專利名稱：用于區(qū)分個(gè)體的方法、陣列、裝置和測(cè)試系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用DNA序列信息的個(gè)體區(qū)分方法，進(jìn)一步涉及用于個(gè)體區(qū)分測(cè)試(individual discriminating test)的陣列、裝置和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：
通過對(duì)人基因組核苷酸序列的幾乎完全解碼，已經(jīng)清楚了個(gè)體之間和種族之間的序列差異及其頻率。個(gè)體之間的差異研究在醫(yī)藥領(lǐng)域用于闡明藥物的作用與副作用之間的關(guān)系。
基因組核苷酸序列中的差異也用于在刑事調(diào)查中鑒定個(gè)體。目前個(gè)體鑒定中主要應(yīng)用的方法是基于DNA序列上重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)中的差異，代表性的是短串聯(lián)重復(fù)(STR)和可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR)。例如，自2003年以來警方已經(jīng)采用的一種方法是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增STR的9個(gè)位置和VNTR的1個(gè)位置，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并通過其遷移率確定重復(fù)數(shù)目。
然而，在諸如STR、VNTR等的序列中，由幾個(gè)核苷酸單位組成的恒定序列重復(fù)出現(xiàn)，關(guān)于上述10個(gè)位置，重復(fù)序列的全長(zhǎng)為大約30-600bp。為了測(cè)量這種重復(fù)次數(shù)，需要目標(biāo)區(qū)域保留在測(cè)試樣品中而不被切除。然而，很容易想到在進(jìn)行刑事調(diào)查的取樣現(xiàn)場(chǎng)遺留的體液和血液痕跡或者在重大災(zāi)禍如火災(zāi)、爆炸、意外事故等現(xiàn)場(chǎng)遺留的樣品已經(jīng)被破壞。在這種情況中，DNA序列可能已經(jīng)成為片段，未保留全部的目標(biāo)區(qū)域。如此，在需要較長(zhǎng)序列的使用重復(fù)序列進(jìn)行區(qū)分的方法中，存在一個(gè)問題是所述測(cè)量在一些情況中較為困難，因區(qū)分的方法中，存在一個(gè)問題是所述測(cè)量在一些情況中較為困難，因此優(yōu)選的是測(cè)試所需DNA區(qū)域盡可能短。
因此，本發(fā)明涉及一種近年來已經(jīng)闡明的使用單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行個(gè)體鑒定的方法。例如JP-A2004-239766(KOKAI)描述了可以使用微陣列的DNA探針中的單核苷酸多態(tài)性以區(qū)分個(gè)體。然而其中未揭示明確的方法。另外，Lee HY等(Selection of twenty-four highlyinformative SNP markers for human identification and paternity analysisin Koreans.；Forensic Aci Int.2005 Mar 10；148(2-3)107-12.)揭示了可用于在韓國(guó)人群的個(gè)體鑒定及親子鑒定中的24種核苷酸多態(tài)性。
然而，目前發(fā)現(xiàn)了大量單核苷酸多態(tài)性，對(duì)其未全部進(jìn)行測(cè)試。然而，目前還沒有關(guān)于何種單核苷酸多態(tài)性應(yīng)該被測(cè)試的強(qiáng)有力確定標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可以簡(jiǎn)便及快速地區(qū)分個(gè)體的方法，所述方法通過選擇對(duì)于個(gè)體區(qū)分有利的單核苷酸多態(tài)性而進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于個(gè)體區(qū)分測(cè)試的陣列、測(cè)試裝置和系統(tǒng)。
發(fā)明描述 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種個(gè)體區(qū)分方法，以確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性，所述方法包括在待區(qū)分對(duì)象個(gè)體所屬的群體中存在的單核苷酸多態(tài)性的組中選擇多種單核苷酸多態(tài)性的步驟，以及確定對(duì)象個(gè)體具有的核苷酸序列及來自樣品的核苷酸序列中所選擇的多種單核苷酸多態(tài)性的基因型并通過對(duì)比基因型區(qū)分個(gè)體的步驟，其中在選擇步驟中選擇符合如下(i)-(iii)中任一條件的單核苷酸多態(tài)性 (i)在2核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定2個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率是X和Y，X+Y＝1且Y≤X； 0.5≤X≤0.7； (ii)在3核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定3個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X； 1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1；及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；以及 (iii)在4核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定4個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X； 1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1；及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
在此，X優(yōu)選為0.55≤X＜0.7，更優(yōu)選為0.6≤X＜0.7，更優(yōu)選為0.65≤X≤0.68。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在個(gè)體區(qū)分測(cè)試中使用的陣列，其中核酸探針固定在基材上，用以確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性，所述陣列特征在于核酸探針具有與含有單核苷酸多態(tài)性的靶序列互補(bǔ)的序列，所述單核苷酸多態(tài)性選自待區(qū)分對(duì)象個(gè)體所屬的群體中存在的單核苷酸多態(tài)性的組，并且符合如下(i)-(iii)任一條件 (i)在2核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定2個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率是X和Y，X+Y＝1，Y≤X； 0.5≤X≤0.7； (ii)在3核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定3個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X； 1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1，及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9； (iii)在4核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定4個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X； 1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1，及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
在此，X優(yōu)選為0.55≤X＜0.7，更優(yōu)選0.6≤X＜0.7，進(jìn)一步優(yōu)選0.65≤X≤0.68。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A示出2核苷酸取代類型SNP的等位基因頻率與基因型頻率之間的關(guān)系。
圖1B是圖1A中的最大基因型頻率與最小基因型頻率。
圖2示出3核苷酸取代類型SNP的等位基因頻率與基因型頻率之間的關(guān)系。
圖3示出4核苷酸取代類型SNP的等位基因頻率與基因型頻率之間的關(guān)系。
圖4示出計(jì)算存在概率(existence probability)的實(shí)例。
圖5是示出個(gè)體區(qū)分測(cè)試系統(tǒng)的整體構(gòu)造示意圖。
圖6A示出關(guān)于第一個(gè)實(shí)施方案的芯片夾(chip cartridge)的詳細(xì)構(gòu)造。
圖6B示出以B-B方向所見的圖6A的視圖。
圖6C示出以C-C方向所見的圖6A的局部透視截面圖。
圖6D示出以D-D方向從后面所見的圖6A的視圖。
圖7示出在用上蓋固定螺絲固定之前芯片夾上的支持物和蓋子。
圖8示出在其上包裝有個(gè)體區(qū)分芯片的印刷電路板的詳細(xì)構(gòu)造。
圖9A示出第一個(gè)實(shí)施方案的小池(cell)以及與小池連通的藥物供應(yīng)系統(tǒng)。
圖9B是圖9A的俯視圖。
圖9C是圖9A的局部視圖。
圖10A示出小池附近每個(gè)組成元件的詳細(xì)構(gòu)造。
圖10B示出芯片夾上蓋固定在芯片上的外觀。
圖11是第一個(gè)實(shí)施方案的小池的俯視圖。
圖12是第一個(gè)實(shí)施方案的小池其它實(shí)例的俯視圖。
圖13A是生產(chǎn)個(gè)體區(qū)分芯片和印刷電路板過程的截面圖。
圖13B是圖13A隨后圖示。
圖13C是圖13B隨后圖示。
圖13D是圖13C隨后圖示。
圖14是個(gè)體區(qū)分芯片(individual discriminating chip)的俯視圖。
圖15示出第一個(gè)實(shí)施方案的流動(dòng)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例。
圖16示出使用流動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行個(gè)體區(qū)分測(cè)試的流動(dòng)步驟的流程圖。
圖17示出第一個(gè)實(shí)施方案的測(cè)量系統(tǒng)。
圖18示出先前的恒電位儀。
圖19示出分析測(cè)量數(shù)據(jù)的程序的一個(gè)實(shí)例。
圖20示出類型確定過濾處理的流程圖。
圖21示出類型確定處理的一個(gè)實(shí)例。
圖22是使用個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置區(qū)分個(gè)體的自動(dòng)化分析程序的順序圖(sequence view)。
圖23A示出基因型檢測(cè)實(shí)例的測(cè)量結(jié)果。
圖23B示出基因型檢測(cè)實(shí)例的測(cè)量結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式 本發(fā)明的一方面提供了一種區(qū)分個(gè)體的方法。在本說明書中，個(gè)體區(qū)分意味著確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性。例如，所述方法在刑事調(diào)查中可用于明確說明遺留的物品如殘留的血液痕跡和毛發(fā)是否是嫌疑人或受害人的血液或毛發(fā)。因此，樣品具有的核苷酸序列可以是這些遺留物品中含有的核酸序列，但不限于其。
如本文所用，術(shù)語“核酸”廣義上包括核酸及核酸類似物如核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、膦酸甲酯核酸、S-oligo、cDNA和cRNA，以及任何寡核苷酸和多核苷酸。這種核酸可以是天然存在的，或者可以是人工合成的。
在此，核苷酸序列優(yōu)選是基因組DNA序列，或者可以是不保證是完全基因組的片段序列。另外，本發(fā)明的個(gè)體區(qū)分方法也可用于個(gè)人自身身份識(shí)別、親子鑒定等，不限于這些用途。
在本發(fā)明的方法中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)用于個(gè)體區(qū)分，特別是選擇及使用在個(gè)體區(qū)分中有利的SNP。這種SNP選擇通過參考其等位基因頻率進(jìn)行。
在此，SNP是指基因組DNA序列中的一個(gè)核苷酸的差異，在指定群體中通常為1％或更高頻率。在大多數(shù)情況中，在一個(gè)SNP位置，兩個(gè)核苷酸之間發(fā)生取代，例如在一個(gè)個(gè)體中取代A(腺嘌呤)，在另一個(gè)體中發(fā)生G(鳥嘌呤)取代。這種SNP稱作2核苷酸取代類型，在這種情況中在一個(gè)SNP位置有三種基因型。在上述實(shí)例中，存在A/A純合、G/G純合和A/G雜合三種基因型。
然而，也存在罕見的3核苷酸取代類型或4核苷酸取代類型SNP。在這些SNP中，存在6或10種基因型，所以僅在一個(gè)SNP位點(diǎn)即可有許多基因型。
這些基因型的出現(xiàn)頻率可得自每個(gè)核苷酸的等位基因頻率。等位基因頻率是指在群體中某一SNP可出現(xiàn)的核苷酸的比率。即當(dāng)群體中某一SNP是A或T任一核苷酸時(shí)，群體中出現(xiàn)A的比率為70％，T的比率為30％，A的等位基因頻率X表示為0.7，T的等位基因頻率Y表示為0.3。在此，因?yàn)閄+Y＝1，因此這是2核苷酸取代，0＜X，0＜Y。
這種等位基因頻率是通過測(cè)試相當(dāng)數(shù)量的群體中包含的個(gè)體基因型并獲得其頻率分布狀態(tài)而確定。目前，不同群體中等位基因頻率由多個(gè)數(shù)據(jù)庫公布，對(duì)不同分類如種族和民族的群體已經(jīng)分別進(jìn)行了研究。列出SNP的位置和頻率的數(shù)據(jù)庫的例子有HAPMAP、NCBIEntrez SNP、JSNP、TSC等。
