專利名稱：：用于改良生產(chǎn)天冬氨酸衍生的氨基酸及化學(xué)品的改變的乙醛酸支路的制作方法用于改良生產(chǎn)天冬氨酸衍生的氨基酸及化學(xué)品的改變的乙醛酸支路優(yōu)先權(quán)的要求本申請要求2005年6月20日提交的待決美國臨時專利申請第60/692，341號的優(yōu)先權(quán)。該臨時申請完整地引入此處作為參考。
背景技術(shù)：
：以下包括可能對本發(fā)明的理解有用的信息。這并非承認此處提供的任何信息是當前所描述或要求保護的本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)或資料，或具體地或隱含地引用的任何出版物或文獻是現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明涉及，但不限于，微生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及例如新的細菌林、新的核苷酸序列、新的氨基酸序列、和使用這些細菌林、新核苷酸序列和/或新氨基酸序列發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，包括但不限于L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-高絲氨酸和L-異亮氨酸的方法。優(yōu)選地，生產(chǎn)L-蘇氨酸。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)動物祠料添加劑。本發(fā)明還涉及精細化學(xué)品，包括但不限于上述氨基酸的發(fā)酵和合成。在大腸桿菌(Escherichiacoli)中，氨基酸L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸、L-賴氨酸和L-甲硫氨酸通過共同的生物合成途徑從天冬氨酸鹽(天冬氨酸)獲得其全部或部分的碳原子(G.N.Cohen，"TheCommonPathwaytoLysine,MethionineandThreonine,"pp.147-171，《AminoAcids:BiosynthesisandGeneticRegulation》，K.M.Herrmann和R.LSomerville，編，Addison-WesleyPublishingCo.，Inc.，Reading,Mass.(1983)):天冬氨酸—天冬氨酰磷酸—天冬氨酸半醛—高絲氨酸——THR/ILELYSMET而天冬氨酸來源于草酰乙酸(OAA)。根據(jù)Gokarn等的美國專利6，455，284號的報道，可以使用需氧發(fā)酵生產(chǎn)草酰乙酸衍生的氨基酸。不幸的是，方法的產(chǎn)量會受到嚴格的碳流代謝調(diào)節(jié)的限制。一般地，據(jù)說無論該代謝系統(tǒng)受到怎樣的干擾，流向0AA的碳流量都保持恒定。J.Vallino等，Biotechnol.Bioeng.41:633,646(1993)?？朔舜x調(diào)節(jié)對于增加0AA衍生的氨基酸及其它產(chǎn)品的生產(chǎn)將是有利的。在需氧細菌代謝中，葡萄糖的碳原子可以在三羧酸循環(huán)(TCA)(又稱作檸檬酸循環(huán)或Krebs循環(huán))中被完全氧化為二氧化碳。TCA循環(huán)從OAA與乙酰輔酶A縮合形成檸檬酸開始。圖l顯示細菌大腸桿菌中該需氧代謝途徑的例子。除了作為TCA循環(huán)中的主要分子，0AA還可以用作氨基酸，包括L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸和L-賴氨酸合成的前體。鑒于0AA對TCA循環(huán)的重要性，為了TCA循環(huán)的進一步進展，應(yīng)替換掉用于氨基酸生物合成的0AA。因此，許多生物體發(fā)展了可以再生用于TCA循環(huán)的中間體的"回補途徑"。一些生物體中，例如一些植物和微生物中，TCA循環(huán)中間體可以通過稱作"乙醛酸支路"(也稱作"乙醛酸旁路"或"乙醛酸循環(huán)")的回補途徑自乙酰輔酶A形成。圖2顯示大腸桿菌中的乙醛酸支路。該乙醛酸支路允許生物體生長在某些底物(例如，乙酸、脂肪酸或一些長鏈烷烴)上補充它們的0AA。由于此類底物不提供可以被羧化以形成TCA循環(huán)所需的0AA的3-碳中間體，故該機制是有用的。碳流在TCA循環(huán)和乙醛酸支路之間的分支點被認為是異檸檬酸(K.Walsh等，J.Biol.Chem.259:15，9646-9654(1984))。在乙醛酸支路中，來自TCA循環(huán)的異檸檬酸被異檸檬酸裂解酶裂解為乙醛酸和琥珀酸。然后蘋果酸合酶用于將乙醛酸與乙酰輔酶A縮合以形成蘋果酸。琥珀酸和蘋果酸均可以用于通過TCA循環(huán)產(chǎn)生0AA。一般地，編碼乙醛酸旁路酶的基因的表達被認為受到嚴格控制，以致于當可以獲得用于TCA循環(huán)的某些3-碳化合物時這些基因會受到阻遏o可以觀察到以下反應(yīng)aceA，異檸檬酸裂解酶異檸檬酸^乙醛酸+琥珀酸aceB，蘋果酸合酶A:乙酰輔酶A+H20+乙醛酸^蘋果酸+輔酶AglcB，蘋果酸合酶G:乙酰輔酶A+H20+乙醛酸^蘋果酸+輔酶A在大腸桿菌中，編碼乙醛酸支路酶的基因位于aceA^操縱子中。它們被認為受到大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括例如IclR(A.Sunnarborg等，J.Bact.，172:2642-2649(1990))、FadR(S.Maloy等，J.Bad.148:83-90(1981))、FruR(A.Chia等，J.Bact.，171:2424-2434(1989))，和ArcA貝S.Iuchi等，LBact.，171:868-873(1989))的控制。已經(jīng)報道aceA^操縱子自位于ace"上游的(？7。型啟動子表達(E.Resniketal，J.Bact.178:9，2715-2717(1996))。