專利名稱：碳納米管的納米纖維及其制備和氧化還原酶固定化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種碳納米管與丙烯腈共聚物復合納米纖維的制備及其用于氧化還原酶固定化的技術。
背景技術：
酶是一類由生物細胞產生的具有催化功能的蛋白質，作為一種生物催化劑，酶參與生物體內的各種代謝反應，而且反應后其數量和性質不發(fā)生變化。酶在常溫常壓的溫和條件下能高效的催化反應，比一般催化劑的效率高出107～1013倍，并具有很高的專一性，許多難以進行的有機化學反應在酶的催化下都能順利進行，而且可以減少或避免副反應。但是由于酶的特殊性質，其高級結構對環(huán)境十分敏感，各種因素都可能使酶喪失生物活力。即使在溫和的條件下，隨著反應時間的延長，酶的催化速度也會逐漸下降，反應后不能回收，只能采用分批進行生產等，這說明對于現代工業(yè)來說，酶還不是一種理想的催化劑。而固定化酶在節(jié)能，降低成本，保護環(huán)境，生產自動化、連續(xù)化等許多方面都是十分有利的，為酶的應用開拓了廣闊的前景。
固定化酶是20世紀50年代開始發(fā)展起來的一項新技術。迄今為止，適合酶固定化載體的材料樣式繁多；但是在眾多的材料中，多孔和具有納米尺寸的材料表現了明顯的優(yōu)勢，不僅是因為具有這種結構的材料具有較大的比表面積，更因為采用這種尺寸的載體有利于降低底物擴散阻力，提高酶催化效率。作為一種制備納米纖維的重要方法，靜電紡絲已經引起了廣泛的重視；它通過高壓靜電使聚合物溶液帶上電荷，當電壓超過一臨界值時，溶液中帶電荷部分克服溶液的表面張力從溶液中噴出，經過溶劑揮發(fā)而形成纖維。這種納米纖維的尺寸可以從幾納米到幾微米，具有很高的比表面積，而且制備方法很便捷，從而成為酶固定化和生物傳感器提供了可行的載體。Jia Hongfei等將聚苯乙烯紡成120nm的纖維，并將α-胰凝乳蛋白酶用化學方法固定到功能化的纖維上(Hongfei Jia，Guangyu Zhu，Bradley Vugrinovich.Biotechnol.Prog.2002，181027-1032)；Herricks TE等將α-胰凝乳蛋白酶包埋在聚苯乙烯/苯乙烯-馬來酸酐共聚物中靜電紡絲(Thurston E.Herricks，Sae-Hoon Kim，Jungbae Kim.J.Mater.Chem.，2005，153241-3245)；Wang Yuhong等將脂肪酶通過共價鍵法固定到500nm左右的超細纖維素纖維上(YuHong Wang，You-Lo Hsieh.J.Polym.Sci.Part APolym.Chem.，2004，424289-4299)；Wu Lili等利用聚乙烯醇靜電紡絲的方法包埋固定化纖維素酶催化纖維素的水解(Lili Wu，Xiaoyan Yuan，Jing Sheng.J.Membr.Sci.，2005，250167-173)；CN1737560A將酶固定到靜電紡絲膜上，并應用于酶電極。但是上述方法僅僅從提高載體的比表面積入手，來提高載酶量和降低底物擴散阻力。Ye Peng、Huang Xiaojun等利用仿生修飾的纖維表面來固定酶，可以同時提高酶的固定效率和催化效率。然而，無論對于前者的生物大分子表面固定，還是后者涉及到的磷脂聚合物合成，載體制備過程都相對繁瑣，費時，尤其后者物理吸附的酶還存在容易脫落的問題。(Peng Ye，Zhikang Xu，Jian Wu，Christophe Innocent，Patrick Seta.Biomaterials，2006，274169-4176；Xiaojun Huang，Zhikang Xu，Lingshu Wan，ChristopheInnocent，Patrick Seta.Macromol.Rapid Commun.，2006，27，1341-1345，)碳納米管是由日本的Iijima教授于1991年發(fā)現并命名。它是一種新興的納米材料，由單層或多層石墨片卷曲而成的無縫管狀晶體；根據石墨層的多少可分為單壁管、雙壁管和多壁管。碳納米管具有優(yōu)良的電學和力學性能。碳納米管的導電性和其手性矢量有關，既可以是導體也可以是半導體，其被認為是典型的一維導體，電流運載能力是銅的一千倍。碳納米管這種特殊的納米結構和優(yōu)異的導電性能已經被應用于酶傳感器的制作中，研究表明可以明顯的提高酶與電極之間電子的傳遞速率。在力學性能方面，碳納米管具有極高的力學強度，很好的柔性，回彈性和抗畸變的能力。碳納米管這種獨特的電學和力學性能，在聚合物基體材料共混改性方面有重要的意義，不但可以提高聚合物的力學強度，也可以有效地提高基體的導電性。CN1786036用原位電化學聚合的方法制備了聚合物/碳納米管復合材料。CN1775668利用原位開環(huán)聚合方法制備了聚酯/碳納米管復合材料。上述兩種方法都賦予了聚合物基體以碳納米管的性能，但是，由于碳納米管在材料里無規(guī)取向，因此材料的力學，電學性能提高受到了一定限制。CN1746343將碳納米管與聚合物共混并靜電紡絲，纖維中還有高度曲線的碳納米管。有研究表明，這種高度取向的碳納米管可使復合纖維在軸向的力學強度和電導率大大提高。這種纖維尚未被應用于生物催化領域中。