在本說明書中，通過例如種族、民族、國(guó)家、居住地、性別、年齡等這些分類方法分類的個(gè)體組群稱作群體。用于確定等位基因頻率所調(diào)查的個(gè)體數(shù)目是適當(dāng)?shù)模绻叨瓤煽縿t可以使用任何數(shù)據(jù)庫公布的等位基因頻率，或者等位基因頻率的調(diào)查可以單獨(dú)進(jìn)行。
如上所述，基因型頻率得自等位基因頻率。在上述SNP的情況中，基因型有AA純合、AT雜合和TT純合基因型，每個(gè)基因型的頻率得自(X+Y)2＝XX+2XY+YY。即AA∶AT∶TT＝0.49∶0.42∶0.09。
在本發(fā)明的方法中，根據(jù)這些等位基因頻率和基因型頻率選擇正確的SNP。在個(gè)體的核苷酸序列與樣品的核苷酸序列中，確定選擇的SNP中的基因型并進(jìn)行對(duì)比。如果兩種基因型完全一致，則可以確定所述樣品源自所述個(gè)體。
另外，在本說明書中，個(gè)體可以是任何實(shí)體如除了人之外的動(dòng)物和植物，只要該實(shí)體可以通過基因組DNA序列區(qū)分即可。優(yōu)選的對(duì)象是人，另外可包括家畜和寵物，或者培育的植物或野生植物。
同時(shí)，據(jù)報(bào)道在人基因組DNA中存在大約1千萬的SNP。盡管當(dāng)盡可能多地測(cè)試SNP時(shí)，測(cè)試精確度明顯增加，但是在簡(jiǎn)便性、快速和經(jīng)濟(jì)學(xué)方面顯然測(cè)試少量SNP會(huì)更好。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)如下條件選擇在個(gè)體區(qū)分中有利的SNP，這樣可以選擇個(gè)體區(qū)分所需的最小量的SNP。選擇SNP的條件(i)-(iii)在下文繼續(xù)闡明。
(i)首先，解釋在2核苷酸取代類型情況中選擇SNP的方法。假設(shè)被取代的核苷酸為A和B，等位基因頻率與基因型頻率之間的關(guān)系示于圖1A。在圖1A中，隨著A的頻率增加，基因型AA的頻率也增加。相反，隨著A的頻率增加，B的頻率降低，基因型BB的頻率也隨著降低。當(dāng)A的頻率為0.5時(shí)，即A和B的頻率相同時(shí)，基因型AB的頻率為最大。
圖1A中最大基因型頻率與最小基因型頻率示于圖1B。如該圖示出，在2核苷酸取代類型SNP中，在A的頻率為0.66時(shí)最高基因型頻率(MAX)的基因型具有最低基因型頻率4/9，并且不再降低。另外，在A的頻率為0.5時(shí)最低基因型頻率(MIN)的基因型成為最大基因型頻率，并在其周圍降低。
在此，要考慮SNP具有的多少基因型頻率是個(gè)體區(qū)分所需要的。在一定的SNP中，需要具有最大基因型頻率的基因型頻率盡可能地低。這是因?yàn)楫?dāng)最大基因型頻率較高時(shí)，導(dǎo)致該群體中具有該基因型的個(gè)體較多，降低了區(qū)分所述SNP個(gè)體的能力。因此，為了保證最低限度的區(qū)分能力，優(yōu)選具有最大基因型頻率的基因型的頻率為0.5或更低。
另外，需要具有最小基因型頻率的基因型的頻率盡可能地低。當(dāng)這種基因型頻率較低時(shí)，可以說這種基因型較罕見，可以說所述SNP具有極高的區(qū)分能力，是有用的SNP。
在此，核苷酸A和B各自的等位基因頻率以X和Y表示。條件是X+Y＝1且Y≤X。另外，需要說明的是0＜X及0＜Y，從這些條件中0.5≤X。因此在圖1B中，X中最大基因型頻率(max)不超過0.5，使得0.5≤X≤0.7。因此，合適地使用其中等位基因頻率為0.5≤X≤0.7的SNP。
如上所述，為了降低最大基因頻率，需要X的數(shù)值接近0.66。然而，為了降低最小基因型頻率，優(yōu)選X的數(shù)值更大一些。綜合這些條件，進(jìn)一步優(yōu)選的范圍是0.55≤X＜0.7，更優(yōu)選范圍是0.6≤X＜0.7，最優(yōu)選范圍是0.65≤X≤0.68。
具有前述范圍的X(等位基因頻率)的SNP在區(qū)分能力中具有較好的平衡性，這種SNP可優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。
(ii)其次，解釋在3核苷酸取代類型情況中選擇SNP的方法。如上所述在3核苷酸取代類型SNP中有6種基因型。因此，改善了通過一個(gè)SNP進(jìn)行區(qū)分的能力，這對(duì)于區(qū)分個(gè)體是有利的。
進(jìn)一步地，在2核苷酸取代類型中，最小基因型頻率與最大基因型頻率比率為4/9。因此，在3核苷酸取代類型中，可以通過選擇具有較小基因型頻率的SNP而選擇在區(qū)分個(gè)體中更有效的SNP。
在此，假定被取代的核苷酸是A、B和C，其等位基因頻率分別為X、Y和Z。在這種情況中，X+Y+Z＝1，Z≤Y≤X。因此，1/3≤X，(1-X)/2≤X，X+Y＜1。
此時(shí)3核苷酸取代類型中的基因型為X2、Y2、Z2、2XY、2YZ和2ZX。其中基因型頻率可以是最大的基因型是X2或2XY。
(a)在2XY≤X2的情況中，即Y≤1/2·X，最大基因型為X2。如上所述，由于需要基因型頻率小于4/9，因此X2＜4/9。因此，期望的等位基因頻率為Y≤1/2·X及X＜2/3，選擇這樣的SNP。
或者，(b)在2XY＞X2的情況中，即1/2X＜Y時(shí)，最大基因型為2XY。如上所述，由于需要基因型頻率小于4/9，因此2XY＜4/9。因此，期望的等位基因頻率為1/2·X＜Y及XY＜2/9，選擇這樣的SNP。
符合上述條件(a)和(b)的X和Y的范圍在圖2中以斜線區(qū)域示出。具有這個(gè)范圍等位基因頻率的3核苷酸取代類型SNP是較2核苷酸取代類型SNP更有助于個(gè)體區(qū)分的SNP，可以說是具有高效力的SNP。
(iii)接著，解釋在4核苷酸取代類型情況中選擇SNP的方法。如上所述，在4核苷酸取代類型SNP中有10種基因型。因此，通過一個(gè)SNP進(jìn)行區(qū)分的能力最高，可有利地用于個(gè)體區(qū)分。在4核苷酸取代類型SNP中，如3核苷酸取代類型SNP一樣，通過選擇具有最大基因型頻率小于4/9的基因型頻率的SNP，可以在個(gè)體區(qū)分中更有效地選擇SNP。
在此，條件是被取代的核苷酸為A、B、C和D，其等位基因頻率分別為X、Y、Z和W。在此，X+Y+Z+W＝1，W≤Z≤Y≤X。由此1/4≤X，(1-X)/3≤Y且X+Y＜1。
其中的基因型頻率可以最大的4核苷酸取代類型中的基因型是X2和2XY。
(a)在2XY≤X2的情況中，即Y≤1/2·X時(shí)，最大基因型為X2。如上所述，由于需要基因型頻率小于4/9，因此X2＜4/9。因此，期望的等位基因頻率為Y≤1/2·X及X＜2/3，選擇這種SNP。
或者，(b)在2XY＞X2情況中，即1/2·X＜Y時(shí)，最大基因型為2XY。如上所述，由于需要基因型頻率小于4/9，因此2XY＜4/9。因此期望的等位基因頻率為1/2·X＜Y及XY＜2/9，選擇這種SNP。
符合上述(a)和(b)條件的X和Y的范圍在圖3中斜線區(qū)域示出。具有這個(gè)范圍等位基因頻率的4核苷酸取代類型SNP是較2核苷酸取代類型SNP更有助于個(gè)體區(qū)分的SNP，可以稱作具有高效力的SNP。
可以搜索上述(ii)和(iii)示出的SNP，例如從國(guó)立生物信息中心的SNP數(shù)據(jù)庫(NCBI)中登記的SNP中搜索。
希望的是從基因組的不同染色體中選擇符合條件(i)-(iii)的SNP。當(dāng)使用同一染色體上存在的SNP時(shí)，希望的是使用明顯彼此不連鎖的SNP，或者具有低概率的SNP。
另外，希望的是選擇根據(jù)上述條件選擇的多個(gè)SNP的組合，以便在從等位基因頻率計(jì)算基因型頻率中，i個(gè)所選擇的單核苷酸多態(tài)性中的每一個(gè)，假定第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性中最高基因型頻率為 (Max)n，最低基因型頻率為(Min)n，1/∏(Max)i和1/∏(Min)i分別為適當(dāng)值。
例如，假定組成群體的個(gè)體數(shù)目為U，也可以如此選擇SNP，以便當(dāng)以與U的比率表示時(shí)，每個(gè)1/∏(Max)i和1/∏(Min)i均在適當(dāng)范圍內(nèi)。1/∏(Max)i代表在選擇的SNP組合中，具有最高概率的組合的個(gè)體以每1/∏(Max)i個(gè)人一個(gè)人(one person per 1/∏(Max)I persons)的比率存在。當(dāng)1/∏(Max)i數(shù)值較低時(shí)，群體中存在許多具有所述SNP組合的個(gè)體，可以說SNP組合具有較低的個(gè)體區(qū)分能力。
另外，1/∏(Min)i表示在選擇的SNP組合中，具有最低概率的組合的個(gè)體以每1/∏(Min)i個(gè)人一個(gè)人的比率存在。當(dāng)1/∏(Min)i數(shù)值較低時(shí)，具有所述SNP組合的個(gè)體很罕見，可以說所述組合是具有高度個(gè)體區(qū)分能力的SNP組合。
經(jīng)選擇用于本發(fā)明個(gè)體區(qū)分方法中的SNP的數(shù)目i可以根據(jù)必需的區(qū)分能力確定，可以考慮到進(jìn)行確定的簡(jiǎn)便性、快速、經(jīng)濟(jì)及可靠性加以確定。
在使用根據(jù)前述條件選擇的SNP的個(gè)體區(qū)分方法中，進(jìn)一步通過從等位基因頻率計(jì)算對(duì)象個(gè)體具有的基因型頻率，將所有選擇的SNP的基因型頻率相乘，取倒數(shù)，可以計(jì)算群體中存在的對(duì)象個(gè)體具有的基因型組合的概率。使用圖4進(jìn)行解釋，當(dāng)對(duì)象個(gè)體的基因型為1:CC、2:CC、3:CT、4:CC和5:TT時(shí)，各基因型頻率的乘積是0.078×0.518×0.3942×0.314×0.2916＝0.001458，其倒數(shù)為685.7。因此，這個(gè)樣品的基因型是在每686人中有1個(gè)人存在的基因型。
例如，在100百萬群體中每10人中有1人具有的基因型情況中，即使當(dāng)對(duì)象個(gè)體與樣品的基因型一致時(shí)，它們是相同個(gè)體的可靠性也降低。相反，在基因型情況中，當(dāng)對(duì)象個(gè)體具有的基因型是罕見的基因型時(shí)，確定的可靠性增加。因此，對(duì)于個(gè)體區(qū)分而言也尤為重要的是確定群體中的存在概率，并弄清確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品的核苷酸序列是否一致的可靠性。通過這個(gè)步驟計(jì)算存在概率，可以確定個(gè)體區(qū)分結(jié)果的可靠性。
在此對(duì)已經(jīng)在上文詳細(xì)描述的本發(fā)明的個(gè)體區(qū)分方法進(jìn)行概括。首先，從要進(jìn)行區(qū)分的對(duì)象個(gè)體所屬群體中存在的SNP的組中選擇符合上述(i)-(iii)任一條件的多個(gè)SNP。分別在對(duì)象個(gè)體具有的核苷酸序列和源自樣品的核苷酸序列中確定所選擇的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的基因型。然后對(duì)比所述對(duì)象個(gè)體與樣品的經(jīng)確定的基因型，基于對(duì)比結(jié)果確定對(duì)象的核苷酸序列與樣品的核苷酸序列一致與否。
可以通過熟知的方法確定對(duì)象個(gè)體與樣品的核苷酸序列中基因型，例如通過聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增SNP位點(diǎn)及研究基因型的方法，以及分析DNA序列的方法。
通過使用根據(jù)本發(fā)明選擇的SNP，可以在需要的可靠性范圍內(nèi)使用最小數(shù)目的SNP區(qū)分個(gè)體，可以簡(jiǎn)便而快速地進(jìn)行測(cè)試，并且降低成本。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于個(gè)體區(qū)分測(cè)試的陣列。本發(fā)明的陣列是將具有與靶序列互補(bǔ)的序列的核酸探針固定在基材上。在此，靶序列是指具有如下靶序列的核酸鏈，其含有選自要區(qū)分的對(duì)象個(gè)體所屬群體中存在的一組SNP的符合上述(i)-(iii)任一條件的SNP。固定在基材上的核酸探針可以在適當(dāng)條件下與靶序列雜交。
如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)”是50％-100％互補(bǔ)，優(yōu)選100％互補(bǔ)。
固定在基材上的核酸探針可以是單一的核酸探針，或者多個(gè)不同的核酸探針。即可以固定這樣序列的核酸探針，所述序列與具有分別含有不同的SNP的靶序列的靶核酸互補(bǔ)。
另外，例如在A和T這種2核苷酸取代類型的SNP中，與A的情況中的序列及T的情況中的序列互補(bǔ)的核酸探針均可固定在陣列上，或者僅固定一個(gè)序列的探針。相似地，在3核苷酸取代類型和4核苷酸取代類型的SNP中，可以使用相應(yīng)于在各個(gè)核苷酸情況中的序列的探針，或者可以僅使用相應(yīng)于意圖被檢測(cè)的序列的探針。就核酸探針的長(zhǎng)度而言，可以適當(dāng)選擇適于固定于基材上及雜交的長(zhǎng)度，所述長(zhǎng)度可以比靶核酸的長(zhǎng)度短。例如，所述長(zhǎng)度可以是大約3-1000bp，優(yōu)選大約10-200bp。
靶核酸是這樣的核酸，其具有由存在SNP的位置上游和下游序列組成的序列。
就與陣列上的核酸探針進(jìn)行雜交的靶核酸而言，可以使用含有所述核酸的測(cè)試溶液，或者可以例如提前通過PCR擴(kuò)增靶序列位點(diǎn)、切下并使用。因此，靶核酸的長(zhǎng)度可以任意確定，或者根據(jù)引物設(shè)計(jì)而可以是例如大約30-500bp。通過調(diào)整靶核酸的長(zhǎng)度為合適長(zhǎng)度，可以增加雜交效果。
可用于本發(fā)明中的基材可以是核酸探針可以固定于其上的基材，可呈孔狀，具有凹槽或平表面的平板，或者由無孔的硬或半硬材料制成的立體形狀如球形。所述基材可以(不限于)由含硅石基材制造，如由硅、玻璃、石英玻璃和石英，或者塑料或聚合物如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料制成。
在本發(fā)明的陣列中，作為檢測(cè)由于固定在基材上的核酸探針與靶核酸的雜交而產(chǎn)生的雙鏈體存在的手段，可以使用電化學(xué)方法，但不限于。