大腸桿菌K-12林的aceA4J操縱子的核苷酸序列見SEQIDNO:1。Keseler，I.M.，等，Nuc.AcidsRes.，33:D334-357(2005)。該操縱子被認為受到自iclR表達并由乙酸或脂肪酸上的生長所激活的阻遏蛋白的調(diào)節(jié)(E.Resnik等，見前)。aceA基因(SEQIDNO:2)(Keseler，I.M.等，見前)據(jù)報道編碼異檸檬酸裂解酶(SEQIDNO:3)(Keseler，I.M.等，見前)，aceB基因(SEQIDNO:4)(Keseler，I.M.等，見前)據(jù)報道產(chǎn)生蘋果酸合酶A(SEQIDNO:5)(Keseler，I.M.等，見前)。glcDFGB操縱子(SEQIDNO:6)(Keseler,I.M.等，見前)中的最后一個基因glcB(SEQIDNO:7)(Keseler，I.M.等，見前)據(jù)報道編碼蘋果酸合酶G(SEQIDNO:8)(Keseler,I.M.等，見前)，當蘋果酸合酶A缺乏時該酶可以替代乙醛酸支路中的蘋果酸合酶A。(L.N.Ornston，等J.Bact.，98:2，1098-1108(1969);W.Farmer,等App.&Env.Microbiol,63:8，3205-3210(1997);M.0h，等，J.Biol，Chem.，277:15，13175—13183(2002)。)野生型大腸桿菌菌抹的許多特征已有報道。例如，F(xiàn).R.Blattner等Science,1997Sep5277(5331):1453-74中報道了大腸桿菌K-12林的基因組。一些作者已經(jīng)報道過將碳流引向OAA的嘗試，因為據(jù)假定增加碳向OAA的流動將增加可以使用OAA作為前體進行合成的生物化學(xué)品的產(chǎn)生。所作的努力包括敲除充當aceA^的阻遏物的基因或增強抑制aceWJ的基因(以避免碳流入乙醛酸支路)。例如，Rieping等的美國專利6，630，332號報道，通過過表達斷0基因(該基因產(chǎn)生蘋果酸醌氧化還原酶)增加腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中蘇氨酸的產(chǎn)生。Park等的歐洲專利申請EP1408123Al才艮道，使用已經(jīng)敲除了尸a^基因的微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸。Rieping等的美國專利申請公布2003/0059903A1號以及Rieping等的國際公布W002/081722報道用于生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括發(fā)酵其中aceA基因或編碼aceA基因的核苷酸序列被衰減或關(guān)閉的腸桿菌科細菌。Rieping等的國際專利公布WO03/038106A2號報道使用經(jīng)修飾增強了fadR基因產(chǎn)物和/或iclR基因產(chǎn)物(兩者均是aceBAK操縱子的轉(zhuǎn)錄阻遏物)的活性水平的細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。Hermann等的國際專利公布W003/008616號報道用于制備L-蘇氨酸的方法，該方法包括發(fā)酵經(jīng)修飾以致aceK基因產(chǎn)物的表達被衰減的腸桿菌科細菌。用于培養(yǎng)細菌細胞、向宿主細胞引入分離的DNA分子、以及對分離的核酸分子進行分離、克隆和測序等的方法和技術(shù)一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法和技術(shù)描述在許多標準的實驗室手冊中，例如，Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)，.Miller,J.H.，ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1972);Miller,J.H.AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1992);SingerM.和Berg，P.，Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,Calif.(1991);SambrookJ.等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Kaufman,P.B.等，HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,FIa.(1995);MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick，B.R.和Thompson,J.E.編，CRCPress,BocaRaton,Fla.(1993);Smith-Keary，P.F.MolecularGeneticsofEscherichiacoli，TheGuiIfordPress,NewYork,N.Y.(1989);Schleif，R.F.和Wensink，P.C.PracticalMethodsinMolecularBiology,Springer-Verlag(1981);Singer,M.和Berg,P.Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,California(1991);Kaufman,P.B.等,HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,Florida(1995)5Plasmids:APracticalApproach,第2版，Hardy,K，D.編，OxfordUniversityPress,NewYork,NY(1993);Vectors:EssentialData,Gacesa,P.