常表達(dá)重組多核苷酸產(chǎn)生的多肽，通常，克隆感興趣的基因，然后，在轉(zhuǎn)化的生物體內(nèi)表達(dá)，如下述進(jìn)一步描述的。宿主生物體表達(dá)能在表達(dá)條件下產(chǎn)生蛋白質(zhì)的外源基因。"編碼序列"或"編碼"選擇性多肽的序列是當(dāng)將其置于適宜的調(diào)控序列(或"控制元件")的控制之下時(shí)，在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄(在DNA情況下)和翻譯(在mRNA情況下)為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由位于5'(氨基)端的起始密碼子和位于3'(羧基)端的起始密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于來自病毒、原核生物或真核生物的mRNA的cDNA、來自病毒或原核生物或真核生物DNA的基因組DNA序列，甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)導(dǎo)終止序列位于編碼序列的3'位。典型的"控制元件"包括，但不限于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、聚腺苷酸化序列(位于翻譯終止密碼子的3')、用于最佳化翻譯啟動(dòng)的序列(位于編碼序列的5')和翻譯終止序列。術(shù)語(yǔ)"核酸"包括DNA和RNA，以及它們的類似物，例如包含改性的主鏈的那些(例如磷硫酰等)以及肽核斷PNA)等。本發(fā)明包括包含對(duì)如上所述序列互補(bǔ)的序列的核酸(例如用于反義或探測(cè)目的)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"指細(xì)胞吸收外來的DNA，當(dāng)將外源的DNA進(jìn)入到細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞就被"轉(zhuǎn)染"了。在本領(lǐng)域，許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是眾所周知的。參見，例如，Graham等(1973)Virology,52:456,Sambrook等(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier,andChu等Gene13:197,1981。可以使用這些技術(shù)將一種或多種外源的DNA成分，例如質(zhì)粒載體和其他核酸分子，引入到適宜的宿主細(xì)胞中。該術(shù)語(yǔ)指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定和瞬間的吸收。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)導(dǎo)"表示通過諸如重組腺相關(guān)病毒載體的載體將DNA分子體內(nèi)或體外遞送到受體細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"異源(的)"當(dāng)其指核酸序列例如基因序列和控制序列時(shí)，表示在正常情況下沒有連接在一起和/或在正常情況下不與特定的細(xì)胞相聯(lián)系的序列。因而，核酸構(gòu)建體或載體的"異源(的)"區(qū)域?yàn)楹怂崞?，其在另一個(gè)核酸分子內(nèi)或附加于該核酸分子上，而在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)其與上述的另一個(gè)核酸分子相聯(lián)系。例如，核酸構(gòu)建體的異源區(qū)可以包括如下編碼序列在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)該編碼序列兩側(cè)的序列與其有聯(lián)系。異源編碼序列的另一個(gè)實(shí)例是如下的構(gòu)建體其中的編碼序列本身在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)(例如具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。類似地，為了本發(fā)明的目的，被正常情況下在細(xì)胞中不存在的構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將被認(rèn)為是異源的。如本文使用的，等位基因的變異或天然發(fā)生的突變事件并不產(chǎn)生異源的DNA。術(shù)語(yǔ)"控制元件"共同地指啟動(dòng)子區(qū)、多聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控結(jié)構(gòu)域、復(fù)制起點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)("IRES")、增強(qiáng)子等，它們共同地為受體細(xì)胞中的編碼序列提供復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。只要選擇的編碼序列能夠在適宜的受體細(xì)胞中被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，不必要存在所有這些控制元件。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子區(qū)域"其常規(guī)含義是指包括DNA調(diào)控序列的核苷酸區(qū)域，其中所述調(diào)控序列源自能夠結(jié)合核糖核酸聚合酶和啟動(dòng)下游的(3-方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的基因。"可操作地連接(Operablylinked)"指元件的排列，其中描述的所述組分構(gòu)型為能使它們發(fā)揮通常的功能。因此，與編碼序列可操作地連接的控制元件能影響編碼序列的表達(dá)?？刂圃⒉恍枰c編碼序列相鄰，只要它們有指導(dǎo)其表達(dá)的功能。因此，例如，不翻譯但轉(zhuǎn)錄的間隔序列可以存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，而啟動(dòng)子序列仍可以認(rèn)為是編碼序列"可操作地連接"。當(dāng)用于核苷酸序列時(shí)，"分離的"意思是表示該分子在組成型上沒有其它相同類型的生物學(xué)高分子下存在。因此，"分離的編碼特定多肽的核酸分子"指其組成型上不包含不能編碼目標(biāo)多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，該分子可包括某些不會(huì)有害地影響組合物組成型特征的其它基質(zhì)或部分。"載體"能夠?qū)⒑怂嵝蛄羞f送至靶細(xì)胞(例如病毒載體、非病毒載體、微粒載體和脂質(zhì)體)。典型地，"載體構(gòu)建物"、"表達(dá)載體"和"基因轉(zhuǎn)移載體"指任意能指導(dǎo)感興趣的核酸表達(dá)的核酸構(gòu)建物，并且，其可以遞送核酸序列至靶向細(xì)胞。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體以及病毒載體。"患者"指脊索動(dòng)物亞門的任一員動(dòng)物。本術(shù)語(yǔ)旨在涵蓋該亞門中的任一成員，包括但不限于人類和其他靈長(zhǎng)類例如猩猩和其它猿和猴子類；家畜例如牛、羊、豬、山羊和馬；別l養(yǎng)的哺乳動(dòng)物，例如狗和貓;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥，包括家禽、野生禽和獵禽，例如小雞、火雞及其它鵪雞類的鳥、鴨、鵝等。該術(shù)語(yǔ)并不表示特定的年齡。因此，成年及新生的個(gè)體均涵蓋于該術(shù)語(yǔ)中。編碼可調(diào)控型轉(zhuǎn)錄因子和/或轉(zhuǎn)基因的AAV載體的"治療有效劑量或數(shù)量"是指當(dāng)給藥如本文所述的AAV載體時(shí)，使發(fā)生陽(yáng)性治療反應(yīng)例如改善癥狀或預(yù)防神經(jīng)障礙發(fā)展的量。例如，給藥治療有效量的AAV載體，其引起治療劑(例如AADC、GDNF)在患者中表達(dá)用于治療帕金森氏癥，可改善癥狀，例如改善運(yùn)動(dòng)功能或減少靜止顫動(dòng)。需要的AAV載體的精確量將在患者間不同，取決于種類、年齡和患者的一般狀況、受治療的疾病的嚴(yán)重性和使用的特定組合物，給藥方式等。II.實(shí)施本發(fā)明的方式在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于特別的示例性分子或工藝參數(shù)，當(dāng)然，其是可改變的。也應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用的專用術(shù)語(yǔ)是僅僅用于描述本發(fā)明特定實(shí)施方案的目的，并不意味著限制本發(fā)明。而且，除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將使用病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法，所有這些方法都在本領(lǐng)域普通技術(shù)內(nèi)。這樣的技術(shù)為在文獻(xiàn)中充分說明的。參見，例如，Sambrook，etal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ndEdition,1989);DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.);OligonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,1984);APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);andFundamentalVirology,2ndEdition,vol.I&II(B.N.FieldsandD.M.Knipe,eds.)。盡管那些本文描述的許多方法和類物質(zhì)或等效物可被用于實(shí)施本發(fā)明，優(yōu)選的物質(zhì)和方法為本文描述的。本發(fā)明提供用于調(diào)控靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的載體構(gòu)建物、方法和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，在大量分離的重組AAV載體分子上提供用于轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞中可調(diào)控型基因所必需的序列。實(shí)施例1和2證實(shí)了本發(fā)明的雙載體實(shí)施方案的構(gòu)建和用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單重組載體載有用于轉(zhuǎn)導(dǎo)耙細(xì)胞中可調(diào)控型基因所必需的所有序列。實(shí)施例3證實(shí)了本發(fā)明的一種這樣的單載體實(shí)施方案的構(gòu)建和用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，將可調(diào)形式的AADC基因遞送至靶細(xì)胞。