可以使用已知的雙鏈體識(shí)別物質(zhì)通過電化學(xué)方法檢測(cè)雙鏈核酸。所述雙鏈體識(shí)別物質(zhì)(不限于)是Hoechster 33258、吖啶橙、奎納克林、道諾霉素、金屬嵌入劑(metallointercalater)、雙嵌入劑(bisintercalater)如雙吖啶等，可以使用三嵌入劑(trisintercalater)和多嵌入劑(polyintercalater)。進(jìn)一步地，可以使用電化學(xué)活性金屬?gòu)?fù)合物例如二茂鐵、biogen等修飾這些嵌入劑?；蛘撸梢允褂闷渌阎p鏈體識(shí)別物質(zhì)。
在通過電化學(xué)方法檢測(cè)雙鏈核酸的方法中，在基材上放置一個(gè)電極，將核酸探針固定在該電極上。所述電極不特別限于但可以是碳電極如石墨、玻璃碳、熱解石墨、碳粉和碳纖維，貴金屬電極如鉑金、鉑黑、金、鈀、和銠，及氧化物電極如氧化鈦、氧化錫、氧化錳和氧化鉛，半導(dǎo)體電極如Si、Ge、ZnO、CdS、TiC2和GaAs、鈦等。如果需要，這些電極可以用導(dǎo)電聚合物包被，或者可以用分子膜包被，或者可以用其它表面處理劑處理。
可以通過已知方法固定核酸探針。例如，核酸探針可以通過間隔物固定在電極上，即將所述間隔物固定在電極上，并將核酸探針固定在所述間隔物上?；蛘?，預(yù)先將間隔物與核酸探針結(jié)合，然后通過間隔物將探針固定在電極上。或者，可以通過已知方法在電極上合成間隔物和核酸探針。另外，為了將核酸探針與間隔物固定，可以將所述間隔物直接固定在經(jīng)共價(jià)鍵、離子鍵或物理吸附處理或未處理的電極表面上?；蛘?，可以使用有助于通過間隔物固定核酸探針的接頭劑。另外，電極可以用封閉劑處理以防止測(cè)試核酸與電極及接頭劑的非特異性結(jié)合。另外，本發(fā)明中使用的接頭劑和封閉劑可以是有利于進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的物質(zhì)。
具有不同核苷酸序列的核酸探針可分別通過間隔物固定在不同的電極上。
進(jìn)一步地，與其它普通電化學(xué)檢測(cè)方法一樣，可以提供具有輔助電極和/或參考電極的陣列。當(dāng)安排參考電極時(shí)，可以應(yīng)用例如普通參考電極如銀/氯化銀電極和汞/氯化汞電極。
可例如如下文所述通過陣列檢測(cè)靶核酸。從對(duì)象如個(gè)體(如動(dòng)物包括人)、組織和細(xì)胞中收集的樣品中提取核酸成分作為樣品核酸。如果需要，對(duì)所得樣品核酸可以進(jìn)行處理如逆轉(zhuǎn)錄、延伸、擴(kuò)增和/或酶處理。將根據(jù)需要已經(jīng)預(yù)處理的樣品核酸與固定在核酸探針固定基材上的核酸探針接觸，在允許合適雜交的條件下進(jìn)行反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不同情況如靶序列中含有的核苷酸種類、間隔物的種類和核酸探針固定基材上安置的核酸探針、樣品核酸的種類及其狀態(tài)而適當(dāng)?shù)剡x擇這種合適條件。
雜交反應(yīng)可例如在如下條件下進(jìn)行。作為雜交反應(yīng)溶液，使用離子濃度在0.01-5范圍內(nèi)及pH在5-10范圍內(nèi)的緩沖液。向這個(gè)溶液中可以加入雜交促進(jìn)劑硫酸葡聚糖，以及鮭精DNA、牛胸腺DNA，及表面活性物質(zhì)如EDTA。向其中加入樣品核酸，將其在90℃或更高溫度加熱變性。在核酸變性后或者在快速冷卻至0℃之后，立即將固定了核酸探針的基材插入這個(gè)溶液中。或者，也可以通過向基材中滴加所述溶液而進(jìn)行雜交反應(yīng)。
在反應(yīng)期間，反應(yīng)速度可以通過如攪拌和搖動(dòng)等方法加快。反應(yīng)溫度在例如10℃-90℃范圍內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間不少于1分鐘直至接近過夜。在雜交反應(yīng)后，洗滌電極。使用的洗滌溶液例如是離子濃度為0.01-5及pH為5-10的緩沖液。當(dāng)樣品核酸中存在含有靶序列的靶核酸時(shí)，其與核酸探針雜交在基材上產(chǎn)生雙鏈的核酸。
隨后，通過電化學(xué)方法檢測(cè)雙鏈的核酸。在常用的方法中，將基材在雜交后洗滌，然后雙鏈體識(shí)別物質(zhì)對(duì)電極表面上形成的雙鏈部分起作用，由此產(chǎn)生的信號(hào)通過電化學(xué)方法測(cè)量。
雙鏈體識(shí)別物質(zhì)的濃度根據(jù)其種類不同而不同，通常使用范圍是1ng/mL至1mg/mL。在此基礎(chǔ)上，可以使用離子濃度為0.001-5及pH為5-10的緩沖液。
電化學(xué)測(cè)量以例如通過應(yīng)用不低于雙鏈體識(shí)別物質(zhì)電化學(xué)起反應(yīng)的電壓的電壓及測(cè)量得自所述雙鏈體識(shí)別物質(zhì)的反應(yīng)電流值而進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上，電壓可以恒定速度掃描或者以脈沖方式應(yīng)用。在進(jìn)行測(cè)量時(shí)，使用如恒電位儀、數(shù)字多用表和信號(hào)發(fā)生器等裝置控制電流和電壓。再者，基于所得電流值，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算靶核酸濃度。
使用前述陣列通過雜交反應(yīng)檢測(cè)的靶核酸的序列是測(cè)試個(gè)體和樣品具有的核苷酸序列。從而可以確定每個(gè)樣品含有的核苷酸序列中選擇的SNP的基因型。
在確定了被區(qū)分個(gè)體和樣品各自的基因型之后，將其進(jìn)行對(duì)比，確定其是否一致。另外，基于所用SNP的基因型頻率，計(jì)算所述個(gè)體或樣品的基因型存在比率，確定可靠性。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了一種具有前述陣列的個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置。在所述裝置中，適當(dāng)?shù)厥褂没臉雨嚵?，在此將其也稱作芯片。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了通過個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置實(shí)施個(gè)體區(qū)分測(cè)試的系統(tǒng)。
本發(fā)明的個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置配置有本發(fā)明的陣列，在所述陣列的基材上沿藥物溶液或空氣流動(dòng)方向的流體通道，在所述基材上沿流體通道的并且其上固定了所述探針的多個(gè)工作電極，賦予與工作電極之間電勢(shì)差的輔助電極，所述工作電極位于相應(yīng)于工作電極的流體通道的內(nèi)周表面(intemal circumferential surface)上，每一個(gè)的排列都使得其位于面對(duì)所述基材表面的第一表面，將檢測(cè)電壓反饋給工作電極的參考電極，所述參考電極位于相應(yīng)于工作電極的流體通道的內(nèi)周表面上，每一個(gè)的排列都使得其位于面對(duì)所述基材表面的第二表面，入口，其開在所述流體通道內(nèi)，使藥物溶液或空氣從流體通道的上游流至流體通道內(nèi)，出口，其開在流體通道內(nèi)，使藥物溶液或空氣從流體通道流至流體通道的下游，用于向所述流體通道中注入測(cè)試溶液的注射口。
另外，本發(fā)明的個(gè)體區(qū)分測(cè)試系統(tǒng)配置有個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置，與入口連通的第一管道系統(tǒng)，所述第一管道系統(tǒng)通過入口使藥物溶液或空氣進(jìn)入所述流體通道中，供應(yīng)系統(tǒng)，其具有第一閥以控制第一管道系統(tǒng)的藥物溶液或空氣的流速，與出口連通的第二管道系統(tǒng)，所述第二管道系統(tǒng)通過出口使藥物溶液或空氣從所述流體通道中排出，第二閥，其控制第二管道系統(tǒng)中藥物溶液或空氣的流速，在第二管道系統(tǒng)中的排出系統(tǒng)，所述排除系統(tǒng)具有從流體通道中抽吸藥物溶液或空氣的泵，具有賦予工作電極與輔助電極之間的電勢(shì)差的電壓施加單元的測(cè)量系統(tǒng)，控制陣列溫度的溫度控制系統(tǒng)，用于控制所述供應(yīng)系統(tǒng)的第一閥、排出系統(tǒng)的第二閥和泵、測(cè)量系統(tǒng)的電壓施加單元的控制裝置，及溫度控制系統(tǒng)，其檢測(cè)工作電極或輔助電極的電化學(xué)反應(yīng)信號(hào)并將這種電化學(xué)反應(yīng)信號(hào)作為測(cè)量數(shù)據(jù)加以貯存，計(jì)算機(jī)，其告知控制裝置控制條件參數(shù)以控制所述控制裝置，同時(shí)基于測(cè)量數(shù)據(jù)實(shí)施核苷酸序列分析處理，并確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性。
本發(fā)明的個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案在下文通過圖示加以解釋。
圖5示出本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中的個(gè)體區(qū)分測(cè)試系統(tǒng)的完整構(gòu)造圖。如圖5示出，個(gè)體區(qū)分測(cè)試系統(tǒng)1由如下結(jié)構(gòu)構(gòu)成芯片夾(chipcartridge)11(個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置)；測(cè)量系統(tǒng)12，其與這個(gè)芯片夾11電連接；流動(dòng)系統(tǒng)13，其與芯片夾11中的流體通道通過界面部分物理連接；溫度控制系統(tǒng)14，其控制芯片夾11的溫度。
這些測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14由控制裝置15控制。控制裝置15與計(jì)算機(jī)16電連接，控制裝置15由這個(gè)計(jì)算機(jī)16的程序控制。在這個(gè)實(shí)施方案中，芯片夾11、測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14稱作測(cè)量單元10。
配置有其上固定了核酸探針的芯片21的印刷電路板22附于所用芯片夾11上。核酸探針固定在芯片21的工作電極上。導(dǎo)入芯片21的小池中的樣品(測(cè)試溶液)含有待測(cè)試的核酸。這個(gè)實(shí)施方案的個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置確定樣品(測(cè)試溶液)中是否含有靶核酸，通過將靶核酸與核酸探針雜交并監(jiān)測(cè)在導(dǎo)入緩沖液和嵌入劑之后所述雜交反應(yīng)的存在與否而進(jìn)行確定。
圖6A-6D示出芯片夾11的詳細(xì)構(gòu)造。圖6A示出俯視圖，圖6B示出以B-B方向所見圖示，圖6C是以C-C方向所見局部透視截面圖，圖6D示出支持物111圖示，其是以D-D方向從后部(from a back)所見芯片夾11的一個(gè)組成元件。芯片夾體110由支持物111和芯片夾上蓋112組成，所述支持物111從下面支持印刷電路板22，蓋子112從上面支持、固定和支撐印刷電路板22，與支持物111聯(lián)合。
在芯片夾上蓋112的側(cè)面有兩個(gè)開口，界面部分113a與一個(gè)開口連接，界面部分113b與另一個(gè)開口連接。這些界面部分113a和113b作為流動(dòng)系統(tǒng)13和芯片夾11的界面。在這些界面部分113a和113b的內(nèi)部，分別具有流體通道114a和114b。藥物溶液或空氣從流體通道系統(tǒng)13的上游通過流體通道114a流進(jìn)芯片夾11內(nèi)部。芯片夾11中的樣品、藥物溶液和空氣通過流體通道114b排出至流體通道系統(tǒng)13下游。
在圖6A-6C中，流體通道114a和114b以虛線示出。這些流體通道114a和114b通過界面113a和113b與芯片夾上蓋112的內(nèi)部連通，并進(jìn)一步與小池115連通。小池115是芯片21與導(dǎo)入這個(gè)芯片21中的各種溶液產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)的地方。這個(gè)115周圍由芯片21、密封材料24a、和芯片夾上蓋112密閉，條件是配置有芯片21的印刷電路板22的四角用基材固定螺絲25固定在這個(gè)芯片夾11的芯片夾上蓋112上。在配置有芯片21的印刷電路板22固定在芯片夾上蓋112上的情況中，印刷電路板22與支持物111和芯片夾上蓋112一起，支撐密封材料24a。再者，芯片夾上蓋112用上蓋固定螺絲117固定。從而，指定了與流體通道114b連通、從流體通道114a經(jīng)由小池115的各種藥物溶液和空氣的注射和排出途徑。芯片21用密封樹脂23密封于印刷電路板22。
芯片夾上蓋112位于小池115上面，有入口116a和出口116b。116a的流動(dòng)口從側(cè)面穿透至芯片夾上蓋112的底面，在小池開口部分115a的芯片夾上蓋112底面開口。出口116b從另一側(cè)面穿透至芯片夾上蓋112的底面，在小池開口部分115b的芯片夾上蓋112底面開口。通過入口116a與流體通道114a及出口116b與流體通道114b的連通，流體通道114a與小池115及流體通道114b與小池115連通在一起。
電連接器22a位于印刷電路板22表面，與小池115隔開。電連接器22a與印刷電路板22的基體的引線框電連接(electricallyconnected)。另外，基體的這個(gè)引線框通過引線與芯片21各個(gè)電極電連接。通過測(cè)量系統(tǒng)12的終端與這個(gè)電連接器22a的連接，在芯片21中獲得的電信號(hào)可以通過在印刷電路板22預(yù)定位置安置的預(yù)定終端及進(jìn)一步通過電連接器22a輸出至測(cè)量系統(tǒng)12。
如圖6D示出，支持物111為U形，在其中心具有凹部(notchpart)111a。這個(gè)凹部111a形狀比印刷電路板22小，比芯片21大。由此，溫度控制系統(tǒng)14不用支持物111而可以與芯片21接觸，同時(shí)保留支持物111支持印刷電路板22的功能。117a是一螺旋口，在其中固定上蓋固定螺絲117。