和Ramji，D.P.編，JohnWiley&SonsPub.，NewYork,NY(1994);PCRprimer:ALaboratoryManual,Dieffenbach，CW.和Dveksler，G.S.編ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY(1995)'，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis，M.A.等編.AcademicPress,SanDie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供應(yīng)一種或多種氨基酸，或者需要在特定培養(yǎng)基上生長細菌)。本發(fā)明的細菌可以來自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏桿菌屬(Escherichia)細菌,包括大腸桿菌菌林。本發(fā)明細菌也可以來自棒桿菌科(Corynebacteriaceae)，包括棒桿菌屬(Corynebacterium)和短桿菌屬(Brevibacterium)細菌，包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)和乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)的菌株。棒桿菌屬和短桿菌屬之間的區(qū)別是微小的，而且一些研究者斷言這些細菌實際上屬于同一個屬。對該差異的準確區(qū)分并不是本發(fā)明任何方面的決定因素，本發(fā)明的任何方面均可以使用能夠進行培養(yǎng)以產(chǎn)生氨基酸的任何細菌菌林來實施。一方面，本發(fā)明包括細菌菌株，其中該菌林的至少一條染色體含有至少一個與至少一個非天然啟動子可操作地連接的glcB基因、和/或aceA基因、和/或aceB基因，并且其中該菌株超量產(chǎn)生L-蘇氨酸、L-曱硫氨酸、L-高絲氨酸、L-異亮氨酸和/或L-賴氨酸。當與野生型大腸桿菌菌抹，例如大腸桿菌K-12林的L-蘇氨酸生產(chǎn)相比時，和/或與親本菌林相比時，本發(fā)明的菌林可以超量產(chǎn)生L-蘇氨酸。在本發(fā)明的再一方面，大腸桿菌菌抹還包括與所述aceB、aceA合位點。非天然核糖體結(jié)合位點可以選自例如，但不限于，lac核糖體結(jié)合位點、thrA核糖體結(jié)合位點、folA核糖體結(jié)合位點、araC核糖體結(jié)合位點、araB核糖體結(jié)合位點、galE核糖體結(jié)合位點、ompA核糖體結(jié)合位點、trpE核糖體結(jié)合位點、lamB核糖體結(jié)合位點、MS2外殼蛋白(MS2coat)核糖體結(jié)合位點、和QP外殼蛋白(Qpcoat)核糖體結(jié)合位點。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明中使用的非天然核糖體結(jié)合位點從大腸桿菌菌林中選擇。例如，該非天然核糖體結(jié)合位點可以從大腸桿菌s4370-69-2林中選擇。對核糖體結(jié)合位點的提及可以包括但不限于共有序列、天然發(fā)現(xiàn)的序列及突變序列。非天然啟動子和/或非天然核糖體結(jié)合位點可以例如通過重組或者通過誘變天然aceBAK或glcB啟動子或結(jié)合位點而引入。在本發(fā)明再一方面，前面討論的非天然啟動子可以選自由例如tac啟動子、trc啟動子、lac啟動子、lpp啟動子、trp啟動子、入-PL啟動子、PR啟動子、lacUV5啟動子、araBAD啟動子和lpp-lac啟動子組成的組中的至少一種啟動子。提及啟動子可以包括但不限于共有序列和突變序列。鑒于本公開和Brosius等(見前)及Mulligan等(見前)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到在教導(dǎo)使用tac啟動子的實施例中使用trc啟動子可以獲得相似結(jié)果。一方面，本發(fā)明包括通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸產(chǎn)品的方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌，其中所述細菌生產(chǎn)所述L-氨基酸并含有重組核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體具有使至少一種選自由aceBAK操縱子中的基因和glcB基因組成的組的基因在所述細菌中超量表達的可操作配置；在所述發(fā)酵培養(yǎng)基和所述細菌中的至少一種中富集所述L-氨基酸；和從所述發(fā)酵培養(yǎng)基和所述細菌中的至少一種中分離所述L-氨基酸，以生產(chǎn)L-氨基酸產(chǎn)品。在本發(fā)明再一方面，上述細菌的屬選自埃希氏桿菌屬、棒桿菌屬和短桿菌屬。所述細菌可以是例如大腸桿菌。在本發(fā)明再一方面，所述重組核酸包含位于aceBAK操縱子和/或glcB基因中的至少一種基因上游的非天然啟動子序列，其中該非天然啟動子與aceBAK操縱子和/或glcB基因中的所述至少一種基因可操作地連接。所述啟動子可以選自tac啟動子、trc啟動子、lac啟動子、lpp啟動子、trp啟動子、A-PL啟動子、入-h啟動子、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本公開將意識到的其它啟動子。過表達的基因可以選自aceB、aceA和glcB。非天然啟動子可以替代操縱子中的天然啟動子，其中可以缺失、間斷、或者部分缺失和部分間斷該天然啟動子?？梢栽诓倏v子中除天然啟動子外再插入非天然啟動子。在本發(fā)明再一方面，如上提供生產(chǎn)L-氨基酸產(chǎn)品的方法，其中aceBAK基因產(chǎn)物和glcB基因產(chǎn)物中的至少一種是所述微生物中唯一的過表達的基因產(chǎn)物。