實(shí)施例1和2證實(shí)了可調(diào)形式的AADC基因的遞送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將可調(diào)形式的GDNF基因遞送至靶細(xì)胞。實(shí)施例3證實(shí)了可調(diào)形式的GDNF基因的遞送。如本文使用的術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因指任意可被遞送至靶細(xì)胞的基因，而不考慮轉(zhuǎn)基因的來源，在某些實(shí)施方案中，包括已經(jīng)存在于靶細(xì)胞中內(nèi)源基因的另外的拷貝或序列變異體。轉(zhuǎn)基因可以是從任意生物體獲得的基因序列或部分基因序列、這種基因的遺傳工程變異體或合成的(非天然存在的)DNA序列。轉(zhuǎn)基因可由編碼蛋白質(zhì)可編碼生物學(xué)活性RNA分子的信使RNAs直接生成，所述生物學(xué)活性RNA分子例如反義、核酶、形成三螺旋、RNAi或其它RNA序列。如本文使用的可調(diào)控型基因?yàn)閷⒒蜣D(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞的基因后，其表達(dá)可通過給藥誘導(dǎo)物改變?nèi)?。治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控提供了對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物水平的藥理學(xué)控制。在優(yōu)選的實(shí)施方案，誘導(dǎo)物為小分子藥物。一種這樣的小分子藥物是雷帕霉素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)利用了在存在雷帕霉素或AP21967(—種非免疫抑制性雷帕霉素類似物)的情況下，親免素FKBP和脂質(zhì)激酶同系物FRAP的特異性二聚作用，產(chǎn)生了特異性活化誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。Rivera等(1996)Nat.Med.，2:1028-32.AP21967的結(jié)構(gòu)提供如下插入第22頁(yè)圖AP21967(分子量1017.4Da)為在美國(guó)專利No,6,649,595('595專利)中的化合物69的7-甲基吲哚基類似物，其可如在其實(shí)施例5中描述的通過用7-甲基吲哚取代二甲氧基苯制備。AP21967為'595專利中的化合物71相似，不同在于AP21967在吲哚環(huán)上具有7-甲基。在不背離本發(fā)明的范圍下，也可以使用其它的雷帕霉素類似物。那些不會(huì)與患者中內(nèi)源性FRAP相互作用的雷帕霉素類似物不會(huì)具有可能雷帕霉素的可能不想要的免疫抑制和細(xì)胞周期抑制作用。Pollock等(2000)Prac.A/a〃./AcadSc/.L/S/A97:"/3227-26.也可以建立FRAP的突變體形式，其保持結(jié)合這些非免疫抑制性雷帕霉素類似物的能力，可用于二聚物系統(tǒng)的活化結(jié)構(gòu)域融合蛋白的FRB部分。參見，例如，Pollock等(2000)./MDC游^7W經(jīng)，這在HeLaD7-4細(xì)胞體外和在帕金森氏癥(PD)的嚙齒類模型體內(nèi)，進(jìn)行使用AAV載體介導(dǎo)的雷帕霉素依賴的AADC轉(zhuǎn)基因的調(diào)控表達(dá)實(shí)驗(yàn)。人類AADC(hAADC)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是通過二聚物雷帕霉素利用在實(shí)施例1和圖1A和舊中進(jìn)一步描述的載體的功能化轉(zhuǎn)錄因子(TF)的重建進(jìn)行的。轉(zhuǎn)錄因子AAV載體被用于遞送轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域，表達(dá)AAV載體被用于在可調(diào)控啟動(dòng)子的控制下遞送hAADC轉(zhuǎn)基因。在實(shí)施例1中描述了證實(shí)二聚物依賴的AADC在體外人類細(xì)胞中表達(dá)的試驗(yàn)。在實(shí)施例1中使用的二聚物AP21967為非免疫抑制性雷帕霉素類似物，其具有比雷帕霉素小約3倍的功效。結(jié)果顯示在圖2中，其中右側(cè)大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示出在用編碼二聚物依賴的轉(zhuǎn)錄因子(AAV-CMV-TF)的載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中雷帕霉素劑量依賴的hAADC表達(dá)(來自AAV-Z12-hAADC)。ELISA數(shù)據(jù)顯示出在存在25nMAP21967下，AADC表達(dá)比不存在二聚物下高9倍。25nM為AP21967的最大有效濃度，給予了高峰水平的體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在25nMAP21967下，來自可調(diào)啟動(dòng)子的hAADC表達(dá)大概是來自組成型的CMV啟動(dòng)子(AAV-CMV-hAADC2)控制下的hAADC水平的一半(圖1C，禾nSanftner等(2004)在Mol.Ther.9:403-9中描述的)。在不存在AP21967下，即系統(tǒng)沒有"滲漏(leaky)"下，載有兩種載體(AAV-Z12-hAADC和AAV-CMV-TF)的細(xì)胞僅顯示出低水平的AADC產(chǎn)生。沒有滲漏(leakiness)可能對(duì)于保證轉(zhuǎn)基因可全部地終止(如果有必要的話)和提供大量藥理學(xué)調(diào)控是重要的。/WOC鮮片微如在實(shí)施例2中描述，在帕金森氏癥的6-羥基多巴胺(6-OHDA)大鼠模型、紋狀體去神經(jīng)的外科模型體內(nèi)測(cè)定用于體外證實(shí)二聚物調(diào)控的hAADC的AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1A和舊)相同的載體。治療方案按圖式顯示在圖3中。用AAV-CMV-TF和AAV-Z12-hAADC轉(zhuǎn)導(dǎo)帕金森氏病的大鼠，然后如圖4所示，在用一系列雷帕霉素處理后，測(cè)定其旋轉(zhuǎn)行為。與將AP21967用于體外不同，將雷帕霉素用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，僅僅是因?yàn)橹皽y(cè)定了雷帕霉素的適宜劑量。二聚物雷帕霉素具有許多用于作為人類基因治療誘導(dǎo)物的有利性質(zhì)，但是其固有的免疫抑制性質(zhì)限制了其用途。雷帕霉素的非免疫抑制性類似物，例如AP21967，可以為轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)選誘導(dǎo)物，特別是在治療人類患者中。在動(dòng)物和人類患者體內(nèi)，AP21967的適宜劑量可通過標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法測(cè)定，包括臨床試驗(yàn)。在產(chǎn)生顯著性水平多巴胺的6-OHDA損害的大鼠中，調(diào)控的hAADC載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)與左旋多巴和雷帕霉素的給藥一起產(chǎn)生了行為影響。如在圖4中圖解的，用雷帕霉素處理可逆地增加了損害的紋狀體中hAADC的表達(dá)，如通過對(duì)5mg/kg左旋多巴改變的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答證實(shí)的，其在載體灌注的(+)rap組中當(dāng)雷帕霉素撤出后是可逆的。在用雷帕霉素處理后第3、5和7周，載體灌注的(+)雷帕霉素組對(duì)左旋多巴的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答顯著地高于載體灌注的(-)雷帕霉素組和賦形劑灌注的對(duì)照組(P<0.001)，但是在第4和6周，又返回至接近對(duì)照組。這些數(shù)據(jù)證實(shí)在的哺乳動(dòng)物大腦體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因的hAADC表達(dá)的可逆調(diào)控，可以影響行為表現(xiàn)型。實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)在載體灌注的(+)雷帕霉素組和載體灌注的(-)雷帕霉素組中的大鼠被hAADC基因的相等數(shù)量的拷貝轉(zhuǎn)導(dǎo)，消除了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差別可作為用于在兩個(gè)組中觀察到的不同結(jié)果的解釋。在研究終點(diǎn)進(jìn)行的免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)(表1和圖5、6和7)證實(shí)了行為的結(jié)果，如在下述詳細(xì)討論的。圖5A證實(shí)了在來自載體灌注的(+)雷帕霉素組的大鼠紋狀體的中型多棘神經(jīng)元中(mediumspinyneurons),對(duì)AADC的強(qiáng)免疫組織化學(xué)染色，和因此有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。而圖5B顯示了在來自載體灌注的(-)雷帕霉素組的大鼠中僅非常低水平的AADC表達(dá)。圖6A-6C呈現(xiàn)了用于AADC的整個(gè)包埋大腦部分免疫組織化學(xué)染色的低分辨率圖像。結(jié)果給出了在來自載體灌注的(+)雷帕霉素組(圖6A)的大鼠的左側(cè)(處理的)大腦半球中和與來自載體灌注的(-)雷帕霉素組(圖6B)的大鼠的左側(cè)(處理的)大腦半球中AADC比較的顯著高水平表達(dá)的簡(jiǎn)單目視判定。來自載體灌注的(-)雷帕霉素組的動(dòng)物中的結(jié)果與對(duì)照的賦形劑賦形劑-灌注的動(dòng)物的結(jié)果類似(圖6C)。免疫組織化學(xué)的體視學(xué)分析證實(shí)當(dāng)載體與雷帕霉素一起給藥時(shí)，通過陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定的表達(dá)水平顯著地增加了。表1列出了轉(zhuǎn)基因衍生的免疫染色的結(jié)果和通過定量體視學(xué)法對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的動(dòng)物估計(jì)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。與未誘導(dǎo)的動(dòng)物相比，雷帕霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物顯示出約兩倍的AADC免疫染色的之前或之后涂敷、AADC免疫染色的涂敷體積和AADC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。總蛋白分析顯示蛋白質(zhì)水平甚至更大的差異。如圖7所示，與(-)雷帕霉素組相比，在(+)雷帕霉素組中，在紋狀體蛋白質(zhì)樣品凝膠電泳后，hAADC酶水平蛋白質(zhì)印跡分析顯示出顯著較高的hAADC表達(dá)。當(dāng)內(nèi)源性AADC表達(dá)被從圖7中繪制的數(shù)據(jù)中減去時(shí)，與(+)雷帕霉素組相比，(-)雷帕霉素組中的hAADC的水平下降88%。