溫度控制系統(tǒng)14調(diào)節(jié)芯片21的溫度，例如使用Peltier元件。由此，可以將在±0.5℃范圍控制溫度。核酸反應(yīng)通常在相對(duì)接近室溫的溫度進(jìn)行。因此，僅用加熱儀控制溫度穩(wěn)定性較差。另外，由于必需通過溫度模式控制核酸的反應(yīng)，因此還必需一種冷卻裝置。在這方面，在Peltier元件中，因?yàn)榭梢酝ㄟ^改變電流的方向而進(jìn)行任何加熱和冷卻，因此這個(gè)元件是最理想的。
圖7示出在用上蓋固定螺絲117固定之前的支持物111和芯片夾上蓋112。如圖7示出，將四角用芯片21包裝的印刷電路板22用基材固定螺絲25固定在芯片夾上蓋112上。將密封材料24a集成至芯片夾上蓋112中。由密封材料24a和芯片夾上蓋112圍繞的小池115限定在芯片21上。再者，芯片夾上蓋112用上蓋固定螺絲117固定在支持物117上。另外，基材固定螺絲25可以從印刷電路板22的后面或表面固定對(duì)象。如此，通過將印刷電路板22固定在芯片夾上蓋112上，可以確定保留芯片21、密封材料24a與芯片夾上蓋112之間的粘附性。
圖8示出用芯片21包裝的印刷電路板22的詳細(xì)構(gòu)造。如圖8示出，芯片21用密封樹脂23密封在印刷電路板22上。在芯片21上具有工作電極501。這個(gè)工作電極501沿著圖8箭頭所示藥物溶液和空氣的流動(dòng)方向一個(gè)接一個(gè)地排列。藥物溶液和空氣的流動(dòng)方向通過用芯片夾上蓋112和密封材料24a關(guān)閉而限定，沿著芯片21上工作電極501周圍箭頭所示方向留有間隔。虛線所示區(qū)域是安置密封材料24a的區(qū)域。將多個(gè)工作電極501適當(dāng)?shù)嘏帕性谶@個(gè)曲線指定區(qū)域中。
電連接器22a安置在印刷電路板22的末端。將芯片21的工作電極501及電連接器22a用印刷電路板22表面上的引線框經(jīng)電連接在一起。芯片21和測(cè)量系統(tǒng)12的各個(gè)電極可以通過連接測(cè)量系統(tǒng)12的信號(hào)接口而與電連接器22a電連接。
圖9A是在圖6A中以D-D方向所見小池115及與小池115連通的藥物溶液供應(yīng)系統(tǒng)截面圖，圖9B是小池115附近的俯視圖。如圖9A示出，在芯片夾上蓋112的底部具有高度為d42的流體通道1樣凸起部分112a。密封材料24a預(yù)先印刷在這個(gè)流體通道1樣凸起部分112a中，例如通過絲網(wǎng)印刷術(shù)，將該部分與密封材料24a集成在一起。由此，小池115可以不用配置密封材料24a和芯片夾上蓋112而限定，裝配小池115的步驟得以簡(jiǎn)便化。密封材料24a固定在流體通道1樣凸起部分112a與芯片21之間。由此，在芯片夾上蓋112與芯片21之間限定一個(gè)密閉的空間。這個(gè)密閉的空間是作為反應(yīng)室的小池115，在此樣品或藥物溶液與探針之間產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)。小池115的底部是芯片21。小池115的側(cè)面是芯片夾112上流體通道1樣凸起部分112及側(cè)面的密封材料24a。小池115的上面是芯片夾112的位置，其中沒有流體通道1樣凸起部分112a。由此，限定了其中圍住了除了小池開口部分115a和115b之外的實(shí)體的密閉空間，保持芯片21與蓋子120之間不透液體。這個(gè)小池115的高度為大約0.5mm。在此，所述高度為大約0.5mm而不限于此，根據(jù)需要而可以是0.1-3mm范圍。
當(dāng)從上面看小池115時(shí)，具有其中排列著如圖9B所示細(xì)長(zhǎng)流體通道601的形狀。在圖9B中，具有與流體通道相同寬度的流體通道601從入口116a側(cè)小池開口部分115a直至小池開口部分115b。這個(gè)流體通道601由檢測(cè)流體通道601a、開口連接流體通道601b和601c及流體通道連接流體通道601d組成。檢測(cè)流體通道601a是其中排列工作電極501的多個(gè)流體通道。開口連接流體通道601b將與小池開口部分115a最近的檢測(cè)流體通道601a與小池開口部分115a連接起來。開口連接流體通道601c將與小池開口部分115b最近的檢測(cè)流體通道601a與小池開口部分15b連接在一起。流體通道連接流體通道601d將彼此相鄰的檢測(cè)流體通道601a的末端連接在一起，使得藥物溶液或空氣以一個(gè)方向流至多個(gè)檢測(cè)流體通道中。由此，已經(jīng)流進(jìn)某一檢測(cè)流體通道601a中的藥物溶液或空氣流入流體通道連接流體通道601d中，再以相同方向流入鄰近的另一檢測(cè)流體通道601a中。另外，所有流體通道601a-601d均具有相同的寬度和橫截面，流體通道的寬度為0.5-10mm。
在圖9B，虛線圍繞的且其中未形成流體通道601的區(qū)域是其中具有流體通道1樣凸起部分112a和密封材料24a的區(qū)域，與芯片21和密封材料24a接觸。其中形成流體通道601的區(qū)域是其中無流體通道1樣凸起部分112a和密封材料24a的區(qū)域。入口116a和出口116a分別從小池115上面以與小池底部接近垂直的方向向上延伸到指定高度。入口116a和出口116b從中心向彼此遠(yuǎn)離的方向在其流體通道中進(jìn)一步彎曲，分別與流體通道114a和114b連接。
出口116b以與小池底面大致垂直的方向延伸至指定高度，并且以遠(yuǎn)離小池115中心的方向彎曲成接近直角，在彎曲部位分成兩條通路。一條通路穿過芯片夾上蓋112表面，與注射口119連通。由此，樣品經(jīng)注射口119通過出口116b注入小池115中。注射口119的中心軸和出口116b的中心軸幾乎一致，注射口119的孔徑大于流動(dòng)口116b的孔徑。另外，注射口119可以用其附近的蓋子120覆蓋。由此，不用注射口119的情況下，當(dāng)藥物溶液在流體通道114b中從流體通道114a通過小池115至流體通道114b中循環(huán)時(shí)，可以而阻止藥物溶液通過注射口119流出，而藥物溶液途徑被保留。另外，在蓋子120上有密封材料121，通過密封注射口119，可以防止藥物溶液的輕微泄漏。在圖9A中，盡管未特別示出，當(dāng)密封材料121的深度使得注射口119的通道被完全阻塞，僅剩下從出口116b與流體通道114b連接的通道時(shí)，可以減少藥物溶液或空氣在注射口119的滯留。
通過上述構(gòu)造，藥物溶液可以圖9A中箭頭所示方向按流體通道114a、入口116a、小池115(流體通道601)、出口116b和流體通道114b順序流動(dòng)。另外，以箭頭所示方向?qū)悠吠ㄟ^注射口119注入，通過出口116b導(dǎo)入小池115中。因此，樣品是從流出側(cè)注入，注射途徑與藥物溶液的供應(yīng)流向相反。由此，在洗滌步驟中，可以增強(qiáng)樣品的洗滌效力。
圖9C示出入口116a、出口116b與流體通道601之間的最佳位置關(guān)系。入口116a的外周與開口連接流體通道601c的外周相接觸。此外，出口116b的外周原理開口連接流體通道601c的外周。由此，在藥物溶液或空氣流入的基礎(chǔ)上，可以減少易于在入口116a的開口角落附近產(chǎn)生的藥物溶液剩余或空氣剩余，同時(shí)可以降低在藥物溶液或空氣排出時(shí)在出口116b角落產(chǎn)生的流速分散，及可以減少剩余的空氣。另外，如圖中虛線所示，當(dāng)入口116a的形狀構(gòu)建為從通過重疊開口連接流體通道601b的外周與入口116a的外周而從開口連接流體通道601b突出時(shí)，可以獲得相似的作用。當(dāng)然，入口116a與出口116b的流體通道601之間的位置關(guān)系不限于圖9C所示關(guān)系。在入口116a側(cè)，認(rèn)為與開口連接流體通道601b的連接有三種情況，其一是這兩個(gè)口的外周是接觸的，其二它們是重疊的，其三它們是分離的。在出口116b側(cè)，認(rèn)為與開口連接流體通道601C的連接有三種情況，其一是這兩個(gè)口是基礎(chǔ)的，其二它們是重疊的，其三它們是分離的。
圖10和11示出小池115的詳細(xì)構(gòu)造。圖10A是其中小池被連接小池開口部分115a和115b的直線切割的橫截面，圖10B示出其中芯片夾上蓋112固定于芯片21的外觀，圖11是小池115的俯視圖。如圖10A所示，多個(gè)檢測(cè)流體通道601a以大約相同的間隔排列。當(dāng)藥物溶液或空氣從后向前流入圖10A左側(cè)所示檢測(cè)流體通道601a的橫截面時(shí)，其以相反方向流入中間的檢測(cè)流體通道601a中，即其從前向后流入，其進(jìn)一步以相反方向流入左側(cè)所示檢測(cè)流體通道601a中，即其以從后向前方向流動(dòng)。如此，相鄰的檢測(cè)流體通道601a的藥物溶液或空氣流動(dòng)方向是相反的。當(dāng)這些檢測(cè)流體通道601a以與藥物溶液或空氣的流動(dòng)方向垂直的橫截面切割時(shí)，均形成相同的橢圓形橫截面，電極排列相同。
檢測(cè)流體通道601a的底面是芯片21。每一個(gè)工作電極501排列在檢測(cè)流體通道601a的底面上。檢測(cè)流體通道601a的側(cè)面通過流體通道樣凸出部分112a限定，其從芯片夾上蓋112和密封材料24a上凸起。參考電極503分別固定在這個(gè)流體通道的側(cè)面上，即流體通道樣凸出部分112a的側(cè)面上，達(dá)到自流體通道底部起的預(yù)定高度。如此，將多個(gè)參考電極503置于與芯片表面平行的平面上并面向芯片表面，將此平面置于比其上安置了工作電極501的平面更高的平面上。檢測(cè)流體通道601a的上面是芯片夾上蓋112的底面，所述蓋子上沒有流體通道樣凸出部分112a。將每個(gè)輔助電極502固定在這個(gè)流體通道的上面。如此，將多個(gè)輔助電極502置于與芯片底部平行的平面上并面向芯片表面，將該平面置于比其上安置了工作電極502或參考電極503的平面更高的平面上。如此，工作電極501、輔助電極502和參考電極503分別立體地排列在不同平面上。
將密封材料24a預(yù)先經(jīng)印刷固定在芯片夾上蓋112的流體通道樣凸出部分112a上。因此，當(dāng)裝配小池115時(shí)，集成了密封材料24a的芯片夾上蓋112以圖10B箭頭所示方向向芯片21推進(jìn)。由此，具有圖10A所示密閉外周的流體通道601通過密封材料24a限定于芯片夾上蓋112和芯片21之間。
如圖11所示，由工作電極501、輔助電極502和參考電極503組成的三個(gè)電極以箭頭所示藥物溶液或空氣流動(dòng)方向以相等間隔沿著每個(gè)流體通道601排列。這三個(gè)電極排列在與藥物溶液或空氣流體通道方向垂直的平面上。
在圖11的實(shí)例中，不論流體通道的方向如何，當(dāng)從上方觀察時(shí)工作電極501、輔助電極502與參考電極503之間的位置關(guān)系是相同的矩陣(matrix)狀態(tài)(不限于這種狀態(tài))。如圖12所示，相鄰的檢測(cè)流體通道601a中流體通道橫截面與藥物溶液或空氣的流動(dòng)方向可以是左右相反的。在這種情況中，在任何檢測(cè)流體通道601a中，輔助電極502朝流動(dòng)方向排列流體通道右側(cè)側(cè)面上。由此，可以實(shí)現(xiàn)在藥物或空氣的流動(dòng)方向中的所述三個(gè)電極的排列均具有相同形狀。關(guān)于工作電極501和輔助電極502，當(dāng)其在橫截面中未以左右對(duì)稱位置排列時(shí)，其在相鄰檢測(cè)流體通道601a中可以以左右相反的位置排列，如參考電極503那樣。
如此，每個(gè)工作電極501、輔助電極502和參考電極503以三個(gè)電極一組的形式以相同橫截面形狀流體通道沿著藥物溶液或空氣的流動(dòng)方向安置，由此這三個(gè)電極的位置關(guān)系是相同的，流體通道形狀是相同的。當(dāng)從工作電極501觀察時(shí)，流體通道底面、側(cè)表面和上表面相對(duì)于工作電極501的方向，及工作電極501與相應(yīng)的輔助電極502和參考電極503的位置關(guān)系是相同的。由此改善了通過三個(gè)電極的每一個(gè)檢測(cè)到的電化學(xué)信號(hào)的一致性。因此改善了檢測(cè)可靠性。
在此，輔助電極502和參考電極503的排列使得相對(duì)于相應(yīng)工作電極501為分離的，但不限于這種排列。輔助電極502或參考電極503可具有多個(gè)電極在任何情況中均連接的構(gòu)造方式。在這種情況中，每個(gè)電極中最接近每個(gè)工作電極的區(qū)域發(fā)揮輔助電極或參考電極功能。另外，流體通道的橫截面形狀不限于圖10A所示。
然后，在圖13的逐步橫截面圖中解釋生產(chǎn)前述芯片21和印刷電路板22的方法。洗滌硅基材211，將硅基材211加熱在其表面上形成熱氧化的薄膜212?？梢允褂貌ＡЩ拇婀杌?11。然后通過噴射(sputtering)將Ti薄膜213置于整個(gè)基材上，例如薄膜厚度為50nm，然后通過噴射將Au薄膜214置于整個(gè)基材上，例如薄膜厚度為200nm。在此，優(yōu)選Au薄膜214具有<111>方向的晶體狀平面方向。然后，將光致抗蝕劑薄膜210塑型(圖13A)以保護(hù)以后成為電極或布線的區(qū)域，蝕刻Au薄膜214和Ti薄膜213(圖13B)。在這個(gè)實(shí)施方案中，使用KI/I2混合溶液蝕刻Au薄膜214，NH4OH/H2O2混合溶液用于蝕刻Ti薄膜。為了蝕刻AU薄膜214，有使用稀釋的王水的方法，及用離子蝕刻方法。相似地，為了蝕刻Ti薄膜213，可以應(yīng)用使用氫氟酸或緩沖的氫氟酸濕法腐蝕處理方法，及使用得自CF4/O2混合氣體的等離子體干性蝕刻的方法。
然后，通過氧灰化除去光致抗蝕劑薄膜210(圖13C)。除去光致抗蝕劑薄膜210的步驟可以聯(lián)合使用溶劑、抗蝕劑剝離器或者使用氧灰化步驟進(jìn)行 然后，將光致抗蝕劑215包被在整個(gè)表面上，塑型以使電極部分和焊盤露出(圖13D)。之后進(jìn)行硬烤(hard baking)，例如在200℃在清潔的烤箱中烘烤30分鐘。在硬烤方法中，可以使用熱平板或者可以適當(dāng)使用處理?xiàng)l件。在此，選擇光致抗蝕劑薄膜215作為保護(hù)膜，但是除了光致抗蝕劑之外，也可以使用有機(jī)薄膜如聚酰亞胺BCB(苯并環(huán)丁烯(benzocyclobutene))等?；蛘?，可以使用無機(jī)薄膜如SiO、SiO2和SiN。在這種情況中，可以通過打開光致抗蝕劑形成薄膜以保護(hù)電極部分、沉積SiO等，并通過剝離(lift off)方法保護(hù)除了電極部分之外的區(qū)域，或者在整個(gè)表面上形成SiN薄膜等，形成光致抗蝕劑薄膜215以僅打開電極部分，通過蝕刻除去電極上SiN薄膜，最后剝離光致抗蝕劑薄膜215。