在本發(fā)明另一方面，所述L-氨基酸選自L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸、L-賴氨酸和L-曱硫氨酸。在再一方面，所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。在再一方面，本發(fā)明包括過表達aceBAK操縱子中基因以及glcB基因中的至少一種基因的細菌。該微生物的屬可以選自埃希氏桿菌屬、棒桿菌屬和短桿菌屬。該細菌可以是大腸桿菌菌林。鑒于本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到此處適用于大腸桿菌中異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶G及其編碼基因的教導(dǎo)可以應(yīng)用于棒桿菌屬中的異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶G。SEQIDN0:26顯示在谷氨酸棒桿菌菌株ATTC13032中編碼蘋果酸合酶G的基因(glcB)。SEQIDNO:27顯示在谷氨酸棒桿菌菌林ATTC13032中編碼異檸檬酸裂解酶的基因(aceA)。在本發(fā)明再一方面，所述細菌是大腸桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌的菌林。在本發(fā)明另一方面，所述細菌包括被非天然啟動子調(diào)節(jié)的aceBAK操縱子和/或glcB基因中的至少一種基因。另一方面，本發(fā)明細菌中的非天然啟動子選自tac啟動子、trc啟動子、lac啟動子、lpp啟動子、trp啟動子、入-P^啟動子、入-Pa啟動子。在本發(fā)明再一方面，所述非天然啟動子是tac啟動子(Ptac)。本發(fā)明再一方面包括其中aceBAK操縱子中的天然啟動子被非天然啟動子替代、間斷、或部分替代和部分間斷的細菌。在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明細菌包括插入aceBAK操縱子中但不替代或間斷aceBAK操縱子中的天然啟動子的非天然啟動子。在本發(fā)明再一方面，在本發(fā)明細菌中，glcDFGB中的天然啟動子已經(jīng)被非天然啟動子替代或間斷，其中該非天然啟動子與glcB基因可操作地連接。在本發(fā)明再一方面，提供本發(fā)明的細菌，其中非天然啟動子插入glcDFGB操縱子中與glcB基因可操作地連接但不替代或間斷該glcDFGB操縱子中的天然啟動子。本發(fā)明再一方面提供于2005年5月11日保藏的、具有NRRLB—30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和NRRLB-30851的保藏號的細菌菌林。實施方案也提供作為這些保藏的微生物的衍生物的細菌菌林。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可以在這些保藏菌林上進行各種修飾，包括所述代謝流量(Metabolicflux)的進一步修飾以及營養(yǎng)需求的改變，而不減弱aceBAK操縱子或glcB基因的過表達。在再一方面，本發(fā)明包括含有非天然啟動子的重組核酸，其具有使編碼大腸桿菌aceA蛋白、aceB蛋白和glcB蛋白中的至少一種蛋白的基因在細菌中過表達的可操作配置，其中所述基因包括下列中的至少一個a)編碼選自SEQIDNO:3、5、8的蛋白質(zhì)的DM;b)才艮據(jù)SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25中的至少一個的核酸；c)僅就遺傳密碼而言與根據(jù)b)的核酸簡并的核酸；d)含有根據(jù)a)或b)的核酸的沉默突變的核酸；e)與b)的核酸至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%—致的核酸；f)在嚴緊條件下可以與根據(jù)b)的DM雜交的核酸。在再一方面，本發(fā)明提供含有前段a)、b)、c)、d)或e)中描述的至少一種多核苷酸的載體。附圖簡述圖l描述大腸桿菌的三羧酸循環(huán)。來自L.N.Ornston等J.Bact.，98:2，1098-1108(1969)的圖。圖2描述大腸桿菌的乙醛酸支路。自K.Walsh等J.Biol.Chem.259:15，9646-9654(1984)修飾的圖。圖3描述帶有抗生素標志和tac啟動子的PCR產(chǎn)物向染色體中的整合。使用同源重組以交換用于表達aceBAK和glcB基因的啟動子。spcR-壯觀霉素抗性盒，kanR-卡那霉素抗性盒。朝右的箭頭顯示異源啟動子(Ptac)的大概位置。含有spcR或kanR以及tac啟動子的線性PCR產(chǎn)物(頂線)交換進入染色體(中線)以產(chǎn)生具有驅(qū)動aceBAK或glcB菌林(底線)n圖4顯示用于構(gòu)建本文中所列菌林的引物的5'-3'序列。帶下劃線的殘基提供與aceB等位基因或與glcB等位基因的序列同源性，并使得可以通過同源重組實現(xiàn)向染色體中的插入。粗體殘基編碼tac啟動子。圖5顯示tac啟動子與7種不同的Ptac-基因融合物，包括tac啟動子(Ptac)的序列(SEQIDNO:9)和7種不同Ptac插入構(gòu)建體的啟動子區(qū)序列(起始密碼子(ATG)被加以框線)。