在實(shí)施例2中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hAADC基因表達(dá)受到二聚物雷帕霉素誘導(dǎo)，盡管在未誘導(dǎo)的動(dòng)物中觀察到低水平的表達(dá)表明在調(diào)控系統(tǒng)體內(nèi)有某些"滲漏"。系統(tǒng)的滲漏理由是不清楚的，不打算受到理論的限制，其可能是由在不存在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子下來自最小的IL-2啟動(dòng)子的未調(diào)控的表達(dá)引起。然而，在沒有誘導(dǎo)下觀察到的低水平hAADC不足以引出對(duì)亞治療劑量(sub-therapeutic)的左旋多巴的行為應(yīng)答，其表明在不存在誘導(dǎo)劑的情況下由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子產(chǎn)生的少量基因表達(dá)對(duì)于特定的應(yīng)用是可容忍的。用于影響想要水平的轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的雷帕霉素(或類似物)的適宜劑量可通過在不同病例(case-by-casebasis)的基礎(chǔ)進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，如通常使用治療協(xié)議書。劑量可基于表型測(cè)定結(jié)果或代用品標(biāo)記物通過反復(fù)試驗(yàn)來調(diào)試。也可調(diào)控劑量以在靶組織中或在患者的血液中獲得雷帕霉素的預(yù)定目標(biāo)濃度。當(dāng)通過靜脈注射引入時(shí)，示例性的劑量可以為0.01至50mg/kg，優(yōu)選0.1至10mg/kg，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在治療人類患者的情況下，劑量可參考臨床試驗(yàn)的產(chǎn)生或從動(dòng)物數(shù)據(jù)推斷來確定?？梢杂猛饪剖中g(shù)將重組AAV載體引入腦中不同的位點(diǎn)，取決于遞送的轉(zhuǎn)基因、其作用機(jī)理和目的的耙細(xì)胞。例如，基底神經(jīng)節(jié)為定位于皮層下的一組神經(jīng)元。它們包括尾狀殼核、殼核和蒼白球。尾狀殼核和殼核一起形成紋狀體(或簡(jiǎn)單的紋狀體)。尾狀核和殼核與黑質(zhì)相互地連接，所述黑質(zhì)包括黑質(zhì)密部(SNpc)和黑質(zhì)網(wǎng)質(zhì)部。SNpc為多巴胺生物合成的正常位點(diǎn)，SNpc的退化為PD的標(biāo)志。通過用編碼多巴胺生物合成途徑中的酶的基因例如AADC轉(zhuǎn)導(dǎo)紋狀體的殼核或尾狀殼核的神經(jīng)元，可以恢復(fù)多巴胺合成，從而克服SNpc網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的功能性減少。Corpus紋狀體細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，立體定位注射為一種由神經(jīng)外科醫(yī)師給藥至CNS的各種化合物使用的常見外科手術(shù)方法。也可以使用直接注射；如果使用該方法，可由外科醫(yī)生使用源自CT、PET或MRI掃描的解剖學(xué)圖像來幫助選擇注射的位點(diǎn)。其它的方法，包括對(duì)流增加(sub-therapeutic)的遞送(詳細(xì)描述在美國(guó)專利No.6,309,634中，將其全部引入作為參考)，可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中以將rAAV病毒體遞送至CNS。在實(shí)施例1和2中描述的實(shí)驗(yàn)包括本發(fā)明的雙載體實(shí)施方案，其中分離載體被用于遞送轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白和轉(zhuǎn)基因。在其它的實(shí)施方案，使用不同的基因代替表達(dá)載體中的hAADC。可將最大量為約5000-5200的核苷酸(nt)包裝在AAV病毒體中，約4500nt是最佳的。Dong等(1996)〃■Gene7T7er7:2101-12.給予rAAV表達(dá)載體其它需要的序列成分如在圖1B中圖解的一種(例如ITR區(qū)域、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列等)，表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)基因序列都可短于約2500個(gè)核苷酸(nt)。在該大小的限定內(nèi)，任意想要的轉(zhuǎn)基因都可以使用本發(fā)明雙載體實(shí)施方案的rAAV表達(dá)載體構(gòu)建物遞送。具有較短的ITR、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的最優(yōu)的表達(dá)載體變異體可以構(gòu)建為能遞送較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因序列。實(shí)施例1和2的結(jié)果證實(shí)在培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞中和在大鼠體內(nèi)神經(jīng)元中，可使用本發(fā)明雙載體rAAV介導(dǎo)的實(shí)施方案調(diào)控二聚物依賴的hAADC轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。卓載體系統(tǒng)^游GDAF源犮如在實(shí)施例3中描述的，實(shí)驗(yàn)是利用本發(fā)明的單載體實(shí)施方案進(jìn)行的，其中單rAAV載體是用于表達(dá)GDNF轉(zhuǎn)基因表達(dá)的二聚物依賴的調(diào)控所必需的所有蛋白質(zhì)。在圖8A中提供了調(diào)控的rAAVhGDNF表達(dá)載體的圖，在如圖8C中提供了具有組成型的(未調(diào)控的)hGDNF表達(dá)的對(duì)照載體的圖。(圖8B顯示用于調(diào)控GDNF表達(dá)載體的另一種方案，其沒有在實(shí)施例3中使用)。質(zhì)粒載體被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外HEK-293細(xì)胞。然后，用包含0、5或25nM的雷帕霉素的介質(zhì)處理細(xì)胞。在圖9中出現(xiàn)轉(zhuǎn)染3天后，進(jìn)行GDNFELISAs的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示出在用調(diào)控的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的GDNF雷帕霉素劑量應(yīng)答性表達(dá)("TF-GDNF質(zhì)粒構(gòu)建"，其指pAAV-TF-Z8-hGDNF),觀察到的表達(dá)最大量為來自組成型表達(dá)的GDNF的表達(dá)水平的約四分之一("CMV-GDNF質(zhì)粒"其指pAAV-CMV-hGDNF)。來自pCMV-GDNF的GDNF表達(dá)不會(huì)因加入雷帕霉素而增加。在實(shí)施例3中描述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)可構(gòu)建單個(gè)載體可調(diào)AAV-GDNF構(gòu)建物，其中在培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞中，GDNF表達(dá)可通過加入小分子誘導(dǎo)物雷帕霉素來調(diào)控。結(jié)果表明在患者體內(nèi)，GDNF的表達(dá)也可利用可調(diào)AAV-GDNF載體來調(diào)控。實(shí)施例3的單載體執(zhí)行(fills)在上述討論的雙載體實(shí)施方案中的轉(zhuǎn)錄因子載體和表達(dá)載體兩者的功能(rolls)。與需要用兩種載體共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的雙載體法相比，用單載體治療具有僅僅需要將一種轉(zhuǎn)導(dǎo)事件引入可調(diào)控GDNF的優(yōu)點(diǎn)。單載體實(shí)施方案的這一優(yōu)點(diǎn)對(duì)于那些僅獲得低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法特別重要,所述方法例如基因治療說明書第19/34頁(yè)方法，其中用兩種載體預(yù)期同時(shí)僅能非常小比例的轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時(shí)。例如，假定轉(zhuǎn)導(dǎo)功效是獨(dú)立的，如果對(duì)于每種載體總的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率各自為5%，則用兩種載體僅僅轉(zhuǎn)導(dǎo)0.25%的細(xì)胞。因?yàn)榘b在AAV病毒體中的載體不能長(zhǎng)于約5000-5200核苷酸(nt)，所以，單載體可調(diào)構(gòu)建物將實(shí)際上僅僅遞送相對(duì)短的轉(zhuǎn)基因。例如，使用在圖8A中圖解的特定選擇的轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白和rAAV載體中使用的調(diào)控的元件(如在實(shí)施例3中使用的)，轉(zhuǎn)基因(GDNF)序列為約600nt長(zhǎng)。有可能的是較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因序列，例如達(dá)850或者甚至1000nt的，可使用最優(yōu)的單載體可調(diào)控AAV構(gòu)建物遞送，其中所述構(gòu)建物具有更有效排列的序列成分，其中多余的核苷酸被從融合蛋白和調(diào)控的成分中清除。在用于AAV包裝的限制尺寸內(nèi)，任意想要的轉(zhuǎn)基因都可使用本發(fā)明的單載體構(gòu)建物來遞送。轉(zhuǎn)基因可包括想要的基因的活性亞片段，而不是全長(zhǎng)的基因，以有利于單載體遞送。需要獲得特定治療效果的rAAV病毒體的劑量，例如在載體基因組/每公斤體重中的劑量單元(vg/kg)，可取決于某些因素，包括但不限于rAAV病毒體的給藥途徑、需要獲得治療效果的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平和異源基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述的因素以及本領(lǐng)域眾所周知的其它因素確定用于治療患有特定的疾病或障礙的患者的rAAV病毒體劑量范圍。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于影響哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAV的適宜劑量可以為1X108vg/kg至1XI015vg/kg，優(yōu)選4XI09vg/kg至4XI012vg/kg，盡管可通過試驗(yàn)確定應(yīng)用的更高或更低的劑量。盡管AADC和GDNF存在于如在本發(fā)明實(shí)施例中的示例性的轉(zhuǎn)基因中，用于遞送的特異性轉(zhuǎn)基因并不是本發(fā)明限定的方面。