然后，通過最后切割以分割成芯片，清潔電極表面，用CF4/O2混合的等離子體處理。由此，獲得芯片21。將芯片21安置在用電連接器22包裝的印刷電路板22上。將芯片21的焊盤與印刷電路板22上的引導(dǎo)線通過引線接合法連接。之后引線接合部分用密封樹脂23保護(hù)。通過上述步驟，可以生產(chǎn)出用芯片21包裝的印刷電路板22。
生產(chǎn)的芯片21的俯視圖示于圖14。如圖14示出，在芯片表面的中心附近有一個(gè)以上的工作電極501。另外，將其中形成了工作電極501的區(qū)域置于其中形成了虛線所示密封材料24a的區(qū)域中。另外，焊盤221排列在芯片外周部分。每個(gè)工作電極501通過配線222與焊盤221連接。盡管在圖14中未示出，但是將其中形成了焊盤221的外周部分用前述密封樹脂23密封。
然后，使用圖15解釋流動(dòng)系統(tǒng)13的特殊構(gòu)造。將這個(gè)流動(dòng)系統(tǒng)13粗略分為芯片夾11的流體通道114a上的供應(yīng)系統(tǒng)和流體通道114b上的排出系統(tǒng)。將空氣供應(yīng)源401與管道系統(tǒng)404的最上游連接。在這個(gè)空氣供應(yīng)源401的下游，具有止回閥402以防止除了空氣之外的藥物溶液通過管道系統(tǒng)404反向流入空氣供應(yīng)源401中，在接下來的下游側(cè)具有雙向電磁閥403(Va)。由此，控制空氣從管道系統(tǒng)404流入芯片夾11中的流動(dòng)速度。
將供應(yīng)作為藥物溶液之一的Milli Q水的Milli Q水供應(yīng)源411與管道系統(tǒng)414連接。在這個(gè)Milli Q水供應(yīng)源411的下游側(cè)具有止回閥412，以防止除了Milli Q水之外的藥物溶液或空氣反向流入MilliQ水供應(yīng)源中，在接下來的下游側(cè)具有三向電磁閥413(Vwa)。該三向電磁閥413在管道系統(tǒng)404與管道系統(tǒng)415的連通及管道系統(tǒng)414與管道系統(tǒng)415之間開關(guān)。即在三向電磁閥413關(guān)閉時(shí)，管道系統(tǒng)404與管道系統(tǒng)415連通，在該閥打開時(shí)，管道系統(tǒng)414與管道系統(tǒng)415連通。由此，可以轉(zhuǎn)換空氣與水Milli Q供應(yīng)至管道系統(tǒng)415。供應(yīng)作為藥物溶液之一的緩沖液的緩沖液供應(yīng)源421與管道系統(tǒng)424連通。在這個(gè)緩沖液供應(yīng)源421的下游具有止回閥422，以防止除了緩沖液之外的藥物溶液或空氣反向流入緩沖液供應(yīng)源421中，在接下來的下游具有三向電磁閥423(Vba)。這個(gè)三向電磁閥423在管道系統(tǒng)424與管道系統(tǒng)425的連通及管道系統(tǒng)415與管道系統(tǒng)425的連通之間開關(guān)。即當(dāng)電磁閥423關(guān)閉時(shí)，管道系統(tǒng)415與管道系統(tǒng)425連通，當(dāng)這個(gè)閥打開時(shí)，管道系統(tǒng)424與管道系統(tǒng)425連通。由此，可以轉(zhuǎn)換將緩沖液供應(yīng)至管道系統(tǒng)425及空氣或Milli Q水的供應(yīng)。
供應(yīng)作為藥物溶液之一的嵌入劑的嵌入劑供應(yīng)源431與管道系統(tǒng)434連通。在這個(gè)嵌入劑供應(yīng)源431的下游有一個(gè)止回閥432，防止除了嵌入劑之外的藥物溶液或空氣反向流入嵌入劑供應(yīng)源431中，在接下來的下游具有一個(gè)三向電磁閥433(Vin)。這個(gè)三向電磁閥在管道系統(tǒng)434與管道系統(tǒng)435的連通及管道系統(tǒng)425與管道系統(tǒng)435的連通之間開關(guān)。即在這個(gè)三向電磁閥433關(guān)閉時(shí)，管道系統(tǒng)425與管道系統(tǒng)435連通，在其打開時(shí)，管道系統(tǒng)434與管道系統(tǒng)435連通。由此，可以轉(zhuǎn)換供應(yīng)至管道系統(tǒng)435的嵌入劑及空氣、Milli Q水或緩沖液的供應(yīng)。
如上所述，在空氣或藥物供應(yīng)系統(tǒng)中，通過控制雙向電磁閥403或三向電磁閥413、423和433，可以轉(zhuǎn)換空氣、Milli Q水、藥物溶液如緩沖液和嵌入劑通過管道系統(tǒng)435供應(yīng)至芯片夾11中，并且可以控制供應(yīng)的空氣或這些藥物溶液的流速。在管道系統(tǒng)435的上游連通前述三向電磁閥433，在其下游連通三向電磁閥441(Vcbin)。通過三向電磁閥441，管道系統(tǒng)435可以分成管道系統(tǒng)440和側(cè)支的管道系統(tǒng)446。三向電磁閥441如下開關(guān)在關(guān)閉時(shí)，管道系統(tǒng)435與側(cè)支管道系統(tǒng)466連通，在其打開時(shí)，管道系統(tǒng)435與管道系統(tǒng)440連通。另外，三向電磁閥445如下開關(guān)在其關(guān)閉時(shí)，側(cè)支管道系統(tǒng)446與管道系統(tǒng)450連通，在其打開時(shí)，管道系統(tǒng)440與管道系統(tǒng)450連通。通過這些三向電磁閥441和445，可以在側(cè)支管道系統(tǒng)446與管道系統(tǒng)440之間轉(zhuǎn)換各種藥物溶液與空氣的供應(yīng)。
在管道系統(tǒng)440中，朝向下游依次可見三向電磁閥441、雙向電磁閥442(Vlin)、芯片夾11、液體傳感器443、雙向電磁閥444(Vlout)及三向電磁閥445(Vcbout)。雙向電磁閥442與相應(yīng)于芯片夾11的流入系統(tǒng)的流體通道114a連通，雙向電磁閥444與相應(yīng)于芯片夾11的排出系統(tǒng)的流體通道114b連通。由此，藥物溶液或空氣通過管道系統(tǒng)440供應(yīng)至芯片夾11的流入系統(tǒng)，這些藥物溶液和空氣可以從芯片夾11的排出系統(tǒng)排出。另外，通過雙向電磁閥442和444，可以控制在此通道中作為流動(dòng)溶液和排出溶液的藥物溶液或空氣的流速。另外，通過液體傳感器443，可以監(jiān)測(cè)流入芯片夾11中的藥物溶液的流速，或者監(jiān)測(cè)從芯片夾11排出的藥物溶液的流速。
在管道系統(tǒng)450中，朝向下游依次可見三向電磁閥445、雙向電磁閥451(Vvin)、折算壓力區(qū)域452、雙向電磁閥453(Vout)、流動(dòng)泵454及三向電磁閥455(Vww)。雙向電磁閥451和453防止藥物溶液或空氣反向流入折算壓力區(qū)域452周圍的通道中。流動(dòng)泵454由管泵組成，特征在于當(dāng)從芯片夾11中觀察時(shí)其位于排出側(cè)(下游側(cè))的排出系統(tǒng)中。即通過使用管泵使得藥物溶液與除了管壁之外的機(jī)械裝置不接觸，這樣可以防止污染。另外，通過抽吸作用為芯片夾11供應(yīng)藥物溶液或空氣及從芯片夾11中排出藥物溶液或空氣，不僅可以在芯片夾11內(nèi)部平穩(wěn)地進(jìn)行藥物溶液與空氣之間的置換，而且甚至當(dāng)管道系統(tǒng)偶然松開時(shí)或者當(dāng)芯片夾11從管道系統(tǒng)440中滑出時(shí)，也不會(huì)發(fā)生液體泄漏。由此改善了裝置裝備的穩(wěn)定性。
當(dāng)然，在芯片夾11上游的管道系統(tǒng)中安置一個(gè)泵，這個(gè)泵可以向芯片夾11中泵入空氣或藥物溶液。所述泵不限于管泵，也可以使用注射泵、活塞泵、膜片泵和磁性泵。
開關(guān)三向電磁閥455以使得在關(guān)閉時(shí)管道系統(tǒng)450與管道系統(tǒng)461連通，在打開時(shí)管道系統(tǒng)450與管道系統(tǒng)463連通。廢物槽462置于管道系統(tǒng)461中，嵌入劑廢物槽464置于管道系統(tǒng)463中。由此，除了嵌入劑之外的藥物溶液如Milli Q水和緩沖液可以通過三向電磁閥455的開關(guān)導(dǎo)入廢物槽462中，嵌入劑可以導(dǎo)入嵌入劑廢物槽464中。由此，可以分級(jí)回收嵌入劑。
另外，電磁閥可以與管道系統(tǒng)如特氟隆管連接，本實(shí)施方案可以構(gòu)建多種形式結(jié)構(gòu)，其中電磁閥和流體通道分別集成在芯片夾11的上游和下游。由此，由于管道系統(tǒng)的體積降低，因此也可以降低藥物溶液的需要量。另外，由于藥物溶液流動(dòng)在管道系統(tǒng)中是穩(wěn)定的，因此改善了檢測(cè)結(jié)果的再生產(chǎn)性和穩(wěn)定性。
圖15中示出的使用流動(dòng)系統(tǒng)13的流動(dòng)步驟使用圖16的流程圖解釋。首先，在小池115中進(jìn)行固定在工作電極501上的核酸探針與樣品之間的雜交反應(yīng)(s21)。為了進(jìn)行這種雜交反應(yīng)，控制例如溫度控制系統(tǒng)14以使得芯片夾11的底面即印刷電路板22的底面的溫度達(dá)到大約45℃并保持該溫度例如60分鐘。
與此雜交反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)藥物溶液管線(line)(s22)。特別地，通過控制三向電磁閥441和445，利用側(cè)支管道系統(tǒng)446，通過打開三向電磁閥433，從嵌入劑供應(yīng)源431中供應(yīng)大約10秒鐘嵌入劑。打開三向電磁閥455，管道系統(tǒng)450中的嵌入劑流入嵌入劑廢物槽464。然后，重復(fù)將嵌入劑和空氣從管道系統(tǒng)435中交替導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中，例如進(jìn)行5秒鐘。然后，僅將空氣從管道系統(tǒng)435中導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中。在此階段，廢物流入廢物槽462中。從緩沖液供應(yīng)源421中將緩沖液導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中。之后，重復(fù)將Milli Q水和空氣交替從管道系統(tǒng)435中導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中，例如每次進(jìn)行5秒鐘。
當(dāng)啟動(dòng)這個(gè)藥物溶液管線并完成及雜交反應(yīng)完成時(shí)，洗滌管道系統(tǒng)(s23)。對(duì)于管道系統(tǒng)洗滌，例如將印刷電路板22的溫度用溫度控制系統(tǒng)14調(diào)節(jié)為大約25℃，將側(cè)支管道系統(tǒng)446用Milli Q水清洗，重復(fù)將空氣和Milli Q水交替導(dǎo)入，例如每次5秒鐘。然后，洗滌芯片夾(s24)。對(duì)于洗滌芯片夾，將藥物溶液導(dǎo)入途徑從側(cè)支管道系統(tǒng)446轉(zhuǎn)變至管道系統(tǒng)440，向管道系統(tǒng)440中重復(fù)交替導(dǎo)入空氣和MilliQ水，例如每次5秒鐘。之后通過液體傳感器443證實(shí)芯片夾11已經(jīng)用水填滿，導(dǎo)入途徑轉(zhuǎn)換為側(cè)支管道系統(tǒng)446。
然后，清洗管道系統(tǒng)(s25)。在清洗管道系統(tǒng)中，首先將空氣導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446以不與緩沖液和Milli Q水混合。然后，重復(fù)將空氣和緩沖液交替導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中，例如每次5秒鐘。通過側(cè)支管道系統(tǒng)446中的液體傳感器447證實(shí)側(cè)支管道系統(tǒng)446已經(jīng)用緩沖液置換。然后，將緩沖液注入芯片夾(s26)，在將緩沖液注入芯片夾中，首先將側(cè)支管道系統(tǒng)446轉(zhuǎn)換成管道系統(tǒng)440，重復(fù)將空氣和緩沖液交替導(dǎo)入芯片夾11中，例如每次5秒鐘。然后，將緩沖液充填于芯片夾11中(s27)。在緩沖液充填中，將緩沖液導(dǎo)入芯片夾11，同時(shí)用液體傳感器443監(jiān)測(cè)芯片夾11中的情況，通過在例如60℃保持30分鐘洗去非必需的樣品(s28)。在洗去非必需樣品的步驟之后，將管道系統(tǒng)440轉(zhuǎn)換為側(cè)支管道系統(tǒng)446，通過導(dǎo)入Milli Q水洗滌管道系統(tǒng)(s29)。在這個(gè)洗滌管道系統(tǒng)中，重復(fù)交替導(dǎo)入空氣和Milli Q水，例如每次5秒鐘。
然后洗滌芯片夾(s30)。在洗滌芯片夾中，將側(cè)支管道系統(tǒng)446轉(zhuǎn)換為芯片夾11，重復(fù)交替導(dǎo)入空氣和水，例如每次5秒鐘。之后通過液體傳感器443證實(shí)Milli Q水已經(jīng)充填進(jìn)芯片夾11之后，將轉(zhuǎn)換為側(cè)支管道系統(tǒng)446。然后開始測(cè)量。在測(cè)量中，首先用嵌入劑清洗管道系統(tǒng)(s31)。在用嵌入劑清洗管道系統(tǒng)中，廢物流入嵌入劑廢物槽464中，同時(shí)空氣導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中。然后，重復(fù)將空氣和嵌入劑導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446中，例如每次大約5秒鐘，使用液體傳感器447檢測(cè)側(cè)支管道系統(tǒng)446是否已經(jīng)用嵌入劑置換。
然后，將嵌入劑注入芯片夾11中(s32)。在這個(gè)步驟中，首先將側(cè)支管道系統(tǒng)446轉(zhuǎn)換為芯片夾11，重復(fù)交替導(dǎo)入空氣和嵌入劑，每次大約5秒鐘。然后，在用液體傳感器443監(jiān)測(cè)下，嵌入劑充填進(jìn)芯片夾11中(s33)。之后進(jìn)行測(cè)量(s34)。當(dāng)測(cè)量完成時(shí)，將Milli Q水導(dǎo)入側(cè)支管道系統(tǒng)446，然后交替導(dǎo)入空氣和Milli Q水，每次大約5秒鐘，將管道系統(tǒng)用空氣置換以洗滌管道系統(tǒng)(s35)。