所顯示的Ptac-aceBAK(SEQIDNO:19)為菌林s4391-184-l和菌林s4538-006-l中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac(2)-aceB(SEQIDNO:20)為菌株s4480-140-5中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac(3)-aceBAK(SEQIDNO:21)為菌林s4480-148-l中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac(4)-aceBAK(SEQIDNO:22)為菌林s4480-199-l中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac(5)-aceBAK(SEQIDNO:23)為菌林s4538-003-l中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac\lac-aceBAK(SEQIDNO:24)為菌林s4480-199-4中所發(fā)現(xiàn)的。所顯示的Ptac-glcB(SEQIDNO:25)為菌林s4397-109-2及菌林s4538-006-l中所發(fā)現(xiàn)的。表1顯示本文中給出的菌抹的菌林編號和相關(guān)基因型。表l也給出在PCR擴增用于構(gòu)建本文所列的菌林的DM時使用的引物和模板。表2列出帶有tac啟動子融合物的各種菌林的蘋果酸合酶(MS)及異檸檬酸裂解酶(ICL)的比活性。表3、表4和表5列出測量tac啟動子融合物菌林的蘇氨酸效價及產(chǎn)量的搖瓶實驗的結(jié)果。發(fā)明詳述如下所討論的，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)天冬氨酸衍生的氨基酸和化學(xué)品的、具有改良性質(zhì)的微生物菌林。提供制備此類菌林的方法。這些方法包括改變aceBAK操縱子、aceA基因、aceB基因、glcB基因、或它們的組合的表達。表達的改變可以通過增強轉(zhuǎn)錄、和/或解除天然的轉(zhuǎn)錄控制來實現(xiàn)。也考慮置換這些基因的天然啟動子；例如，用tac啟動子(Ptac)置換它們的天然啟動子。本發(fā)明還涉及提供本發(fā)明新特性的基因構(gòu)建體，包括栽體，其中該栽體可以是，但不限于，質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子或微型染色體。I.定義本文所用某些術(shù)語是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所使用的，并具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的一般含義。本文旨在包括這些一般含義的最完整范圍。然而，為了本說明書和權(quán)利要求(包括其中術(shù)語被給予的范圍)的清楚、一致的理解，對于宣稱的含義可能與此處提供的定義相矛盾的情況，提供以下定義，在這些情況下由所提供的定義來支配。注意，術(shù)語"a"或"an"實體指一或多個/種該實體；例如，"多核苷酸(apolynucleotide)"應(yīng)理解為代表一或多個/種多核苷酸。如此，術(shù)語"a"、"an"、"一或多個/種"及"至少一個/種"在本文中可以互換使用。染色體整合。在本文中，術(shù)語"染色體整合"指外源DNA片段插入宿主生物的染色體中。組成型。本文中，術(shù)語"組成型"指這樣的啟動子，該啟動子被表達并且已知不受控于完全造成表達終止的調(diào)節(jié)；即，該啟動子總是"開啟的"。內(nèi)源。本文中，術(shù)語"內(nèi)源"指在生物體中天然存在于該生物體內(nèi)的DNA序列。aceA基因。本文中，術(shù)語"aceA基因"指編碼具有異檸檬酸裂解酶活性的蛋白質(zhì)的核酸序列。異檸檬酸裂解酶催化乙醛酸循環(huán)中異檸檬酸向乙醛酸和琥珀酸的可逆裂解。aceA基因的一個例子編碼根據(jù)SEQIDN0:3的蛋白質(zhì)。來自各種細菌菌林的異檸檬酸裂解酶基因序列的其它實例包括編碼根據(jù)SEQIDNO:28至SEQIDNO:35的蛋白質(zhì)的那些序列。典型的aceA基因?qū)嵗⊿EQIDN0:2和SEQIDNO:27中給出的核酸序列。來自各種細菌菌林的aceA基因的其它實例包括根據(jù)SEQIDNO:36至41的那些。aceB基因。本文中，術(shù)語"aceB基因"指編碼具有蘋果酸合酶A活性的蛋白質(zhì)的核酸序列。該活性催化乙酰輔酶A與乙醛酸及水反應(yīng)形成S-蘋果酸和輔酶A。來自各種細菌菌林的aceB基因的實例包括編碼才艮據(jù)SEQIDNO:42至48的蛋白質(zhì)的那些。典型的aceB基因?qū)嵗⊿EQIDNO:4和SEQIDNO:26中給出的核酸序列。來自各種細菌菌林的aceB基因的其它典型實例包括根據(jù)SEQIDNO:49至53的那些。glcB基因。本文中，術(shù)語"glcB基因"指編碼具有蘋果酸合酶G活性的蛋白質(zhì)的核酸序列。該活性也催化乙酰輔酶A與乙醛酸及水反應(yīng)形成S-蘋果酸和輔酶A。glcB基因的一個實例編碼根據(jù)SEQIDNO:8的蛋白質(zhì)。具有蘋果酸合酶G活性的蛋白質(zhì)序列可以通過與SEQIDNO:8比與SEQIDNO:42具有更高的氨基酸序列同一性而區(qū)別于具有蘋果酸合酶A活性的那些蛋白質(zhì)序列。來自各種細菌菌林的glcB基因的實例包括編碼根據(jù)SEQIDNO:7的蛋白質(zhì)的那些。來自各種細菌菌林的glcB基因的其它典型實例包括根據(jù)SEQIDNO:58至60的那些序列。異源。本文中，術(shù)語"異源"指來自不同來源或者來自相同來源的不同位置的結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)物。本文中，術(shù)語"誘導(dǎo)物"指發(fā)揮作用刺激從誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄的分子。誘導(dǎo)物(通常，但并不總是，外部分子)的存在將刺激轉(zhuǎn)錄。分離的多核苷酸。本文中，術(shù)語"分離的多核苷酸"指已經(jīng)自其天然環(huán)境中取出的多核苷酸，DNA或RNA。