使用本發(fā)明的載體、方法和試劑盒可將可預(yù)期提供有益的(例如治療的)有效果的其它基因或基因的部分引入到腦中，前提是所述序列足夠短以適合可以包裝進(jìn)入AAV病毒體的AAV載體構(gòu)建物。如上討論的AADC(OMIM107930,EC4.1.1.28'GenbankAccessionNo.M76180)為參與多巴胺生物合成的轉(zhuǎn)基因。參與多巴胺生物合成的其它潛在基因?yàn)槔野彼崃u化酶(TH)(OMIM191290，EC1.14.16.2,GenbankAccessionNo.X05290)和鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶I(GCH)(OMM600225，EC3.5.4.16，GenbankAccessionNo.NM—000161)。仍然其它潛在的轉(zhuǎn)基因包括祌經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括GDNF(OMIM600837,GenbankAccessionNo,AX713049,L19063)和其它GDNF蛋白質(zhì)家族的成員，例如artemin(OMIM603886，GenbankAccessionNo.AF109401)、neurturin(OMM602018，GenbankAccessionNo.HSU78110)禾口persephin(OMIM602921，GenbankAccessionNo.AF040962.)。Saarma等(1999)Mcroscopyfes.Tec/7.45:292-302。還有其它的轉(zhuǎn)基因包括IL-10(OMIM124092，GenbankAccessionNo.M57627).OMIM數(shù)字指由JohnsHopkinsUniversity維護(hù)的在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OnlineMendelianInheritanceinMandatabase)，可通過網(wǎng)址在www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez的NationalLibraryofMedicine從因牛寺網(wǎng)上獲得。因此，將本文中引用的所有的OMM條目的內(nèi)容和通過登記號(hào)碼引用的序列以其全部?jī)?nèi)容引入作為參考。提供Genbank登記號(hào)僅僅用于代表完整的cDNA序列，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。特別地，潛在的轉(zhuǎn)基因包括在Genbank中的基因報(bào)道的其它序列、天然基因的全長(zhǎng)和亞片段、來自其它種類的同源基因、這些序列的等位基因變異體和天然存在的或人工建立的基因的突變體形式。轉(zhuǎn)基因也包括用于治療其它神經(jīng)變性疾病的基因，所述神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默病、亨廷頓氏疾病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、多發(fā)性硬化癥、卡納萬(wàn)病、大腦局部缺血、進(jìn)行性核上性麻痹、路易體癡呆、希-德綜合征、ADDS癡呆綜合癥、特發(fā)性震顫、張力障礙、皮質(zhì)基底節(jié)變性、多系統(tǒng)萎縮癥和視網(wǎng)膜變性(例如黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、色素性視網(wǎng)膜炎、青光眼)。誘導(dǎo)物優(yōu)選為選自可被遞送至人類患者而沒有顯著毒性或副作用的那些化合物。在用于治療神經(jīng)病或其它CNS疾病的優(yōu)選實(shí)施方案中，誘導(dǎo)物能穿過血腦屏障。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)物為二聚物，例如雷帕霉素或其非免疫抑制類似物。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)物以腸胃外遞送，例如皮下用、肌肉、眼內(nèi)或靜脈注射。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)物為可相對(duì)方便地遞送的一種，所述方便地遞送例如口服、局部、通過鼻腔遞送(鼻腔噴霧劑)、通過氣霧劑/肺部遞送(吸入器)、通過眼部遞送(滴眼劑))或通過任意其它方便的遞送方式。誘導(dǎo)物也可以使用透皮貼劑、皮下用植入物、可植入滲透小型泵、機(jī)械性輸液泵或控釋藥物組合物連續(xù)地或半連續(xù)地遞送。根據(jù)本發(fā)明的rAAV載體的原種可以使用本領(lǐng)域用于AAV病毒體產(chǎn)生的某些已知的方法制備。在三重轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的情況下中，野生型AAV和輔助病毒可用于提供用于產(chǎn)生rAAV病毒體必需的復(fù)制功能，或者質(zhì)?？杀挥糜谔峁┹o助功能基因(例如pHLP19)、附屬功能基因(例如pladeno5)或者兩種。參見，例如，美國(guó)專利Nos.5,139,941;5,622,856;6,001,650和6,004，797，在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。對(duì)于體內(nèi)遞送而言，rAAV病毒體被制劑成包括適宜劑量的一種或多種rAAV病毒體和可藥用賦形劑的藥物組合物。這樣的賦形劑包括本身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接收所述組合物的個(gè)體有害的抗體的任何藥劑，并且其可以給藥而沒有異常毒性?？伤幱觅x形劑包括，但不限于液體例如水、生理鹽水、甘油和乙醇?？伤幱名}可以包括在其中，例如無機(jī)酸鹽例如鹽酸化物、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機(jī)酸鹽例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。另外，輔助物質(zhì)例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等，可存在于這樣的載體中?？伤幱觅x形劑的詳細(xì)討論可在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.,N丄1991)中獲得。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的rAAV病毒體可以以包括如下特征的賦形劑的藥物組合物提供所述賦形劑增加了延期儲(chǔ)存期間和重復(fù)暴露于冷凍-融化周期的病毒穩(wěn)定性，而且減少了載體粘著在灌注裝置上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，賦形劑在靶組織例如CNS中顯示出低毒性。例如，病毒體可以儲(chǔ)存和提供在包括普流尼克F-68的緩沖劑(BASFCorp.,MountOlive,NJ)中，含量為0.01%至0.0001%，優(yōu)選0.001%。另外的組合物和賦形劑為在美國(guó)專利Nos.6,759,050和6,764,845中描述的，在本文中將其中公開的內(nèi)容以其全部引入作為參考。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于構(gòu)建用于轉(zhuǎn)基因可調(diào)控型表達(dá)的AAV載體的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，將與在圖1A和舊或圖8A或8B中顯示的基本上相同的一種或多種載體包括在該試劑盒中。在其它實(shí)施方案中，與在圖1B、8A或8B中顯示的類似的載體被包括在這樣的試劑盒中，不同在于用方便的克隆序列例如聚合接頭代替AADC和GDNF編碼序列。與在FIG.1B中顯示的那些類似的表達(dá)載體可用于該雙載體方法中，而與在圖8A和8B中顯示的那些類似的載體可用于本發(fā)明的單載體方法中。本發(fā)明試劑盒的使用者可克隆感興趣的基因或基因片段進(jìn)入表達(dá)載體，然后，制備用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAV病毒體。用于在雙載體法中使用的包括表達(dá)載體的試劑盒也可包括基本上類似于在圖1A中顯示的那些的轉(zhuǎn)錄因子載體。試劑盒可任選地包括雷帕霉素或其類似物。試劑盒也可任選地包括用于制備rAAV病毒體原種的質(zhì)粒，例如質(zhì)粒pHLP19和pladeno5，如在美國(guó)專利Nos.6,001,650和6,004,797中更充分描述的。試劑盒也可包含使用說明書。在某些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的基因治療載體、方法和試劑盒給藥受到疾病例如帕金森氏癥困擾的患者，以提供治療效果。一般而言，"治療效果"指足以使疾病(或障礙)的組分朝著想要的結(jié)果或臨床終點(diǎn)改變的一種或多種轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平，如此使得患者的疾病或障礙顯示臨床改善，通常通過有關(guān)疾病或障礙的臨床征象或癥狀的改善來反映，在帕金森氏癥的情況下，治療效果可以是顯示的運(yùn)動(dòng)功能的改善(例如健康的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)(finemotortasking),例如，通過手靈巧度的改善。另外，休息性震顫的減少也可以為PD改善的信號(hào)。對(duì)于PD的特別治療，存在某些其它用于確定治療效果(即療效)的領(lǐng)域公認(rèn)的可觀察的和可測(cè)定的終點(diǎn)。在顯示出PD臨床征兆和癥狀的人類患者中，臨床醫(yī)師通常依靠熟知的統(tǒng)一的帕金森氏癥等級(jí)評(píng)定量表(UnifiedParkinson'sDiseaseRatingScale)(UPDRS)來評(píng)價(jià)疾病的嚴(yán)重性以及測(cè)定特定治療模式的治療效果。類似于UPDRS系統(tǒng)，科學(xué)家利用靈長(zhǎng)類帕金森氏癥等級(jí)評(píng)定量表(PrimateParkinsonismRatingScale)(PPRS'也稱為臨床等級(jí)評(píng)定量表(ClinicalRatingScore-CRS))評(píng)價(jià)PD的靈長(zhǎng)類模型中的PD特征，其與其它特征一起測(cè)定健康的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、休息性震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩、運(yùn)動(dòng)減少和肌強(qiáng)直。所述PPRS系統(tǒng)描述在Langston等(2000)>Am.Atewra/.47:S79-89中。III.試驗(yàn)下述為實(shí)施本發(fā)明的特定實(shí)施方案的實(shí)施例。實(shí)施例僅僅用于提供說明性的目的，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。關(guān)于使用的數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)，盡管進(jìn)行了努力以確保精度，但是某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差當(dāng)然應(yīng)當(dāng)是可允許的。