最后，將側(cè)支管道系統(tǒng)446轉(zhuǎn)換為芯片夾11，交替導(dǎo)入空氣和Milli Q水，例如每次5秒鐘，將芯片夾11進(jìn)一步用空氣置換以進(jìn)行洗滌芯片夾(s36)。由此，完成一系列流動(dòng)步驟。
根據(jù)圖16所示使用圖15的流動(dòng)系統(tǒng)13步驟，為了有效進(jìn)行藥物溶液置換，在管道系統(tǒng)中進(jìn)行空氣和藥物溶液的一系列交替流動(dòng)，如藥物溶液/空氣/藥物溶液/空氣，這樣可以使溶液流動(dòng)。采用這種方法可以在藥物溶液置換中使得舊的藥物溶液與新的藥物溶液的混合最小化。因此可以減少液體交換的過渡狀態(tài)及最終改善電化學(xué)性質(zhì)的再生產(chǎn)率。再者，縮短藥物溶液流動(dòng)時(shí)間及減少藥物溶液的量可以通過有效的藥物溶液交換而實(shí)現(xiàn)。另外，由于反應(yīng)小池115中藥物溶液濃度通過這種藥物溶液/空氣的相繼流動(dòng)而通常保持恒定，因此改善了電流性質(zhì)的平面一致性，即改善了檢測(cè)的可靠性。
另外，在將藥物溶液充填進(jìn)小池115的方法中，在其中雙向電磁閥444作為芯片夾的出口閥門的情況中，在芯片夾下游的管道系統(tǒng)440中壓力降低之后(在泵454開動(dòng)的情況中，通過控制雙向電磁閥451使減壓區(qū)452中壓力降低，控制雙向電磁閥453以保持減壓區(qū)452的低壓狀態(tài))，打開雙向電磁閥44，由此藥物溶液可以導(dǎo)入芯片夾反應(yīng)小池115中。另外，圖16示出的流程僅是一個(gè)實(shí)例，可以根據(jù)測(cè)量目標(biāo)、對(duì)象和條件進(jìn)行各種改變。
圖17示出測(cè)量系統(tǒng)12的具體構(gòu)造。圖17中示出的測(cè)量系統(tǒng)12是3個(gè)電極形式的恒電位儀12a，通過反饋(負(fù)反饋)關(guān)于輔助電極502輸入的參考電極503的電壓，將希望的電壓施加于溶液(不管電極各種條件的變化)或小池115中溶液。更特別地，恒電位儀12a改變輔助電極502的電壓，以使得參考電極503的電壓相對(duì)于工作電極501設(shè)定在預(yù)先確定范圍，及測(cè)量嵌入劑電化學(xué)氧化電流。工作電極501是其上固定了具有與靶核酸互補(bǔ)的序列的核酸探針的電極，是檢測(cè)小池115中反應(yīng)電流的電極。輔助電極502是在工作電極之間應(yīng)用預(yù)定電壓的電極，為小池115提供電流。參考電極503是將電極電壓反饋給輔助電極502的電極，以控制參考電極503與工作電極501之間的但也在預(yù)定范圍內(nèi)，由此控制了輔助電極502的電壓，及可以高精確度地檢測(cè)氧化電流而不受小池115中各種檢測(cè)條件的影響。將產(chǎn)生檢測(cè)電極之間電流的電壓起伏圖的電壓起伏圖產(chǎn)生電路510與反相放大器512(OPc)的倒置輸入終端連接，以通過配線512b控制參考電極503的參比電壓。
電壓模式產(chǎn)生電路510是將來自控制結(jié)構(gòu)15的數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換為模擬信號(hào)以產(chǎn)生電壓起伏圖的電路，其具有DA轉(zhuǎn)換器。電阻器Rs與配線512b連接。將反相放大器512的非倒置輸入終端接地，將配線502a與輸出終端連接。將反相放大器512的倒置輸入終端的配線512b與輸出終端上的配線502a用配線512a連接。在這個(gè)配線512a中，提供了由反饋電阻器Rff和開關(guān)SWf組成的保護(hù)性電路500。配線502a與終端C連接。終端C與芯片21上的輔助電極502連接。當(dāng)安置多個(gè)輔助電極502時(shí)，將終端C與各個(gè)電極并聯(lián)連接。由此，通過一種電壓起伏圖，可以將電壓同時(shí)用于多個(gè)輔助電極502。在配線502a中，安置了控制向終端C施加電壓的開關(guān)的開關(guān)Swo。
反相放大器512中安置的保護(hù)性電路500未設(shè)定為提供輔助電極502過量電壓。因此，在測(cè)量時(shí)應(yīng)用過量電壓，溶液被電分解，因此可以在不影響對(duì)所希望嵌入劑的氧化電流的檢測(cè)而進(jìn)行穩(wěn)定測(cè)量。終端R與電壓跟隨放大器513(OPr)連接。電壓跟隨放大器的倒置輸入終端用與其輸入終端連接的配線513b和配線513a形成短路。在配線513b中，安置了電阻器Rf，其與配線512b的電阻器連接，配線512a和配線512b交叉。由此，通過將參考電極503的電壓反饋至電壓起伏圖產(chǎn)生電路510產(chǎn)生的電壓起伏圖而獲得的電壓輸入反相放大器512中，基于通過倒置擴(kuò)大這種電壓獲得的輸出數(shù)據(jù)，控制輔助電極502的電壓。
終端W通過配線501a與跨阻抗放大器(trans impedance amplifier)511(OPw)的倒置輸入終端連接。將跨阻抗放大器511的非倒置輸入終端接地，與其終端連接的配線511b與配線501a通過配線511a連接。在配線511a中安置了電阻器Rw。假定這個(gè)跨阻抗放大器511的輸出側(cè)終端O的電壓為Vw，電流為Iw，則Vw＝Iw·Rw。得自這個(gè)終端O的電化學(xué)信號(hào)在控制裝置15中輸出。由于有多個(gè)工作電極501，因此提供了相應(yīng)于各自的工作電極501的多個(gè)終端W和終端O。從多個(gè)終端O的輸出信號(hào)用后文描述的信號(hào)轉(zhuǎn)換部件轉(zhuǎn)換，進(jìn)行將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，因此幾乎在同時(shí)可以獲得作為數(shù)字?jǐn)?shù)值的每個(gè)工作電極501的電化學(xué)信號(hào)?；蛘撸K端W和終端O之間的跨阻抗放大器511電路可以由多個(gè)工作電極501參與。在這種情況中，配線501a可以具有信號(hào)轉(zhuǎn)換部件以從多個(gè)終端W中轉(zhuǎn)換配線501a。
使用圖17所示這個(gè)恒電位儀12a的測(cè)量系統(tǒng)12的作用通過對(duì)比使用先前的恒電位儀的情況而闡述。先前的恒電位儀示于圖18。如圖18所示，先前的恒電位儀12a’的構(gòu)造與圖17所示的恒電位儀12a幾乎相同。不同之處是在反相放大器512中無保護(hù)性電路500。電壓起伏圖產(chǎn)生電路510的輸出終端I的電壓為Vrefin，終端C的電壓為Vc，終端R的電壓為Vrefout。參考電極503的反饋導(dǎo)致Vrefout＝Rf/Rs·Vrefin。
然后，闡述一個(gè)基于測(cè)量數(shù)據(jù)利用計(jì)算機(jī)16進(jìn)行信號(hào)分析的測(cè)量數(shù)據(jù)分析程序?qū)嵗?。在此，使用圖19所示流程圖闡述基因型確定程序，以確定在靶核酸的SNP位置的核苷酸是否是G型(純合型)、T型(純合型)或者GT型(雜合型)。盡管在圖5中未特別表明，但是計(jì)算機(jī)16的主要處理器16a通過執(zhí)行分析程序而執(zhí)行類型確定過濾、類型確定處理和確定結(jié)果輸出，所述分析程序包括進(jìn)行基因型確定過濾、基因型確定處理和確定結(jié)果輸出的多個(gè)命令。另外，為了控制前述控制裝置15，單獨(dú)提供控制程序。這些分析程序和控制程序可以由計(jì)算機(jī)16中貯存在記錄工具讀出裝置中的分析程序的讀出(readingout)而執(zhí)行，或者可以通過從計(jì)算機(jī)16中記憶裝置如磁盤中讀出而執(zhí)行。
假定進(jìn)行這種測(cè)量數(shù)據(jù)分析，闡述4個(gè)核苷酸取代類型SNP的實(shí)例。首先，制備作為被測(cè)靶核酸的在SNP位置的A、G、C和T四種核苷酸，將具有與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列的多個(gè)(每種)核酸探針固定在每個(gè)工作電極501上。單獨(dú)將具有與這四種核酸探針不同序列的多個(gè)核酸探針(后文稱作陰性對(duì)照探針)固定在其它工作電極501上(s61)。原則上固定在一個(gè)工作電極501上的核酸探針的種類是一種。
然后，將含有待檢靶核酸的樣品注入其上固定了前述核酸探針的芯片中，產(chǎn)生雜交反應(yīng)(s62)，通過用緩沖液洗滌及通過導(dǎo)入嵌入劑產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)，使用測(cè)量系統(tǒng)12計(jì)算代表性(representative)電流數(shù)值(s63)。代表性電流數(shù)值是指在數(shù)量上有效把握每個(gè)雜交探針的雜交反應(yīng)的出現(xiàn)的數(shù)字值，一個(gè)實(shí)例是指定信號(hào)電流數(shù)值的最大值(電流峰值)。電流峰值是通過測(cè)量來自與固定在每個(gè)工作電極501上的核酸探針雜交的雙鏈核酸結(jié)合的嵌入劑的氧化電流信號(hào)，獲得電流峰值。通過減去除了來自的氧化電流信號(hào)之外的背景電流進(jìn)行電流峰值的檢測(cè)。當(dāng)然，根據(jù)信號(hào)處理的精確度和目的可以采用任何數(shù)值作為各自的電流數(shù)值，例如氧化電流信號(hào)的綜合值。當(dāng)然，不限于電流值，也可以采用電壓值或者通過對(duì)電流和電壓進(jìn)行數(shù)字值分析處理獲得的數(shù)值作為代表性數(shù)值。
關(guān)于其中在SNP位置的核苷酸是A、G、C和T型的靶核酸的測(cè)量數(shù)據(jù)，即各自的電流數(shù)值分別指定為Xa、Xg、Xc和Xt，陰性對(duì)照核酸探針的電流數(shù)值指定為Xn。另外，由于根據(jù)各自的種類獲得多個(gè)各自的電流數(shù)值，第一個(gè)Xa指定作Xa1，第二個(gè)Xa指定作Xa2，以此類推，以將其彼此區(qū)分。另外，其中在SNP位置的核苷酸是A、G、C和T型的靶核酸的所得各自的電流數(shù)值的編號(hào)指定為na、ng、nc和nt，陰性對(duì)照核酸探針獲得的電流數(shù)值指定為nn。
然后，為了在所得各自的電流數(shù)值Xa、Xg、Xc、Xt和Xn中除去明顯異常數(shù)據(jù)，執(zhí)行類型確定過濾處理程序(s64)。這種類型確定過濾處理程序的流程圖示于圖20。對(duì)Xa、Xg、Xc、Xt和Xn分別單獨(dú)進(jìn)行圖20所示的這種類型確定過濾處理。例如，在Xa情況中，在針對(duì)Xa獲得的na電流數(shù)值中，通過這種類型確定過濾排除看起來明顯異常的數(shù)據(jù)。關(guān)于Xg、Xc、Xt和Xn，進(jìn)行相似的程序。另外，在圖20的說明中，由于根據(jù)數(shù)據(jù)種類進(jìn)行相似的處理，因此闡述了過濾Xa的程序。特別地，如圖20示出，首先設(shè)定測(cè)量組的所有測(cè)量數(shù)據(jù)，即設(shè)立數(shù)據(jù)集(s81)。例如，在Xa情況中，設(shè)定Xa1、Xa2…Xana作為數(shù)據(jù)集。
然后，關(guān)于這些測(cè)量數(shù)據(jù)Xa1、Xa2…Xana，計(jì)算CV值(后文稱作CV0)(s82)。這個(gè)CV0是通過將測(cè)量數(shù)據(jù)Xa1、Xa2…Xana的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值而獲得。這樣確定了所得數(shù)值CV0是否為10％或更高，即0.1或更高(s83)。如果是10％或更高，則計(jì)算通過從測(cè)量數(shù)據(jù)中除去最小值獲得的na-1數(shù)據(jù)集的CV值(后文稱作CV1)(s84)。如果低于10％，則確定了沒有明顯異常的數(shù)據(jù)，繼續(xù)進(jìn)行后文描述的類型確定程序。在計(jì)算CV1之后，確定CV0≥2×CV1是否建立(s85)。如果這個(gè)不等式建立，則繼續(xù)進(jìn)行程序(s86)，通過從測(cè)量數(shù)據(jù)中除去最小值獲得的na-2數(shù)據(jù)集重新設(shè)定為數(shù)據(jù)集，返回進(jìn)行程序(s82)，重復(fù)過濾異常數(shù)據(jù)。如果不等式未建立，則確定不是在最小側(cè)而是在最大側(cè)存在異常數(shù)據(jù)，計(jì)算通過從測(cè)量數(shù)據(jù)中除去最大值獲得的na-2數(shù)據(jù)集的CV值(后文稱作CV2)(S87)。這樣確定了CV0≥2×CV2是否建立(S88)。如果建立，則將通過從測(cè)量數(shù)據(jù)中除去最大值而獲得的na-3數(shù)據(jù)集進(jìn)一步重新指定為數(shù)據(jù)集，返回進(jìn)行程序(s82)，重復(fù)過濾異常數(shù)據(jù)。如果未建立，則確定無明顯異常數(shù)據(jù)，繼續(xù)進(jìn)行后文所述類型確定程序。對(duì)于Xg、Xc、Xt和Xn也進(jìn)行前述類型確定過濾程序。
然后，通過使用獲得的類型確定過濾結(jié)果執(zhí)行類型確定處理(s65)。這種類型確定處理程序的一個(gè)實(shí)例使用圖21的流程圖闡述。另外，圖21示出確定在靶核酸的SNP位置的核苷酸是G型、T型、還是GT型的類型的實(shí)例。這種類型確定處理大概包括最大組確定算式，和2個(gè)樣品t-檢驗(yàn)算式。如圖21示出，首先算出每組各自的電流數(shù)值的平均值(s91)。所述組包括Xa、Xg、Xc、Xt和Xn組，不同組的靶核酸不同，相同靶核酸在相同組。提取從中已經(jīng)通過(s64)的類型確定過濾程序除去明顯異常數(shù)據(jù)的測(cè)量數(shù)據(jù)。當(dāng)然，可以提取從中已經(jīng)通過除了(s64)的類型確定過濾程序之外的過濾程序除去異常數(shù)據(jù)的測(cè)量數(shù)據(jù)，或者可以提取未經(jīng)任何過濾的測(cè)量數(shù)據(jù)。另外，可以獲得不是各自的電流數(shù)值的平均值，而是對(duì)這些統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理另外的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的數(shù)值。在此闡述了其中在靶核酸的SNP位置的核苷酸是A、G、C和T是A-T組及陰性對(duì)照組為N組的案例。另外，關(guān)于每組Xa、Xg、Xc、Xt和Xn的所得平均值是Ma、Mg、Mc、Mt和Mn。