聚合物/碳納米管復合纖維具有很高的比表面積和導電性，采用含有反應性基團(羧基，氨基)的聚合物，這種復合材料將有利于作為化學固定氧化還原酶的載體材料。在聚合物作為反應層的酶傳感器中，這種材料也會有潛在的應用價值。但是，實際開發(fā)應用尚未見于報道。

發(fā)明內容
針對傳統(tǒng)的固定化酶載體比表面積小，且容易造成酶失活，儲存穩(wěn)定性差等缺點，本發(fā)明提供了一種新型的帶有反應性基團羧基的聚丙烯腈/碳納米管復合納米纖維及其制備方法和氧化還原酶固定化的方法。
本發(fā)明的技術方案是1)由靜電紡絲方法制備的碳納米管的納米纖維中聚合物分子量約為15～25萬，聚合物中丙烯酸摩爾含量為5～40％；采用多壁碳納米管或單壁碳納米管，纖維中碳納米管的含量為聚合物質量的1～50％；納米纖維的直徑范圍為180納米～1200納米；2)將用混酸處理過的含有羧基的碳納米管的在聚合物溶劑中超聲分散，而后將分子量為15萬～25萬、丙烯酸摩爾含量為5～40％的丙烯腈-丙烯酸共聚物溶解于分散液中，碳納米管占聚合物質量的1～50％；將上述紡絲溶液分別注入到多道靜電紡絲裝置中，進行靜電紡絲匯集成膜，將制得的納米復合纖維放入真空烘箱中干燥；丙烯腈-丙烯酸共聚物/碳納米管復合納米纖維上酶固定化的方法3)將納米纖維用去離子水和磷酸鹽緩沖溶液分別沖洗，浸潤，而后在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖溶液中振蕩活化，2～10個小時取出用磷酸鹽緩沖溶液反復清洗；將酶充分溶解于磷酸鹽緩沖溶液中制成酶溶液；將活化的納米纖維完全浸沒于酶溶液中，密封后在恒溫條件下振蕩，隨后從溶液中取出膜，用磷酸鹽緩沖溶液重復清洗，可得到碳納米管/丙烯腈共聚物復合纖維固定化酶；將固定化酶納米纖維放于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的優(yōu)點1)、用于制備復合纖維的原料分別為含有活性基團的丙烯腈共聚物和碳納米管，前者已實現工業(yè)化，成本低廉，生產工藝簡單，后者也已批量生產，預計未來幾年價格明顯降低。
2)、復合纖維制備簡單，易于酶固定化。
3)、這種復合纖維具有高比表面積和高空隙率，有利于提高固定化酶的載酶量、消除酶催化反應時的擴散控制和提高固定化酶的催化效率。
4)、這種具有納米尺寸復合纖維用于酶固定化的載體，易于從反應體系中回收，可以重復使用，儲存穩(wěn)定性明顯增強，極大地提高酶的利用率和降低生產成本。
5)、這種利用機械共混來提高固定化酶活性的方法，相比于傳統(tǒng)的表面修飾改性更簡便易行，在其他方面(如電極制作)有很大的潛在應用價值。


圖1的a、b分別為實例1和實例4所制備的納米復合纖維掃描電鏡圖；圖2的c、d分別為實例4所制備的納米復合纖維的透射電鏡圖(標記1和標記2為突出的碳納米管部分，標記3為包埋在纖維內部的碳納米管部分)。
具體實施例方式丙烯腈共聚物/碳納米管復合纖維制備方法將混酸處理的多壁碳納米管或單壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶劑中的質量分數為6％～15％，碳納米管占聚合物質量的1～50％；注入到多道靜電紡絲注射器中，在電壓為5～20千伏，擠出速率為0.1～3毫升/小時，接收距離為5～30厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；將其放入真空烘箱80℃下干燥24小時，即得到這種碳納米管/丙烯腈共聚物納米復合膜。
丙烯腈-丙烯酸共聚物，粘均分子量為15～25萬，丙烯酸摩爾含量為5～40％。
用于本發(fā)明的溶劑為二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺中的一種、或是上述各種任意兩種混合物。
將納米纖維分別用去離子水和pH 7.0，離子強度0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液沖洗、浸潤，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(前者1～20毫克/毫升，兩者摩爾比為1∶1)的磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩活化2～10小時，而后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液清洗4～6次；將酶溶解于pH 7.0，離子強度0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液中，制成濃度為0.1～1毫克/毫升的酶溶液；將活化的膜完全浸沒于酶溶液中，密封后在25℃下振蕩0.5～8小時；從溶液中取出膜，用磷酸鹽緩沖溶液清洗4～6次，可得到碳納米管/丙烯腈共聚物復合纖維固定化酶。將固定化酶膜放于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 用于固定化的酶為過氧化氫酶，過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，乙醇脫氫酶，漆酶，多酚氧化酶中的一種。