實(shí)施例1AADC的體外可調(diào)控表達(dá)AADC轉(zhuǎn)基因的體外調(diào)節(jié)是按照下述獲得的泰沐為了獲得hAADC:AAV-CMV-TF和AAV-Z12-hAADC的二聚物依賴的表達(dá)，構(gòu)建兩種載體。圖1A為AAV-CMV-TF的圖，其中巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的雙順反子信息的表達(dá)。激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白包含人類FRAP雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(FRB*)，其融合至源自NFkB的(p65)轉(zhuǎn)錄激活域。當(dāng)與野生型FRB序列相比時(shí)，在該實(shí)施方案中使用的特定FRB結(jié)構(gòu)域(FRBT2098L)和在圖IA中圖解的特定FRB域(FRB*)在2098位載有T至L突變。Pollock等(2000)Prac.A/af/.Acacf.Sc/USA97:"227-26。FRBT2098L可利用AP21967或者雷帕霉素二聚化至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)為源自腦心肌炎病毒。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白包含來自人類轉(zhuǎn)錄因子Zif268的兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、源自O(shè)ct-1(ZFHDI)的同源結(jié)構(gòu)域和三個(gè)來自FK506(3xFKBP)的胞質(zhì)受體的藥物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。圖舊為AAV-Z12-hAADC的圖，其中人類AADC(hAADC)的表達(dá)受到12個(gè)融合至最小IL-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位的控制。還顯示了AAV2術(shù)端反向重復(fù)(ITR)、hAADC編碼序列(hAADC)和人生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化(pA)。斜趙分析如下進(jìn)行調(diào)節(jié)hAADC基因表達(dá)的能力的試驗(yàn)在體外通過用1:1比例的AAV-CMVTF和AAV-Z12-hAADC共轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLaD7-4細(xì)胞，隨后用0、5或25nM的雷帕霉素類似物AP21967(ARIADPharmaceuticals,Inc.,CambridgeMassachusetts)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示在圖2中，其包括各個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，包括非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、用轉(zhuǎn)錄因子載體單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(AAV-CMV-TF)、用組成型(constitutively)表達(dá)hAADC的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(AAV-CMV-hAADC2)和用調(diào)節(jié)的hAADC載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(AAV-Z12-hAADC)，但不包括轉(zhuǎn)錄因子載體。有關(guān)在實(shí)施例1中使用的試驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如下載,/鍵AAV-CMV-TF為以前描述的(AAV-CMV-TF1Nc,Auricchio等(2002)Mol.Ther.6:238-42)。AAV-Z12-hAADC為通過用包含位于最小IL-2啟動(dòng)子上游的ZFHDIDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域12個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Z12-IL2-SEAP區(qū)域(Rivera等(1996)A/af./Wed2:1028-32)替換pAAV-hAADC的CMV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子來制備(Sanftner等(2004)Mo/.TTer.9:403-9)。置纖,游產(chǎn)主重組AAV載體(血清型2)為通過三次轉(zhuǎn)染HEK-293(ATCCAccessionNo.CRL1573)細(xì)胞和通過CsCI密度梯度離心產(chǎn)生的。Grimm等(2003)S/oocf102:2412-9。簡(jiǎn)言之，微流化包含rAAV的細(xì)胞收獲物，通過0.2um的過濾器過濾。將載體通過CsCI密度梯度離心從凈化的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中純化，通過超濾濃縮，滲濾進(jìn)入包含5%山梨醇、pH7.4(PBS-山梨醇)的磷酸緩沖鹽水中，加入0.001%普流尼克(pluronic)F-68(BASFCorp.,MountOlive,NJ)以防止載體在遞送導(dǎo)管中的損失。通過SDS-PAGE評(píng)價(jià)載體純度。將在這項(xiàng)研究中使用的純化的rAAV載體通過SDS-PAGE凝膠的銀染色，其基本上僅僅顯示出VPI、VP2和VP3。滴度為通過Q-PCR分析載體基因組確定。表達(dá)ELISA利用抗hAADC抗體測(cè)定hAADC蛋白質(zhì)在透化的HeLaD7-4細(xì)胞中的表達(dá)。用rAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLaD7-4細(xì)胞，并且用三種不同劑量的AP21967(0、5、25nM)處理。每組n=3。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時(shí)，將細(xì)胞種在96孔平皿中。用在100pI的完全培養(yǎng)基中的104vg/細(xì)胞(當(dāng)使用多個(gè)載體時(shí)，為每個(gè)載體的)的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行ELISA。簡(jiǎn)言之，抽出介質(zhì)，用PBS洗滌細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，在室溫下培養(yǎng)20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，同時(shí)振搖，用阻斷緩沖劑(3%山羊血清、0.5。/。TritonX-100的PBS溶液)阻斷，然后在室溫下培養(yǎng)60分鐘，同時(shí)振搖。將一抗(AB136兔子抗hAADC，Chemicon,1:1000)稀釋在洗滌緩沖劑(1。/。山羊血清，0.5。/。Tritonx100的PBS溶液)中，在室溫下在搖床中培養(yǎng)60分鐘。用洗滌緩沖劑洗滌平皿，在室溫下，將二抗(山羊抗兔子IgG-AP(VectorLabs,Burlingame，California)，1:1000的洗滌緩沖劑溶液)在搖床上培養(yǎng)30分鐘。用洗滌緩沖劑洗滌平皿。加入基質(zhì)溶液[IX對(duì)-硝基苯基磷酸酯，IX左旋咪唑(淬滅劑)，基質(zhì)緩沖劑(100mMNaHC03，pH10.0)(VectorLabs,Burlingame,California)],在室溫下培養(yǎng)平皿30-60分鐘，然后在00405下于平皿讀數(shù)器中讀數(shù)。得自該hAADC表達(dá)ELISA的數(shù)據(jù)報(bào)告為在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中測(cè)定的相對(duì)光密度，將其與對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的AAV-CMV-hAADC2的參考點(diǎn)(referencelots)的劑量反應(yīng)曲線相比較。實(shí)施例2AADC體內(nèi)的可調(diào)型表達(dá)也在帕金森氏癥的6-羥基多巴胺(6-OHDA)大鼠模型的體內(nèi)測(cè)定與用于體外證實(shí)二聚物調(diào)節(jié)的hAADC的AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(實(shí)施例1、圖IA和舊)相同的載體，如下。在實(shí)施例2中，使用雷帕霉素代替AP21667作為二聚物，因?yàn)槠渚哂休^高的效價(jià)和已知的藥代動(dòng)力學(xué)。在體內(nèi)，雷帕霉素具有約10小時(shí)的半衰期，可快速清除。Gallant隱Haidner等(20(D0)7T7er。ayg/Wo:/f.22:31-5。在該實(shí)施例中使用的所有大鼠為在左側(cè)單側(cè)6-OHDA損害的。有三個(gè)試驗(yàn)組賦形劑灌注對(duì)照組(賦形劑灌注(+)雷帕霉素處理)，載體灌注(-)雷帕霉素處理對(duì)照組和載體灌注(+)雷帕霉素處理組。載體灌注(-)雷帕霉素組起在不存在雷帕霉素下控制hAADC基因表達(dá)的作用，即，用于測(cè)定系統(tǒng)是否滲漏。將AAV-CMV-TF和AAV-Z12-hAADC(每組3x10"病毒基因組(vg))的1:1混合物同側(cè)灌注給單側(cè)6-羥基多巴胺(6-OHDA満害的大鼠。將單獨(dú)的賦形劑注入賦形劑灌注對(duì)照組。在指定的時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)由腹膜內(nèi)注射雷帕霉素完成轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)，如下討論的。圖3顯示了在該實(shí)施例中描述的試驗(yàn)的試驗(yàn)性時(shí)間線。在rAAV處理前，對(duì)所有組進(jìn)行給藥左旋多巴(5mg/kg)的基準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。在第0天將載體或賦形劑灌注到紋狀體內(nèi)。在第17天，用雷帕霉素誘導(dǎo)大鼠或者用稀釋劑處理大鼠。誘導(dǎo)包括IP注射10mg/kg/天的雷帕霉素連續(xù)四天(給藥雷帕霉素連續(xù)4天是為了最大地確保在腦中的循環(huán)(circulating)水平)。在圖4中的箭頭指出了四天雷帕霉素誘導(dǎo)的開始。在第21天，再次測(cè)試大鼠對(duì)5mg/kg左旋多巴的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答。使大鼠從雷帕霉素中恢復(fù)1周，然后，在第28天測(cè)試應(yīng)答。在第31天再次誘導(dǎo)大鼠，在第35天測(cè)試旋轉(zhuǎn)應(yīng)答。在從雷帕霉素中恢復(fù)1周后，在第42天重復(fù)旋轉(zhuǎn)測(cè)試。