然后，關(guān)于所得平均值Ma、Mg、Mc、Mt和Mn，確定最大值是否是G組的平均值Mg(s92)。如果是最大值，繼續(xù)進(jìn)行程序(s93)，如果不是最大值，返回進(jìn)行程序(s97)。在(s97)中，關(guān)于平均值Ma、Mg、Mc、Mt和Mn，確定最大值是否是T組的平均值Mt。如果是最大值，繼續(xù)進(jìn)行程序(s98)，如果不是最大值，這樣導(dǎo)致G組和T組均不是最大值，則由于未能確定而再次進(jìn)行測(cè)試。在(s93)中，確定了G組測(cè)量數(shù)據(jù)Xg1、Xg2…與N組測(cè)量數(shù)據(jù)Xn1、Xn2…之間是否存在差異。為了確定是否存在差異，使用2樣品t-檢驗(yàn)。特別地，對(duì)比概率P與通過2樣品t-檢驗(yàn)獲得的顯著性水平α之間的代表性關(guān)系，如下進(jìn)行確定 H0如果P≥α，則不存在顯著性差異(無效假設(shè)) H1如果P＜α，則存在顯著性差異(備擇假設(shè))。
顯著性水平α可以由使用者使用計(jì)算機(jī)16設(shè)定。在(s93)的實(shí)例中，詢問H1是在G組的測(cè)量數(shù)據(jù)與N組的測(cè)量數(shù)據(jù)之間數(shù)值是否存在差異，針對(duì)這個(gè)詢問，假設(shè)H0要求設(shè)定這兩組之間無差異。鑒于兩組之間的差異總結(jié)在G組測(cè)量數(shù)據(jù)的平均Mg和N組測(cè)量數(shù)據(jù)的平均Mn中，獲得概率。為了基于G組統(tǒng)計(jì)值Xg1，Xg2，…和N組統(tǒng)計(jì)值Xn1，Xn2，…計(jì)算概率，計(jì)算統(tǒng)計(jì)常數(shù)t和自由度

并從t分布的概率密度變量的積分值獲得概率P。對(duì)于獲得的概率P，如果P≥α，則H0不能被排除，且確定被保留。也就是，確定無差異。如果P＜α，則H0被排除，取假設(shè)H1，確定存在差異。當(dāng)以這種方式確定“存在差異”這一確定結(jié)果時(shí)，程序走向(s94)，當(dāng)確定“無差異”時(shí)，由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。
在(s94)中，針對(duì)G組和A組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則程序走向(s95)，如果沒有差異，則由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。在(s95)中，針對(duì)G組和C組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則程序走向(s96)，如果沒有差異，則由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。在(s96)中，針對(duì)G組和T組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則確定是G組類型，因?yàn)镚組類型是最大平均值，并且其它測(cè)量組之間有差異。如果沒有差異，則確定其是GT組類型，因?yàn)镚組類型是最大平均值，并且G組類型和T組類型之間測(cè)量結(jié)果中沒有差異。在(s98)中，針對(duì)T組和N組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則程序走向(s99)，如果沒有差異，則由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。在(s99)中，針對(duì)T組和A組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則程序走向(s100)，如果沒有差異，則由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。在(s100)中，針對(duì)T組和C組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則程序走向(s101)，如果沒有差異，則由于未能確定而再次進(jìn)行檢驗(yàn)。在(s101)中，針對(duì)T組和G組，如(s93)一樣使用2樣品t檢驗(yàn)確定兩組之間是否有差異。如果有差異，則確定是T組類型，因?yàn)門組類型是最大平均值，并且其它測(cè)量組之間有差異。如果沒有差異，則確定其是GT組類型，因?yàn)門組類型是最大平均值，并且T組類型和G組類型之間在測(cè)量結(jié)果中沒有差異。
上述確定結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)16中配置的未示出的顯示裝置中。(s66)。通過使用這種類型確定算法，可以確定雜合(hetero)類型。
盡管在圖19-21中示出了確定一種類型相應(yīng)于G類型、T類型還是GT類型的程序，該程序當(dāng)然可以適用于確定A類型、G類型、C類型和T類型的任意兩種類型，或它們的雜合類型。另外，不是必須獲得關(guān)于A類型、G類型、C類型和T類型組四種測(cè)量數(shù)據(jù)，可以僅獲得關(guān)于SNP核苷酸的可能的兩組的數(shù)據(jù)，或者可以向這兩組中加入一組陰性對(duì)照。
使用圖22的順序圖解釋使用上述個(gè)體區(qū)分測(cè)試裝置進(jìn)行個(gè)體區(qū)分的自動(dòng)化分析程序。如圖22所示，首先，使用計(jì)算機(jī)16，設(shè)定用于自動(dòng)化分析的自動(dòng)化分析條件參數(shù)，用戶指示計(jì)算機(jī)16基于所設(shè)定的自動(dòng)化分析條件參數(shù)執(zhí)行自動(dòng)化分析(s301)。自動(dòng)化分析條件參數(shù)是用于控制控制裝置15的控制參數(shù)。控制裝置15中使用的控制參數(shù)包括用于控制測(cè)量系統(tǒng)12的測(cè)量系統(tǒng)控制參數(shù)，用于控制流動(dòng)系統(tǒng)13的流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)和用于控制溫度控制系統(tǒng)14的溫度控制系統(tǒng)控制參數(shù)。測(cè)量系統(tǒng)控制參數(shù)是輸入設(shè)定參數(shù)，并包括初始值、inclement值、完成值、測(cè)量時(shí)間間隔和動(dòng)作模式。
流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)具有電磁控制參數(shù)用于控制圖15中所示的電磁閥403，413，423，433，441，442，444，445，451，453和463，具有傳感器控制參數(shù)用于控制液體傳感器443和447，以及具有泵控制參數(shù)用于控制泵454。這些電磁閥控制參數(shù)、傳感器控制參數(shù)和泵控制參數(shù)包括對(duì)照對(duì)象的對(duì)照量、對(duì)照對(duì)象的對(duì)照定時(shí)以及用于控制對(duì)照對(duì)象的對(duì)照條件，以作為參數(shù)細(xì)節(jié)和作為依次執(zhí)行圖16的(s22)至(s36)所示步驟系列的條件。
控制參數(shù)的給出原則上伴有流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)。也就是說，通過設(shè)定流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)，設(shè)定相應(yīng)于流動(dòng)系統(tǒng)13的動(dòng)作的溫度控制參數(shù)。由此可以控制溫度控制系統(tǒng)14和流動(dòng)系統(tǒng)13的溫度。
通過執(zhí)行自動(dòng)化分析，自動(dòng)化分析條件參數(shù)被送至控制裝置15(s302)。在接收到的自動(dòng)化分析條件參數(shù)中，基于測(cè)量系統(tǒng)控制參數(shù)，控制裝置15控制測(cè)量系統(tǒng)12，并且基于流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)，該機(jī)構(gòu)控制流動(dòng)系統(tǒng)13，基于溫度控制系統(tǒng)控制參數(shù)，該機(jī)構(gòu)控制溫度控制系統(tǒng)14。另外，基于每個(gè)控制參數(shù)中所含的控制定時(shí)和控制條件，控制裝置15進(jìn)行定時(shí)以控制這些測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14。因此，通過由用戶設(shè)置的自動(dòng)化分析條件參數(shù)可以自由地確定控制順序，但是在圖22中，將解釋一代表性實(shí)例。
獨(dú)立于這一自動(dòng)化分析，用戶可制備芯片夾11。之后，首先用基材固定螺絲25將其上密封了個(gè)體區(qū)分芯片21的印刷電路板22固定在芯片夾11的支持物111上，在所述芯片中，希望的核酸探針固定在工作電極501上，由此進(jìn)行向芯片夾11的附著(s401)。具有上蓋固定螺絲117的與密封材料24a集成的芯片夾上蓋112和支持物111被固定，以形成小池115的狀態(tài)制成(s402)。樣品通過注射孔119被注射到芯片夾11中(s403)。芯片夾11被置于裝置上，并且進(jìn)行啟動(dòng)程序，由此，啟動(dòng)雜交反應(yīng)(s21)。希望的是待被注射的樣品體積稍大于小池115的容積量。由此，小池115可被樣品完全充滿，不留空氣。
控制裝置15基于自計(jì)算機(jī)16中接受的測(cè)量系統(tǒng)控制參數(shù)開始控制測(cè)量系統(tǒng)的定時(shí)(timing)(s303)。另外，控制裝置15基于自計(jì)算機(jī)16中接受的流動(dòng)系統(tǒng)控制參數(shù)相繼控制流動(dòng)系統(tǒng)13的每個(gè)元件(s304)。另外，盡管在圖22中未特別示出，但結(jié)合這個(gè)流動(dòng)系統(tǒng)13的控制，溫度控制系統(tǒng)14的溫度基于溫度控制系統(tǒng)控制參數(shù)而被控制。通過這種控制，流動(dòng)系統(tǒng)13自動(dòng)進(jìn)行流動(dòng)步驟，包括圖16的(s21)至(s36)(除了s34之外)所示雜交反應(yīng)(s305)，同時(shí)溫度控制系統(tǒng)14被自動(dòng)控制，以便個(gè)體區(qū)分芯片21置于流動(dòng)步驟中指定的溫度下。控制裝置15指令測(cè)量系統(tǒng)12進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)對(duì)這個(gè)流動(dòng)步驟的測(cè)量步驟中途定時(shí)(s34)(s305)。即在流動(dòng)步驟(s34)的測(cè)量步驟定時(shí)時(shí)，初始數(shù)值、inclement數(shù)值、完成數(shù)值、測(cè)量時(shí)間間隔和動(dòng)作設(shè)置模式貯存在控制裝置15的初始數(shù)值寄存器151、inclement數(shù)值寄存器152、完成數(shù)值寄存器153和間隔寄存器154及動(dòng)作設(shè)置寄存器155中?；蛘撸?s303)的測(cè)量系統(tǒng)定時(shí)控制可以與(s305)同時(shí)進(jìn)行。
基于這種測(cè)量指令的測(cè)量系統(tǒng)12例如通過產(chǎn)生電壓模式(s306)進(jìn)行測(cè)量，所得測(cè)量信號(hào)從末端0輸入控制裝置15中(s307)。控制裝置15處理接受的測(cè)量信號(hào)，將其作為測(cè)量數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器15b中貯存(s308)。將這種測(cè)量數(shù)據(jù)通過局域總線17輸入計(jì)算機(jī)16中(s309)。計(jì)算機(jī)16接收這種測(cè)量數(shù)據(jù)(s310)。
當(dāng)以這種方式獲得必需的測(cè)量數(shù)據(jù)時(shí)，計(jì)算機(jī)16基于測(cè)量數(shù)據(jù)實(shí)施圖20(s64)所示的類型確定過濾(type determination filtering)。當(dāng)類型確定過濾完成時(shí)，基于過濾的數(shù)據(jù)實(shí)施圖21所示類型確定處理(s65)。將所得確定處理結(jié)果在計(jì)算機(jī)16上配置的顯示器上顯示(s66)。
對(duì)要區(qū)分的個(gè)體和樣品進(jìn)行上述類型確定，結(jié)果數(shù)據(jù)貯存在計(jì)算機(jī)16中。計(jì)算機(jī)16對(duì)比這些結(jié)果，確定它們是否一致。另外，確定結(jié)果的可靠性從預(yù)先輸入的等位基因排列和基因型排列的數(shù)據(jù)中確定，這可以與確定結(jié)果一起顯示。
計(jì)算機(jī)16與控制裝置15之間的處理分配不限于前述分配方式。例如，當(dāng)測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14具有解釋計(jì)算機(jī)16的指令的處理器并實(shí)施每個(gè)元件時(shí)，可以省略控制裝置15。
為了控制測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14的定時(shí)，當(dāng)這些測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)具有14定時(shí)處理器時(shí)，基于處理器控制的定時(shí)實(shí)施每個(gè)程序。在這種情況中，如果計(jì)算機(jī)16為這些測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13和溫度控制系統(tǒng)14發(fā)送自動(dòng)化分析條件參數(shù)，則非必需定時(shí)?；蛘?，計(jì)算機(jī)16可以控制測(cè)量系統(tǒng)12、流動(dòng)系統(tǒng)13、溫度控制系統(tǒng)14和控制裝置15的定時(shí)。