例如，載體中包含的重組DNA分子被認為是分離的。分離的DNA分子的其它實例包括維持在異源宿主細胞中的重組DNA分子或者溶液中純化的(部分地或基本上純化的)DNA分子。在作為一個混合克隆文庫的一員并且尚未與文庫中的其它克隆分離的克隆中所包含的核酸分子，或者自細胞或細胞裂解物中分離或移出的染色體中包含的核酸分子，不是"分離的"。分離的RNA分子包括本發(fā)明中所包括的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。分離的DNA也包括通過PCR擴增產(chǎn)生的DNA。重組核酸。本文中，術(shù)語"重組核酸"指經(jīng)過操作將來自異源來源的核酸融合在一起的多核苷酸序列。天然啟動子。本文中，術(shù)語"天然啟動子"指在親本菌林中與基因可操作地連接的內(nèi)源啟動子。非天然啟動子。本文中，術(shù)語"非天然啟動子"一方面是指與不4接的內(nèi);源1動子。非天然啟動;也可以是異源i動子rs非天然啟動子也可以是其序列相對于親本菌林已經(jīng)發(fā)生改變、缺失、置換和/或突變的啟動子。此類改變、缺失、置換和/或突變可以通過任何機制產(chǎn)生。一些可能的機制包括但不限于化學(xué)誘變、紫外線誘變、重組或者本領(lǐng)域技術(shù)人員認可的其它方式。非天然啟動子可以通過一個或多個改變、缺失、置換或突變而產(chǎn)生。非天然啟動子可以通過對一系列親本菌林實施多個和/或連續(xù)的突變、改變、缺失和/或置換而產(chǎn)生?？刹僮鞯剡B接。本文中，術(shù)語"可操作地連接"、"可操作地結(jié)合"和"具有可操作的配置(operablyconfigured)"可互換使用，指核酸元件以功能性的關(guān)系連接。當一個核酸序列被放置在與另一核酸序列形成功能性關(guān)系的位置時，該核酸序列與該另一核酸序列可操作地連接。例如，如果一個啟動子影響一個多肽編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子與該多肽編碼區(qū)可操作地連接。可操作地連接的核酸典型地緊靠在一起或者是連續(xù)的，并且在必要、最佳或可用的時候，使兩個多肽編碼區(qū)連續(xù)地連接在一起并處于共同的轉(zhuǎn)錄控制下，例如在操縱子中那樣。操縱子。本文中，術(shù)語"操縱子"指一個連續(xù)部分的編碼mRNA的核酸序列，其中兩個或兩個以上編碼多肽的開放閱讀框被轉(zhuǎn)錄為多順反子信使RNA，并受到順式作用啟動子以及可能地能夠用于分子控制轉(zhuǎn)錄的其它順式作用調(diào)節(jié)序列的控制。啟動子。本文中，術(shù)語"啟動子"意味著用于結(jié)合RNA聚合酶以及起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列部分，因此指能夠在細胞中啟動編碼序列或其它功能性RNA表達的DNA序列。啟動子序列通常，但并不總是，存在于基因的5，非編碼區(qū)中，位于一個或多個編碼多肽的開放閱讀框的上游。啟動子中在轉(zhuǎn)錄起始中起作用的序列元件常常由共有核苷酸序列來表征。啟動子序列可以包括近側(cè)的以及較遠的上游元件。細菌啟動子中保守的近側(cè)元件的實例包括分別位于轉(zhuǎn)錄起始點上游10個和35個堿基位置的-10區(qū)和-35區(qū)。啟動子可以例如是組成型的、誘導(dǎo)性的或者環(huán)境反應(yīng)性的。啟動子可以整個地來源于天然基因或者可以是雜合啟動子。雜合啟動子由來源于不同的天然啟動子的不同元件組成，和/或可以包含合成DM片段。超量產(chǎn)生。本文中，術(shù)語"超量產(chǎn)生(或者過量生產(chǎn))"指細胞產(chǎn)生的化合物的量大于參考菌林所產(chǎn)生的該化合物的量。參考菌林可以是例如，用于制備本發(fā)明菌抹的親本菌林。參考菌林也可以是野生型菌林。過表達。本文中，術(shù)語"過表達"意味著基因產(chǎn)物(RNA和/或蛋白質(zhì))在經(jīng)過突變、雜交、或重組DNA技術(shù)操作的后代生物中相對于在野生型菌林或未接受過此操作的親本生物體中超量產(chǎn)生。菌林。本文中，術(shù)語"菌株"指具有一致的或基本上一致的表型和基因型特征的特定種細菌。除非有相反說明，否則術(shù)語"菌林"和"細胞，，在本文中可以互換使用。抑制因子和阻遏物。本文中，術(shù)語"抑制因子"和"阻遏物"指起阻斷或降低自可去阻遏啟動子的轉(zhuǎn)錄之作用的不同類型分子。抑制到抑制的小分子。阻遏物是可以與啟動子的順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié)合并且該結(jié)合可以造成自所述啟動子的轉(zhuǎn)錄受到抑制的蛋白質(zhì)。抑制因子和阻遏物常常在宿主細胞中產(chǎn)生。可以將抑制因子加入宿主細胞正在生長或者將要生長于其中的培養(yǎng)基中。合成啟動子。本文中，術(shù)語"合成啟動子"指具有啟動子活性并且已知不存在于自然界的核苷酸序列。產(chǎn)率。本文中，術(shù)語"產(chǎn)率"指相對于消耗的原料量而言所產(chǎn)生的產(chǎn)物量。就微生物所產(chǎn)生的氨基酸而言，產(chǎn)率指相對于所述過程所消耗的原料量而言所產(chǎn)生的氨基酸量。例如，當微生物消耗ioo克葡萄糖產(chǎn)生25克L-異亮氨酸時，相對于該葡萄糖，L-異亮氨酸的產(chǎn)率為25%。粘粒。本文中，術(shù)語"粘粒"指由質(zhì)粒序列和入噬菌體的粘性末端組成的雜合栽體。外源的。本文中，術(shù)語"外源的"指生物體中非天然存在于該微生物中的DNA序列。染色體外元件。本文中，術(shù)語"染色體外元件"指未與染色體連接的元件。本發(fā)明的染色體外元件包括例如，但不限于，載體。栽體可以是例如但不限于質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體轉(zhuǎn)座子或微型染色體。