在第45天，大鼠接受第三次和最后一次誘導(dǎo)過程，隨后，在第49天進(jìn)行最后的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。在該時(shí)間點(diǎn)，在它們誘導(dǎo)(+雷帕霉素)的狀態(tài)下，對(duì)動(dòng)物施予安樂死(euthanasize)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。縱嚴(yán)多，療為雌轉(zhuǎn)應(yīng)麥?zhǔn)褂脴?biāo)準(zhǔn)的對(duì)多巴胺激動(dòng)藥的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答來進(jìn)行行為分析。在這種情況下，激動(dòng)劑為在PD的單側(cè)6-OHDA大鼠模型中由外源性左旋多巴合成的多巴胺。Ungerstedt(1971)/\cfePhys/'o/.Scanof.Swpp/.367:69-93。如圖4所示，在轉(zhuǎn)導(dǎo)三周后，在載體灌注(+)雷帕霉素組中的動(dòng)物顯示出對(duì)左旋多巴(5mg/kg)強(qiáng)的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)應(yīng)答，其顯著地高于載體灌注(-)雷帕霉素組中的(在60分鐘順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)，215.13±73.86對(duì)16.33土21.92，P<0.001)。通過使用單因素方差分析比較多組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在載體灌注(+)雷帕霉素組中，在第3、5和7周對(duì)左旋多巴激發(fā)的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)應(yīng)答明顯隨著灌注前得分或時(shí)間擬合的對(duì)照(載體灌注(-)雷帕霉素組和賦形劑灌注(+)雷帕霉素組)而增加(P〈0.001)。相反，在灌注前時(shí)間點(diǎn)和在除去雷帕霉素的時(shí)間點(diǎn)(4周和6周)，載體灌注(+)雷帕霉素組與兩個(gè)對(duì)照組^>0.05)沒有顯著不同。載體灌注(-)雷帕霉素和賦形劑灌注對(duì)照組在任何時(shí)間點(diǎn)沒有顯著不同(P>0.05)。不打算受到理論的束縛，在七周期間，兩個(gè)對(duì)照組中旋轉(zhuǎn)應(yīng)答的逐漸增大可能是由對(duì)重復(fù)的左旋多巴處理的敏化引起。在載體灌注(+)雷帕霉素組中，在"關(guān)閉(off)"雷帕霉素時(shí)間點(diǎn)、第4周和第6周的旋轉(zhuǎn)應(yīng)答與載體灌注(-)雷帕霉素組或賦形劑灌注(+)雷帕霉素組在那些時(shí)間點(diǎn)的沒有顯著地不同，這證實(shí)了誘導(dǎo)應(yīng)答的可逆性。在三個(gè)連續(xù)的雷帕霉素處理周期內(nèi)觀察到hAADC表達(dá)的誘導(dǎo)和隨后在未處理的幾周內(nèi)表達(dá)減少，這一事實(shí)加強(qiáng)了雷帕霉素誘導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)的誘導(dǎo)存在的結(jié)論。,蘑茫資拔沐^A)AADC存基像薦^/游定f在所有大鼠上進(jìn)行的實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)兩個(gè)載體灌注組都被相當(dāng)量的hAADC基因拷貝轉(zhuǎn)導(dǎo)。在載體灌注(+)雷帕霉素組中hAADC基因的拷貝數(shù)(222土92基因組拷貝/20ngDNA)(土SD)與載體灌注(-)雷帕霉素組(229士48基因組拷貝/0ngDNA)沒有不同。教戯激微對(duì)〃錢在灌注后七周，用免疫組織化學(xué)分析評(píng)價(jià)hAADC表達(dá)水平。來自載體灌注(+)雷帕霉素組的代表性動(dòng)物的紋狀體灌注部位內(nèi)高倍放大的圖像顯示在圖5A中，來自載體灌注(-)雷帕霉素組的一個(gè)圖像顯示在圖5B中。如在圖5A中圖解的，hAADC轉(zhuǎn)基因表達(dá)定位于大鼠紋狀體中的中型多棘神經(jīng)元。相反，用載體灌注但從不誘導(dǎo)的大鼠(載體灌注(-)雷帕霉素組)顯示出極低水平的hAADC轉(zhuǎn)基因表達(dá)(圖5B)。圖6顯示了在整個(gè)包埋大腦切片的AADC免疫組織化學(xué)的低倍放大的圖像，所述大腦切片來自七周后紋狀體灌注后每個(gè)組中的代表性的動(dòng)物。將用AAV-CMV-TF+AAV-Z12-hAADC(每個(gè)載體3x101Qvg)灌注且用雷帕霉素誘導(dǎo)(A)或不用雷帕霉素(B)誘導(dǎo)的動(dòng)物與雷帕霉素誘導(dǎo)的賦形劑對(duì)照(C)進(jìn)行比較。左大腦半球?yàn)?-OHDA損害和紋狀體內(nèi)載體(或賦形劑)灌注部位。右大腦半球?yàn)槲磽p害的和未灌注的，因此，右大腦半球的染色反映出來自完整的大鼠AADC陽(yáng)性纖維的內(nèi)源性染色。6-OHDA損害引起內(nèi)源性AADC消耗，導(dǎo)致左大腦半球中酶的低組織化學(xué)染色，在賦形劑灌注對(duì)照組中最好的圖解顯示在圖6C中。載體灌注的(+)雷帕霉素組中的大鼠都在灌注左側(cè)顯示出hAADC轉(zhuǎn)基因染色(參見，例如圖6A)。載體灌注(-)雷帕霉素組中的大鼠具有低水平的hAADC轉(zhuǎn)基因表達(dá)(參見，例如圖6B)。在六分之五的載體灌注(-)rap動(dòng)物中觀察到hAADC表達(dá)。與載體灌注(+)雷帕霉素組相比，在載體灌注(-)雷帕霉素組中存在較少的陽(yáng)性細(xì)胞和較低強(qiáng)度的各個(gè)細(xì)胞的染色，證實(shí)在不存在雷帕霉素的情況下，僅僅有低水平的來自誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的hAADC表達(dá)。在紋狀體內(nèi)灌注、即刻給藥雷帕霉素后七周，在從處以安樂死的大鼠中獲得的連續(xù)大腦切片上進(jìn)行定量體視學(xué)法。在固定的腦組織的連續(xù)切片中，用立體學(xué)評(píng)價(jià)和定量AADC免疫染色。使用光學(xué)分級(jí)裝置立體學(xué)方法(protocol)，一種有效的公平的目標(biāo)計(jì)數(shù)法，其為光學(xué)解剖器方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)最佳的空間采樣方法的組合。Gundersen等(1988)Apmis96:857-81;Gundersen(1986)丄M/crasc.143(Pt1):3-45。結(jié)果顯示在表1中，其顯示出載體灌注(+)雷帕霉素組具有最大的染色的前后距離(anterior-to-posteriordistance)(3,720士1,276詣)(土SD)，而在載體灌注(-)雷帕霉素組中存在低得多的分布水平(1，920土1,577iim)。表1AADC在大鼠大腦中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>"n"為研究的大腦半球數(shù)。數(shù)據(jù)值為現(xiàn)有值士1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差用Student'st檢定，雷帕霉素誘導(dǎo)的組中的平均前后分布、分布體積和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與"沒有誘導(dǎo)的"組的值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.02)。表1也顯示了了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)和紋狀體內(nèi)的分布體積。載體灌注(+)雷帕霉素組具有最大數(shù)量的AADC陽(yáng)性細(xì)胞(75,825土30,506細(xì)胞)，其次在載體灌注(-)雷帕霉素組中有較低量的陽(yáng)性細(xì)胞(31，000士25，812細(xì)胞)(PO.01)，在賦形劑灌注對(duì)照組中沒有可檢測(cè)的表達(dá)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。類似地，載體灌注(+)雷帕霉素組顯示出大量的hAADC紋狀體分布(15.75土8.16mm3)，而載體灌注(-)雷帕霉素組顯示出55%較低量的紋狀體分布(7.09±5.69mm3)。體視學(xué)分析為轉(zhuǎn)導(dǎo)的紋狀體神經(jīng)元數(shù)量和病毒載體顆粒分布的精確測(cè)定方法。然而，總蛋白分析為產(chǎn)生的hAADC酶含量的更精確的測(cè)定，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的hAADC的量可在各組間不同。為了通過免疫染色發(fā)現(xiàn)的在未轉(zhuǎn)導(dǎo)組中較低強(qiáng)度的hAADC表達(dá)與較低總水平的hAADC表達(dá)有關(guān)，從連續(xù)組織切片中提取總蛋白，用蛋白質(zhì)印跡分析檢驗(yàn)。證實(shí)了在未誘導(dǎo)組中有較低的hAADC蛋白質(zhì)濃度。圖7顯示了相關(guān)凝膠譜帶的圖像，和整體的譜帶強(qiáng)度圖，其來自載體灌注(+/-)雷帕霉素和賦形劑灌注(+)雷帕霉素單側(cè)6-OHDA損害的大鼠，其顯示出在紋狀體內(nèi)hAADC(50kDa)的蛋白水平的改變。e肌動(dòng)蛋白被包括作為上樣對(duì)照(loadingcontrol)。與兩個(gè)對(duì)照組相比，在載體灌注(+)雷帕霉素組中的AADC譜帶密度顯著地較高，P<0.001。在灌注后7周，來自載體灌注(+)雷帕霉素和(-)雷帕霉素大鼠的蛋白質(zhì)印跡上的譜強(qiáng)度分別為102.04士7.02兆象素(MP)和30.63土3.47MP。在存在內(nèi)源性大鼠AADC水平調(diào)整后，與在載體灌注(+)雷帕霉素組相比，在載體灌注(-)雷帕霉素組中的平均總AADC蛋白水平減少了88%。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了兩組間在hAADC酶水平中存在比用體視學(xué)分析表明的更大的差異。有關(guān)在實(shí)施例2中使用的試驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如下//衫手術(shù)方茲6-OHDA-損害的成年Sprague-Dawley大鼠(對(duì)于賦形劑灌注和載體灌注(-)雷帕霉素組，n=6只大鼠，對(duì)于載體灌注(+)雷帕霉素組，n=8只大鼠)從TaconicFarms獲得(Germantown,NY)。在標(biāo)準(zhǔn)大氣條件下，將大鼠按每個(gè)籠子一只飼養(yǎng)控制的溫度和濕度，12小時(shí)光照周期，自由獲取食物和水。通過對(duì)流增加的遞送(CED)灌注載體，獲得遍布紋狀體的最佳分布。Bankiewicz等(2000)A/ew廠o/.164:2-14;Lieberman等(1995)丄A/eurasury.82:1021-9。簡(jiǎn)言之，將載體裝入聚合物管(OD,1/16";ID，0.030";UpchurchScientific,OakHarbor,WA)所述管連接到用從氣密的Hamilton注射器抽出的橄欖油填充的管道。