另外，已經(jīng)示出了注射孔119與出口116b連通的實(shí)例，但是該孔也可以與入口116a連通。另外，已經(jīng)示出了工作電極501和個(gè)體區(qū)分芯片21上的焊盤221的Ti或Au薄板結(jié)構(gòu)實(shí)例，但是可以使用其它材料的電極和焊盤。另外，工作電極501的排列不限于圖14所示。每個(gè)工作電極501、輔助電極502和參考電極503的電極數(shù)目不限于圖中所示。
另外，流動(dòng)系統(tǒng)13不限于如圖15所示。例如，根據(jù)反應(yīng)的種類，通過加入供應(yīng)系統(tǒng)以供應(yīng)除了空氣之外的藥物溶液、Milli Q水、緩沖液和嵌入劑，或者氣體，可以在小池115中進(jìn)行更復(fù)雜的反應(yīng)。另外，可以使用除了電磁閥之外的其它方式控制管道系統(tǒng)之間供應(yīng)途徑和供應(yīng)量。圖16中示出流動(dòng)系統(tǒng)13的動(dòng)作僅是一個(gè)實(shí)例，可以根據(jù)反應(yīng)目標(biāo)不同而對(duì)動(dòng)作加以改變。
另外，流體通道601a-601d不限于如圖9B所示排列。例如，檢測(cè)流體通道601a可以與直線連接小池入口部分115a和115b平行排列，或者各自的流體通道601a-601d可以不是直線的流體通道，而可以是曲線流體通道。再者，已經(jīng)示出但不限于其中入口116a和出口116b與小池底面垂直的實(shí)例，小池入口可以設(shè)計(jì)為與小池底面平行。
根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施方案，可以自動(dòng)進(jìn)行個(gè)體區(qū)分測(cè)試及結(jié)果確定。
實(shí)施例 表1示出選擇的單核苷酸多態(tài)性實(shí)例。描述了在亞洲人(中國(guó)人或日本人)作為樣品時(shí)，對(duì)于每種單核苷酸多態(tài)性，每個(gè)核苷酸的等位基因頻率和基因型頻率。
表2示出了從表1的基因型頻率、每個(gè)基因型(C/C、T/T、C/T)中最大頻率(Max值)和最小頻率(Minimum值)計(jì)算的估計(jì)的雜合性，以其倒數(shù)(1人/多少人)表示區(qū)分能力(鑒定能力)。每個(gè)柱的最低區(qū)分能力階(step)分別通過乘以區(qū)分能力獲得。因此，關(guān)于表1中的22個(gè)SNP，可以看出即使在最高頻率的組合中，大約1人/8.38×106人(大約每8380千人)具有相同基因型，在最低頻率組合中，1人/5.22×1019人具有相同基因型。
表1 表2 在本發(fā)明的詳細(xì)解釋中，描述了一種計(jì)算基因型組合的存在概率的方法，所述方法描述了將基因型的頻率相乘然后取倒數(shù)。然而，在這個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于每個(gè)SNP，預(yù)先計(jì)算基因型的倒數(shù)作為的區(qū)分能力，之后可以進(jìn)行乘法計(jì)算。
然后，在上表示出的SNP中，選擇任意5個(gè)SNP，制造其上固定了核酸探針以檢測(cè)SNP的陣列。所用核酸探針的序列在表3中示出。
表3電極SNP-堿基序列(5′-3′) No.
-SH，硫醇修飾。
將含有每種核酸探針(30μg/mL)和NaCl(400mM)的溶液點(diǎn)于陣列的電極上，維持1小時(shí)。之后用蒸餾水洗滌、通風(fēng)干燥，以獲得固定了核酸的芯片。
作為靶核酸，合成通過PCR擴(kuò)增的區(qū)域，并將其用作模板樣品。表4示出了用作靶核酸的合成的寡聚物。
表4靶核酸(合成的寡聚物)
將表4示出的每種合成的核酸溶解于2×SSC溶液中至1×1014拷貝/mL，獲得靶核酸溶液。在表4所示合成的核酸中，將在多態(tài)性位點(diǎn)含有G的核酸制備為樣品1，在多態(tài)性位點(diǎn)含有A的核酸制備為樣品2。將制造陣列浸入50μL制備的靶核酸溶液中，使陣列上的核酸探針與靶核酸溶液中的靶核酸雜交。將所述陣列浸入0.2×SSC溶液(35℃)中40分鐘以洗去非特異性結(jié)合的靶核酸。用超純水洗滌并通風(fēng)干燥。將Hoechst 33258(50μM)溶解于20mM磷酸鹽緩沖液(100mM NaCl)中，將通風(fēng)干燥的芯片浸入該溶液中，5分鐘后進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。檢測(cè)Hoechst 33258的氧化峰高度，將其用作電流峰值。
得自每個(gè)電極的電流峰值示于圖23。圖23A是樣品1的測(cè)試結(jié)果。樣品1明顯均示出C/C純合類型。因此，從表1的數(shù)值中可以確定具有這種基因型的個(gè)體以1人/696人存在。
另一方面，圖23B示出的樣品2均示出T/T純合，從表1的數(shù)值中可以確定1人/5979人。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明可以選擇有利于個(gè)體區(qū)分的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性，可以將個(gè)體區(qū)分所需的單核苷酸多態(tài)性的數(shù)目最小化。從而提供了一種簡(jiǎn)便、快速及經(jīng)濟(jì)的個(gè)體區(qū)分方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解本發(fā)明的其它優(yōu)勢(shì)和變化。因此，本發(fā)明廣義而言不限于本文描述和示出的特定內(nèi)容和實(shí)施方案。因此，在不偏離所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改。
序列表
<110>株式會(huì)社東芝(KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA)
<120>個(gè)體區(qū)分方法以及用于個(gè)體區(qū)分測(cè)試的陣列、裝置和系統(tǒng)
<130>06S0113P
<150>JP 2005-188452
<151>2005-06-28
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
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ctaattccaa aacaatacac cccagacttc tgttaacact 100
<210>20
<211>100
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Sample
<400>20
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權(quán)利要求
1. 一種用于確定對(duì)象個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性的對(duì)象個(gè)體區(qū)分方法，所述方法包括
從待區(qū)分個(gè)體對(duì)象所屬的群體中存在的單核苷酸多態(tài)性的組中選擇多個(gè)單核苷酸多態(tài)性的步驟；和
確定所述對(duì)象個(gè)體具有的核苷酸序列和樣品的核苷酸序列中所選擇的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性的基因型的步驟；和
通過對(duì)比所述基因型確定一致性的步驟，
其中在選擇步驟中，選擇符合如下(i)-(iii)中任一條件的單核苷酸多態(tài)性
(i)在2核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性的情況中，假定2個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X和Y，X+Y＝1，且Y≤X；
0.5≤X≤0.7；
(ii)在3核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性的情況中，假定3個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X；
1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；和
(iii)在4核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性的情況中，假定4個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X；
1/4≤X且(1-X)/3≤Y，且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.55≤X＜0.7。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.6≤X＜0.7。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.65≤X≤0.68。
5. 權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括
通過計(jì)算所述對(duì)象個(gè)體具有的基因型組合在所述群體中存在的概率而確定所述確定一致性的步驟所得結(jié)果的可靠性，
其中所述概率是通過將基因型頻率相乘并取倒數(shù)而計(jì)算，
針對(duì)所述對(duì)象個(gè)體具有的基因型的所有被選單核苷酸多態(tài)性，由等位基因頻率計(jì)算基因型頻率。
6. 用于確定對(duì)象個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性的陣列，其中核酸探針固定在基材上，其中
所述核酸探針具有與含有單核苷酸多態(tài)性的靶序列互補(bǔ)的序列，以及
所述單核苷酸多態(tài)性選自待區(qū)分對(duì)象個(gè)體所屬群體中存在的單核苷酸多態(tài)性的組，并且符合如下(i)-(iii)中的任一條件
(i)在2核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性的情況中，假定2個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X和Y，X+Y＝1，且Y≤X；
0.5≤X≤0.7；
(ii)在3核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性的情況中，假定3個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X；
1/3≤X且(1-X)/2≤X且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；
(iii)在4核苷酸取代類型的單核苷酸多態(tài)性情況中，假定4個(gè)可能的核苷酸各自的等位基因頻率為X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X；
1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
7. 權(quán)利要求6的陣列，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.55≤X＜0.7。
8. 權(quán)利要求6的陣列，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.6≤X＜0.7。
9. 權(quán)利要求6的陣列，其中條件(i)中等位基因頻率符合0.65≤X≤0.68。
10. 區(qū)分個(gè)體的測(cè)試裝置，其包含
權(quán)利要求6的陣列；
在陣列基材上的流體通道，其沿著藥物溶液或空氣的流動(dòng)方向配置；
沿著所述流體通道的多個(gè)工作電極，每一電極均位于基材上，其上固定有探針；
輔助電極，每一輔助電極均排列在相應(yīng)于所述工作電極的所述流體通道的內(nèi)周表面上，并提供與工作電極的電勢(shì)差；
參考電極，每一參考電極均排列在相應(yīng)于工作電極的所述流體通道內(nèi)周表面上，并反饋檢測(cè)到的電壓至工作電極；
入口，其開在所述流體通道中，使藥物溶液或空氣從所述流體通道的上游側(cè)流至流體通道中；
出口，其開在所述流體通道中，使藥物溶液或空氣從所述流體通道流至所述流體通道的下游側(cè)；以及
注射口，通過其將測(cè)試溶液注入所述流體通道中。
11. 區(qū)分個(gè)體的測(cè)試系統(tǒng)，其包含
權(quán)利要求10的區(qū)分個(gè)體的測(cè)試裝置；
供應(yīng)系統(tǒng)，其包含與入口連通并供應(yīng)藥物溶液或空氣通過入口進(jìn)入所述流體通道中的第一管道系統(tǒng)，以及控制第一管道系統(tǒng)的藥物溶液或空氣流速的第一閥；排出系統(tǒng)，其包含與出口連通并使藥物溶液或空氣通過出口從所述流體通道排出的第二管道系統(tǒng)，控制第二管道系統(tǒng)的藥物溶液或空氣流速的第二閥，及位于第二管道系統(tǒng)中并從所述流體通道抽吸藥物溶液或空氣的泵；
測(cè)量系統(tǒng)，其包含提供工作電極與輔助電極之間電勢(shì)差的電壓施加單元；
控制陣列溫度的溫度控制系統(tǒng)；
控制裝置，其控制所述供應(yīng)系統(tǒng)的第一閥，排出系統(tǒng)的第二閥和泵，測(cè)量系統(tǒng)的電壓施加單元，和溫度控制系統(tǒng)，所述控制裝置檢測(cè)來自工作電極或輔助電極的電化學(xué)反應(yīng)信號(hào)并將所述電化學(xué)反應(yīng)信號(hào)作為測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行貯存；及
計(jì)算機(jī)，其向所述控制裝置提供控制條件參數(shù)對(duì)其進(jìn)行控制，同時(shí)基于測(cè)量數(shù)據(jù)執(zhí)行分析核苷酸序列的處理，并確定個(gè)體具有的核苷酸序列與樣品具有的核苷酸序列之間的一致性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種區(qū)分個(gè)體的方法。所述方法包括選擇和使用符合本發(fā)明限定的任一條件的單核苷酸多態(tài)性。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101248188SQ20068001918
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者高橋匡慶, 橋本幸二 申請(qǐng)人:株式會(huì)社東芝