同源。本文中，術(shù)語"同源"指來自相同來源或者具有相同的進化結(jié)構(gòu)或功能的結(jié)構(gòu)。同源重組。本文中，術(shù)語"同源重組"指兩個DNA分子之間同源或幾乎同源的序列的交換。親本菌抹。本文中，術(shù)語"親本菌株"指被突變、電穿孔或以其它方式改變以提供本發(fā)明菌林或宿主細胞的微生物菌株，或者在已經(jīng)被突變、電穿孔或以其它方式改變以提供本發(fā)明菌株或宿主細胞的菌林之前的菌林。質(zhì)粒。本文中，術(shù)語"質(zhì)粒"指可以用作克隆載體的環(huán)狀染色體外元件。內(nèi)源啟動子。本文中，術(shù)語"內(nèi)源啟動子"指在野生型的所選宿主微生物中天然存在的啟動子序列。異源啟動子。本文中，術(shù)語"異源啟動子"指非天然存在于所選宿主微生物中的啟動子序列。非天然啟動子序列可以來自原核或真核生物。調(diào)節(jié)。本文中，術(shù)語"調(diào)節(jié)"指一些基因產(chǎn)物響應(yīng)分子信號出現(xiàn)的水平上升或降低。這些基因產(chǎn)物可以是例如但不限于蛋白質(zhì)和mRNA。調(diào)節(jié)可以是在特定環(huán)境下基因產(chǎn)物增加的"正調(diào)節(jié)"(或者"誘導(dǎo)")。調(diào)節(jié)可以是特定環(huán)境下基因產(chǎn)物降低的"負調(diào)節(jié)"(或"阻遏")。核糖體結(jié)合位點(RBS)。本文中，術(shù)語"核糖體結(jié)合位點"指mRM分子中與核糖體結(jié)合以起始翻譯的區(qū)域。栽體。本文中，術(shù)語"栽體"指能夠在宿主生物體中復(fù)制的DNA分子。除非另行說明，否則本文中新描述的所有核苷酸序列均使用自動DNA測序儀(例如，來自AppliedBiosystems，Inc.的373型)進行了確定。因此，正如本領(lǐng)域中對于通過此自動化方法確定的任何DNA序列所已知的，本文中所確定的任何核苷酸序列均可能含有一些錯誤。通過自動化確定的核苷酸序列典型地與所測序的DM分子的實際核苷酸序列有至少大約90%—致性，更典型地至少大約95%至至少大約99.9%—致性。II.菌抹和核苷酸本發(fā)明方面包括制備超量產(chǎn)生一種或多種氨基酸的細胞的方法以及由這些方法制備的細胞、這些細胞的后代、以及具有相似特征的細胞。盡管本文中在制備L-蘇氨酸的情況下討論本發(fā)明，但是應(yīng)理解本發(fā)明的方法、菌林和構(gòu)建體可以用于生產(chǎn)衍生自天冬氨酸的其它氨基酸或化學(xué)品，包括但不限于L-曱硫氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸和本發(fā)明的細菌和方法可以利用或不利用原有啟動子或基因的"敲除"。"敲除"指通過插入或缺失在物理上置換啟動子或基因以致該啟動子或基因無功能。當非天然啟動子與aceBAK操縱子或glcB基因可操作地連接時，天然啟動子可以被間斷或者缺失(整個地或部分地)。備選地，可以將非天然啟動子置于該非天然啟動子可操作地連接的基而，在此情況下，非天然啟動子也將發(fā)揮作用以獨立于天然啟動子的方式啟動轉(zhuǎn)錄。有大量的啟動子適用于本發(fā)明。它們包括例如，但不限于啟動子tac，trc，lac，lpp，trp，入PL，入PR，lacUV5，araBAD，lpp-lac,phoA，recA，proU，cst-l,tetA，cadA,nar，cspA，Tl，T71ac，T31acT-lac，T4基因32，nprMlac，VHb及蛋白質(zhì)A。圖5顯示tac啟動子的一個示例性核苷酸序列(SEQIDNO:9)(Proc.Natl.Acad.Sci80:21-25.，deBoer等)。其它啟動子的序列是本領(lǐng)域已知的，它們在本發(fā)明中的應(yīng)用鑒于本公開將是明顯的。本發(fā)明菌林的一條或多條染色體可以包括一個以上的aceBAK操縱子和/或glcDFGB操縱子或glcB基因，而且每個操縱子或基因均可以獨立地具有與該操縱子或基因可操作地連接的非天然的或天然的啟動子。如果染色體中存在一個以上的aceBAK操縱子、glcDFGB操縱子和/或glcB基因，則它們可以包括相同或不同的非天然啟動子。除了包括與至少一個aceBAK操縱子、glcDFGB操縱子和/或glcB基因可操作地連接的非天然aceBAK操縱子、glcDFGB操縱子和/或glcB基因啟動子的啟動子，本發(fā)明菌林還可以包括可操作地與aceBAK操縱子、、glcDFGB操縱子和/或glcB基因以及非天然啟動子連接的核糖體結(jié)合位點，其中該核糖體結(jié)合位點是天然的aceBAK操縱子、glcDFGB操縱子和/或glcB基因的核糖體結(jié)合位點或者是非天然的核糖體結(jié)合位點。在本發(fā)明中使用的非天然核糖體結(jié)合位點包括來自lac、thrA、folA、araC、araB、galE、ompA、trypE、lamB、MS2夕卜殼蛋白和QB外殼蛋白的核糖體結(jié)合位點。應(yīng)當理解，在整個本公開中，本發(fā)明中公開的核苷酸序列和/或啟動子應(yīng)理解為包括這些序列和/或啟動子的共有序列、在本發(fā)明的一些方面中也包括與所公開的序列至少90%、91%、92%、"％、"％、95°/。、96%、97%、98%、99%或100%—致的核苷酸序列。作為一種具體實施方式，可以利用序列分析計算機程序，例如用于Windows的0MIGA2.0版(可獲自O(shè)xfordMolecular,Ltd.(Oxford,U.K.))常規(guī)地確定任何特定核苷酸序列是否與一個核苷酸序列或互補核苷酸序列具有至少大約90%、91°/。、92%、93%、94%、95%、96°/。、97%、98%、99°/?；?00°/。一致性。