用可編程泵(BioanalyticalSystems,lnc,WestLafayette,IN)遞送載體。將插管，包括固定27-號(hào)針(fittedintoa27-gaugeneedle)的熔凝石英毛細(xì)管(OD，164wm;ID,100um;PolymicroTechnologies,Phoenix,AZ)連接到聚合物管的遠(yuǎn)端。用02流(2L/分鐘)中的3%異氟垸誘導(dǎo)麻醉，將動(dòng)物置于立體定位的框架中(Kopf，Tujunga,CA)。然后，用穿過固定在立體定位框架的面具，用02中的1%異氟垸來維持麻醉。在耙向位點(diǎn)鉆孔，按下述涉及甜鹵和硬膜的坐標(biāo)將插管垂直插入尾狀殼核(神經(jīng))中AP0.0mm,ML-3.5mm,DV-5.0mm,切牙條(incisorbar)設(shè)定在-3.3mm。以0.5yl/分鐘的速率，單側(cè)用10ul1:1比例的兩種載體灌注動(dòng)物。在20分鐘灌注期結(jié)束時(shí)，將速率降低至0ul/分鐘，持續(xù)5分鐘靜止期，慢慢地取出插管°用連接到計(jì)算機(jī)運(yùn)行RotoMax旋光分析軟件的自動(dòng)旋轉(zhuǎn)流量計(jì)(AccuScanInstruments,Inc.Columbus,OH)評(píng)價(jià)對(duì)阿撲嗎啡(0.05mg/kg，Sigma,St.LouisMO)和左旋多巴(甲酯，Sigma)的應(yīng)答。在30分鐘內(nèi)(用于阿撲嗎啡)和在60分鐘內(nèi)(用于左旋多巴)計(jì)算總的對(duì)側(cè)和同側(cè)旋轉(zhuǎn)。在損害后三周，僅具有在30分鐘內(nèi)應(yīng)答阿撲嗎啡(0.05mg/kg)的平均旋轉(zhuǎn)〉6個(gè)對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)/分鐘的大鼠被認(rèn)為是良好損害的(Ungerstedt(1971)/VcteP/7ys/'o/.Sca〃cf.Supp/.367:69-93)，測(cè)試其左旋多巴應(yīng)答。利用低于治療范圍的劑量(5mg/kg)的左旋多巴甲酯與2.5mg/kg的芐絲肼共同給藥來測(cè)試這些動(dòng)物對(duì)左旋多巴的應(yīng)答(Sigma,St.Louis,Missouri)。高于95%的測(cè)試大鼠不會(huì)對(duì)5mg/kg左旋多巴應(yīng)答而旋轉(zhuǎn)。從實(shí)驗(yàn)中排除顯示出對(duì)這些劑量純粹的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)的動(dòng)物。在紋狀體內(nèi)灌注后，在外科手術(shù)前和在不同的時(shí)間點(diǎn)(3、4、5、6和7周)評(píng)價(jià)左旋多巴應(yīng)答。免微鄉(xiāng)學(xué)對(duì)于組織學(xué)研究，動(dòng)物用生理鹽水穿過主動(dòng)脈灌注，然后用4%多聚甲醛灌注(對(duì)于賦形劑灌注和載體灌注(-)雷帕霉素組，n=6只大鼠，對(duì)于載體灌注(+)雷帕霉素組，r^8只大鼠)。將大腦固定后在4。/。多聚甲醛中過夜，用梯度蔗糖溶液平衡，在異戊垸中冷凍。在低溫恒溫器中，將大腦連續(xù)切成40um厚的冠狀縫切面。在自由漂浮(free-floating)的切片上進(jìn)行對(duì)AADC的免疫組織化學(xué)(Chemicon,Temecula,CA,1:1500)。在3%過氧化氫中培養(yǎng)切片30分鐘，以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。在用5%正常山羊血清阻斷非特異性結(jié)合后，在室溫下，將切片與一抗孵育過夜。在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)，先用生物素(酰)化的抗兔子IgG抗體(VectorLaboratories,BurlingameCA，1:300)，然后用抗生蛋白鏈菌素連接的辣根過氧化酶(VectorLaboratories,1:300)孵育各1小時(shí)，用3-3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB,VectorLaboratories)和過氧化氫顯影復(fù)合物。將切片固定在明膠涂層的載玻片上，千燥，在連續(xù)增加濃度的乙醇中脫水，用二甲苯清洗，利用Cytoseal-60固定(Richard-AllenScientific,Kalamazoo,Ml)。hAADC免疫染色的前后分布通過公式(nx12x40um)確定的，其中n為具有hAADC陽(yáng)性細(xì)胞的切片數(shù)，40um為切片的厚度，測(cè)定所有第十二個(gè)切片。在連續(xù)切片中評(píng)價(jià)分布體積和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(每個(gè)第十二片)，利用基于光學(xué)分級(jí)裝置-光學(xué)解剖器(OpticalFractionator-Optical-OpticalDissectordesign立體學(xué)方法在63X放大下在裝有攝像機(jī)和立體研究立體學(xué)軟件(Microbrightfield，W川iston，VT)的Zeiss顯微鏡下對(duì)AADC染色。每組的CEE<5%。如平均值土SD表示結(jié)果。使用Student'st檢定測(cè)定統(tǒng)計(jì)顯著性。在該研究中使用的載體AAV-Z12hAADC包含人類AADC靶向基因。使Q-PCR引物和退火至AADC基因的外顯子2和3的探針，因此，生成了在載體序列中不存在的內(nèi)含子，從而最小化了基因組DNA的擴(kuò)增。實(shí)時(shí)Q-PCR(Heid等(1996)GenomeRes.6:986-94)用包含載體插入的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)化。用限制性內(nèi)切酶線化所述質(zhì)粒，純化，用UV吸光率定量，并稀釋在Q-PCR稀釋緩沖劑中(10mMTris-HCI,pH8.0,1mMEDTA,10ug/ml酵母tRNA，和0.1%吐溫80)，得到每個(gè)反應(yīng)從三至106拷貝的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在96孔光學(xué)平皿中進(jìn)行三個(gè)平行測(cè)定的50yI反應(yīng)。將各自包含20ngDNA的10nI的樣品加入到包含40uI反應(yīng)混合物的三個(gè)平行測(cè)定的Q-PCR孔中。PCR在AppliedBiosystems7700SequenceDetectionSystem中進(jìn)行。與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較計(jì)算hAADC基因拷貝數(shù)，得到的每孔拷貝數(shù)乘以二，假定雙鏈質(zhì)粒DNA的一個(gè)拷貝相當(dāng)于兩個(gè)單鏈載體基因組。分別用手持式均質(zhì)器在包含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的混合物的裂解緩沖劑中均質(zhì)化整個(gè)大腦的十個(gè)連續(xù)切片(每個(gè)40um)。使用Bradford方法定量蛋白質(zhì)。在SDS-PAGE凝膠上(4-15。/。梯度凝膠；Bio-Rad,Hercules,California)分離蛋白質(zhì)樣品(15ug)并轉(zhuǎn)移至聚乙二烯二氟化物膜(Millipore，Bedford,Massachusetts)。用3。/。乳狀物封閉膜，用多克隆兔子抗AADC(1:500Chemicon,Temecula，Califomia)—抗孵育1小時(shí)。然后，在室溫下用相應(yīng)HRP連接的二抗(1:3000;AmershamBiosciences,ArlingtonHeights,川inois)孵育印跡1小時(shí)，在ECL溶液(Perkin曰merLifeSciences,Emeryville,California)中顯影1分鐘，暴露于來自Kodak(Rochester,NewYork)的X-Omat薄膜1-30分鐘。最后，在5(TC下，在strippingbuffer(67.5mMTris，pH6.8，2%SDS和0.7%e-巰基乙醇)中孵育印跡30分鐘，用多克隆兔子抗e-actin抗體(1:1000;AlphaDiagnostics,SanAntonio,Texas)作為加樣對(duì)照r印robed。在上述研究中，已經(jīng)廣泛地使用了抗AADC—抗，在這些研究中觀察到的蛋白質(zhì)譜帶顯示出相同的譜帶大小(-50kDa)，如在抗體信息表中指出的。每個(gè)特異性譜帶的密度可用計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)(Alphalmager@，AlphalnnotechCorporation,SanLeandro，California)測(cè)定。e肌動(dòng)蛋白對(duì)照譜帶的密度在各組間不存在顯著性差異。為了比較賦形劑灌注(+)雷帕霉素對(duì)照組和載體灌注組之間的差異，首先相對(duì)于相應(yīng)內(nèi)對(duì)照譜帶的密度標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)特異性譜帶的密度(對(duì)于每組，n=3)。在減去在來自兩種載體灌注組的賦形劑灌注大鼠中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性hAADC水平后，可確定總蛋白質(zhì)中的減少(reduction)百分?jǐn)?shù)。通過使用單因素方差分析比較多組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例3GDNF的體外可調(diào)型表達(dá)用二聚物可調(diào)控的GDNF轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如下。菱沐圖8A和8B為用于遞送人GDNF(hGDNF)轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體質(zhì)粒構(gòu)建物圖。用于遞送組成型表達(dá)hGDNF(pAAV-CMV-hGDNF)的對(duì)照載體顯示在圖8C中?？烧{(diào)控構(gòu)建物(圖8A和8B)包括載有編碼hGDNF基因和轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白組分的單rAAV載體。在兩種構(gòu)建物中，hGDNF的表達(dá)受到鄰近八個(gè)用于二聚的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位的最小IL-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在下述將更詳細(xì)地描述。在圖8A中圖解的構(gòu)建物(pPAAV-TF-Z8-hGDNF)中，CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼轉(zhuǎn)錄因子的活化和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩者的單個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。在圖8B圖解的構(gòu)建物中，相反，SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)激活結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域?yàn)閬碜韵喾存?