以下實施實例對本發(fā)明做更詳細的描述，但所述實施例不構成對本發(fā)明的限制。
丙烯酸摩爾含量通過元素分析方法測定；纖維形貌和直徑通過掃描電鏡和透射電鏡分析測定；載酶量通過Bradford方法測定(Marion M.Bradford.Anal.Biochem.，1976，72248-254.)；過氧化氫酶活性測定根據(Sinan Akgl，Yasemin Kacar，Serpil zkara，Handan Yavuz，AdilDenizli，M.Yakup Arica.J.Mol.Catal.B Enzym.，2001，15197-206.)；過氧化物酶活性測定根據(Srivatsa V.Rao，Kimberly W.Anderson，Leonidas G.Bachas.Biotech.Bioeng.1999，65389-396.)。
丙烯腈-丙烯酸共聚物/碳納米管復合納米纖維制備有以下實例例1將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的1％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為160～200納米。
例2將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的10％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為300～320納米。
例3將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的20％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為270～290納米。
例4將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的30％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為260～286納米。
例5將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為270～300納米。
例6將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的50％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為260～294納米。
例7將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量5.7％，粘均分子量15萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為190～225納米。
例8將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量37.6％，粘均分子量24.5萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為570～600納米。
例9將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為10％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為770～850納米。
例10將混酸處理的多壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為15％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為1100～1200納米。
例11將混酸處理的單壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為270～296納米。
例12將混酸處理的雙壁碳納米管超聲分散于二甲基甲酰胺溶劑中，而后將丙烯腈-丙烯酸共聚物(丙烯酸摩爾含量20.0％，粘均分子量18萬)溶解于分散液中，制備成均一的共混液，聚合物在溶液中質量分數為6％，碳納米管占聚合物質量的40％。將分散液注入到靜電紡絲注射器中，在電壓為12千伏，擠出速率為1.0毫升/小時，接收距離為15厘米下通過靜電紡絲收集到納米復合膜；纖維直徑范圍為270～296納米。
本發(fā)明例1～12丙烯腈-丙烯酸共聚物/碳納米管復合纖維及固定化過氧化氫酶各性能參數，如表1所示。