即在相反方向上)的不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白包含來自人類轉(zhuǎn)錄因子Zif268的兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、源自O(shè)ct-1(ZFHDI)的同源結(jié)構(gòu)域和三個(gè)來自FK506(3xFKBP)的胞質(zhì)受體的藥物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白包含人類FRAP(FRB*)的雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其融合至源自NFKB(p65)的p65亞基的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。在圖8A和8B中圖解的FRB*結(jié)構(gòu)域?yàn)樵趯?shí)施例1中描述的。指出了AAV2末端反向重復(fù)(ITR)、最低限度的SV40多聚腺苷酸化(Min.SV40pA)、最低限度的兔子e-球蛋白多聚腺苷酸化(Min.RBGpA)和最低限度的人生長(zhǎng)激素3聚腺苷酸化(MinhGHpA)。在對(duì)照載體pAAV-CMV-hGDNF(圖8C)中，CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)hGDNF的表達(dá)。指出了AAV2末端反向重復(fù)(ITR)和人生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化(pA)序列。雷帕霉素-誘導(dǎo)試驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖9中，其中GDNF的表達(dá)是載體構(gòu)建物和雷帕霉素濃度的函數(shù)。當(dāng)用雷帕霉素處理細(xì)胞時(shí)，pAAV-TF-Z8-hGDNF以劑量應(yīng)答性方式指導(dǎo)GDNF的產(chǎn)生，而pAAV-CMV-hGDNF指導(dǎo)組成型(高)水平GDNF表達(dá)，其與雷帕霉素處理無關(guān)。有關(guān)在實(shí)施例3中使用的試驗(yàn)ELISA測(cè)定法的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如下如下進(jìn)行定量GDNF表達(dá)的ELISA試驗(yàn)。在兩個(gè)6孔平皿中使HEK-293細(xì)胞(5乂105細(xì)胞/孔)生長(zhǎng)過夜，達(dá)到60-70%融合。利用300uMCaCI2,用10ug的pAAV-TF-Z8-hGDNF或pAAV-CMV-hGDNF轉(zhuǎn)染平皿。六小時(shí)后，用新的包含雷帕霉素(OnM、5nM或25nM，每個(gè)兩份)培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，生長(zhǎng)三天。分別收獲培養(yǎng)基和細(xì)胞，突然冷凍和保存在-8(TC下，直到進(jìn)行EUSA。用1NHCI酸化所有的樣品15分鐘至低于pH3.0，然后用1NaOH中和返回pH7.6。利用PromegaEmax⑧免疫領(lǐng)iJ定系統(tǒng)(Promega,Inc.,Madison,Wisconsin)測(cè)定培養(yǎng)基樣品GDNF的存在。將涂層緩沖劑加入到96孔平皿中，將其在4'C下孵育過夜。除去涂層緩沖劑，干燥平皿。將封閉緩沖劑(200ixl)加入到平皿中，在室溫下孵育1小時(shí)，不需要振搖。除去封閉緩沖劑，干燥平皿。將兩個(gè)96孔平皿的8孔柱指定為GDNF標(biāo)準(zhǔn)。將1XBlock&SampleBuffer(100uL/孔)加入到標(biāo)準(zhǔn)柱的B-H行。將稀釋的GDNF標(biāo)準(zhǔn)(200wL的1000pg/ml)加入到標(biāo)準(zhǔn)柱的A行，G行進(jìn)行2倍100uL/孔的連續(xù)稀釋。H行為不含有GDNF單獨(dú)的緩沖劑對(duì)照。對(duì)pAAV-TF-Z8-hGDNF試驗(yàn)，將試驗(yàn)樣品稀釋至1:300，對(duì)pAAV-CMV-hGDNF實(shí)驗(yàn)，將試驗(yàn)樣品稀釋至1:1000，將100"的每種加入到兩個(gè)孔中，在室溫下孵育六小時(shí)，并振搖(500rpm)。洗滌孔五次，每次用來自試劑盒的約400uI推薦的洗滌緩沖劑。將100uI1:500稀釋度的抗hGDNF多克隆抗體(在IXBlock&SampleBuffer)加入到各孔中，在4'C下孵育過夜，不需要振搖。如上所述再次洗滌平皿。將100yL1:250稀釋度的抗小雞IgY、HRP共軛物(在IXBlock&SampleBuffer中)力卩入到各孔中，在室溫下孵育兩小時(shí)，并振搖(500rpm)如上所述再次洗滌平皿。將100iiL的室溫TMBOne溶液(包含HRP底物，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)加入到各孔中，在室溫下孵育15分鐘，不需要振搖。通過給各孔中加入100yL的1N鹽酸終止顏色反應(yīng)。在450nm，在平皿讀數(shù)器上于加入TMB的30分鐘內(nèi)記錄吸光率。與從在相同平皿上含有GDNF標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)樣品中獲得的信號(hào)相比較，確定GDNF水平(pg/ml)。標(biāo)準(zhǔn)偏差來自對(duì)每個(gè)樣品的總共四次測(cè)定(兩個(gè)平皿的每個(gè)上的雙份樣品)。雖然描述了本發(fā)明優(yōu)選的闡述性的實(shí)施方案，但是對(duì)在本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明下，其中可以進(jìn)行各種變化和修飾，通過附加的權(quán)利要求覆蓋所有這樣的落入本發(fā)明真實(shí)的精神和范圍內(nèi)的變化和修飾。因此，所有出版物、專利、專利申請(qǐng)、序列和數(shù)據(jù)庫(kù)條目以其全部引入作為參考。權(quán)利要求1.用于治療患有神經(jīng)障礙的患者的藥物組合物，包括重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其編碼具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性的可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子；編碼轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體；其中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因?yàn)樵趩为?dú)的rAAV載體上編碼的。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中，在存在雷帕霉素或雷帕霉素類似物的情況下，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性增加。4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中雷帕霉素類似物為AP21967。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中神經(jīng)障礙為帕金森氏癥。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中轉(zhuǎn)基因?yàn)榉枷愕腖-氨基酸脫羧酶(AADC)。7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中轉(zhuǎn)基因?yàn)槟z質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)。8.治療患有神經(jīng)障礙的患者的方法，包括給藥治療有效劑量的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的藥物組合物。9.實(shí)施權(quán)利要求8的方法的試劑盒，包括重組AAV載體，其編碼可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子；重組AAV載體，其編碼轉(zhuǎn)基因；和雷帕霉素或雷帕霉素類似物。10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物在治療患有神經(jīng)障礙的患者的方法中的用途。11.編碼轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體和編碼可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的重組AAV載體在制備治療患有神經(jīng)障礙的患者的組合物中的用途，其中該可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性，該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受該轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。全文摘要提供用于將可調(diào)轉(zhuǎn)基因遞送至哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的重組腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)。也提供了使用該載體治療受患者神經(jīng)變性疾病的方法，用于構(gòu)建或使用該載體或?qū)嵤┍景l(fā)明方法的試劑盒。轉(zhuǎn)基因序列為從包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄因子可對(duì)小分子誘導(dǎo)物應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及包含轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建物都被遞送至靶細(xì)胞。該可調(diào)轉(zhuǎn)基因可在轉(zhuǎn)錄因子的相同rAAV載體上遞送，或在不同的載體上遞送。所述轉(zhuǎn)錄因子可包含兩個(gè)多肽鏈，例如，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，它們?cè)诖嬖诙刍锢缋着旅顾鼗蚱浞敲庖咴灶愃莆锏那闆r下形成活性二聚物。本發(fā)明的載體、方法和試劑盒可用于向患有神經(jīng)變性疾病例如帕金森氏癥病的患者的大腦遞送例如AADC或GDNF的基因，其中AADC或GDNF在大腦中的表達(dá)可隨后通過使用雷怕霉素或其類似物治療患者來調(diào)節(jié)。文檔編號(hào)C12N15/864GK101213305SQ200580042455公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2005年12月9日優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日發(fā)明者L·M·桑夫特內(nèi)爾,V·M·里弗拉申請(qǐng)人:建新公司;阿里亞德基因治療公司