本發(fā)明1～6例丙烯腈-丙烯酸共聚物/碳納米管復合纖維及固定化辣根過氧化物酶各性能參數，如表2所示。
表1

a自由過氧化氫酶活性為2459.3微摩爾過氧化氫(消耗)/毫克固體·分鐘。
b自由酶米氏常數Km為34.07毫摩爾/升。
表2

自由辣根過氧化物酶活性為181微摩爾產物(生成)/毫克固體·分鐘。
將上述實例中制備的共聚物/碳納米管復合纖維作為酶固定化的載體，進行酶的固定化的
權利要求
1.一種碳納米管的納米纖維，其特征如下(1)其中聚合物分子量為15～25萬，聚合物中丙烯酸摩爾含量為5～40％；采用多壁碳納米管或單壁碳納米管，纖維中碳納米管的含量為聚合物質量的1～50％；(2)復合納米纖維由靜電紡絲制備；(3)納米纖維的直徑范圍為180納米～1200納米。
2.專用于權利要求1所述的碳納米管的納米纖維的制備方法，其工藝步驟特征如下(1)先丙烯腈-丙烯酸共聚物將丙烯腈、丙烯酸、水依次加入到反應釜中，其中丙烯腈和丙烯酸的摩爾比控制在95∶5～60∶40，單體丙烯腈和丙烯酸的總摩爾濃度為2.5摩爾/升；在通氮氣20分鐘后，升溫至60℃，加入引發(fā)劑(NH4)2S2O8-NaHSO3，其中(NH4)2S2O8和NaHSO3摩爾比為1∶1，引發(fā)劑與單體的摩爾比為1/200～1/500；啟動攪拌，在氮氣保護下進行聚合反應；聚合4小時后，將生成的白色沉淀物濾出，并先后用熱去離子水和乙醇各清洗聚合物三遍；然后再用去離子水進行抽提純化，以除去未反應的單體及可能的可溶性均聚物；得到的白色固體聚合物在60℃下抽真空進行干燥；(2)將多壁碳納米管或單壁碳納米管用體積比3/1的硫酸/硝酸在40℃下處理16小時，然后用離心過濾的方法得到表面帶有羧基的純化的碳納米管；將其在丙烯腈—丙烯酸共聚物溶劑中超聲分散6～10小時，而后將固體共聚物在80℃～100℃下溶解于此分散液中，聚合物在溶液中的質量分數為6～15％，碳納米管為聚合物質量的1～50％；將這種均勻分散有碳納米管的聚合物溶液注入到靜電紡絲裝置中，在電壓為5～20千伏，擠出速率為0.1～3.0毫升/小時，接收距離為5～30厘米下通過靜電紡絲收集到復合納米纖維；將其放入真空烘箱80℃下干燥24小時，即得到這種碳納米管/丙烯腈共聚物復合納米纖維。
3.根據權利要求2中所述的一種碳納米管的納米纖維的制備方法，其特征在于所說的共聚物溶劑為二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲基亞砜其中的一種或上述各種的任意混合物。
4.根據權利要求2中所述的一種碳納米管的納米纖維的制備方法，其特征在于所說的摻有碳納米管的復合納米纖維表面帶有反應性基團羧基。
5.用于權利要求1中所述的含有碳納米管的納米纖維的氧化還原酶固定化方法，其特征在于將納米纖維用去離子水和pH 7.0、離子強度為0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液分別沖洗3～5次，浸潤；在1-(3二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩活化2～10小時，而后將納米纖維取出，用磷酸鹽緩沖溶液清洗4～6次；將酶溶解于pH 7.0，離子強度0.05摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液中，制成濃度為0.1～1毫克/毫升的酶溶液；將活化的納米纖維完全浸沒于酶溶液中，密封后在25℃下振蕩0.5～8小時；從溶液中取出膜，用磷酸鹽緩沖溶液清洗4次，可得到碳納米管/丙烯腈共聚物復合纖維固定化酶；將固定化酶納米纖維放于4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 6.根據權利要求5所述的酶固定化方法，其特征在于固定于該材料上的酶包括過氧化氫酶，過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，乙醇脫氫酶，漆酶。
全文摘要
碳納米管的納米纖維及其制備和固定氧化還原酶的方法。將多壁碳納米管(MWCNT)(或單壁碳納米管SWCNT)首先超聲分散于溶劑中，再將丙烯腈/丙烯酸共聚物溶解于其中，通過靜電紡絲制備這種含有碳納米管、表面帶有反應性基團羧基的復合納米纖維，通過碳二亞胺鹽酸鹽/琥珀酰亞胺活化，將氧化還原酶固定到纖維表面上。本發(fā)明結合了納米纖維的高比表面積和碳納米管優(yōu)異的導電性的特點，有效提高了固定化氧化還原酶的催化效率。該酶固定化載體材料具有制備過程簡單，容易從反應體系中回收，提高酶的利用率和儲存穩(wěn)定性的優(yōu)點，在生物傳感器和生物燃料電池中有潛在的應用價值。
文檔編號C12N11/04GK1912200SQ20061005295
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權日2006年8月15日
發(fā)明者徐志康, 王振剛, 黃小軍 申請人:浙江大學