OMIGA⑧使用基于緩慢完全的動態(tài)規(guī)劃比對法的CLUSTALW比對算法以及開放缺口罰分為10以及延伸缺口罰分為5.0的默認參數(shù)，以找到兩個核苷酸序列之間的最佳比對。當使用CLUSTALW或其它序列比對程序來確定一個特定序列是否與參考序列具有例如95%—致性時，可以對這些參數(shù)進行設(shè)置以便在參考核苷酸序列的全長范圍計算一致性百分數(shù)并允許在參考序列中有不超過核苷酸總數(shù)5%的缺口、錯配或插入。本發(fā)明也可以使用本領(lǐng)域已知的其它序列分析方法和程序。本公開中描述的實驗利用的是GCGWisconsinPackage(WisconsinPackagelO.3或11.1版,AccelrysInc.，SanDiego,CA。SeqLAb的部分基于"遺傳數(shù)據(jù)環(huán)境(GDE)"，其最初由Illinois大學(xué)微生物系(Urbana-champaign，Illinois,USA)開發(fā)并許可給GCG)，這是一個可以從Accelrys⑧獲得的測序程序。所用的WisconsinPackage⑧的元件包括GAP、SSEARCH、FASTA和BLAST。2005年5月11日于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(theNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch,Peoria,Illinois)保藏、并分別具有NRRLB-30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和NRRLB-30851保藏號的細菌菌抹s4397-184-l、s4480-140—5、s4480-148-l、s4480-199-l、s4538-003-l、S4480-199-4、s4397-109-2和s4538-006-2，展示了本發(fā)明的多個方面。例如，在s4397-184-1中tac啟動子已經(jīng)在大腸桿菌中與aceBAK操縱子可操作地連接。當在搖瓶中檢測時，該菌林能夠相對于野生型大腸桿菌中的蘋果酸合酶活性和蘇氨酸效價具有增加的蘋果酸合酶活性和增加的蘇氨酸效價。有關(guān)這些菌林的結(jié)果在下面的實施例4和5中有更完全的闡述。在再一方面，本發(fā)明包括包含與aceA基因、aceB基因和glcB基因中的至少一個可操作地連接的非天然啟動子的核酸，其中所述核酸分別編碼異檸檬酸裂解酶、蘋果酸合酶A、或蘋果酸合酶G中的至少一個。對應(yīng)于aceA基因的多肽的非限制性實例包括根據(jù)SEQIDN0:3和SEQIDN0:28至35的蛋白質(zhì)。典型的aceA基因?qū)嵗⊿EQIDNO:2和SEQIDNO:27中給出的核酸序列。來自各種細菌菌林的aceA基因的其它實例包括根據(jù)SEQIDNO:36至41的那些核酸序列。對應(yīng)于aceB基因的多肽的非限制性實例包括根據(jù)SEQIDNO:42至48的蛋白質(zhì)。對應(yīng)于g1cB基因的多肽的非限制性實例包括根據(jù)SEQIDNO:8和SEQIDNO:54至57的蛋白質(zhì)。前述多核苷酸的非限制性實例是根據(jù)SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:36至41、SEQIDNO:45至53、以及SEQIDNO:58至60的核酸。所述多核苷酸也可以是就遺傳密碼子而言與前述多核苷酸序列之一簡并的、根據(jù)該前述多核苷酸序列的DM,或者含有前述序列的沉默突變的DNA。此類沉默突變描述在Bowie,J.U.等"破譯蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸替代的耐受"Science247:1306-1310(1990)。所述多核苷酸也可以是與所述DNA具有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%—致性的DNA、具有簡并性改變的DNA、或者具有如上討論的沉默改變的DNA、或者可以在嚴緊雜交條件與以上討論的任何DM雜交的多核普酸。本發(fā)明還可以包括提供此段中的任何多核苷酸的載體。III.DNA構(gòu)建體另一方面，本發(fā)明包括含有與至少一個非天然啟動子可操作地連接的大腸桿菌aceBAK操縱子和/或glcDFGB操縱子的至少一部分，例如，glcB基因、aceA基因和/或aceB基因的DNA構(gòu)建體(例如栽體)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體還可以包括對于所包括的基因而言并非天然大腸桿菌核糖體結(jié)合位點的核糖體結(jié)合位點，例如lac核糖體結(jié)合位點。當然，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以包括本領(lǐng)域已知的其它調(diào)節(jié)元件或額外的DM元件。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以是一個或多個載體。本發(fā)明的載體可以包含至少一個調(diào)節(jié)元件。例如，調(diào)節(jié)元件可以是啟動子、操縱基因、激活子(activator)、阻遏子(repressor)、和/或增強子。栽體也可以包含一個或多個起始序列和/或一個或多個核糖體結(jié)合位點。栽體還可以包含選擇標記。調(diào)節(jié)元件可以位于宿主細胞的染色體上和/或其它栽體中。在本發(fā)明的一個方面，提供包含與至少一個對于大腸桿菌而言異源的啟動子可操作地連接的aceA基因、aceB基因或glcB基因的DM構(gòu)建體。在本發(fā)明再一方面，DM構(gòu)建體還包含至少一個核糖體結(jié)合位點，所述核糖體結(jié)合位點與aceA基因、aceB基因或glcB基因以及非天然大腸桿菌aceA、aceB或glcB啟動子的啟動子可操作地連接，其中所述至少一個核糖體位點不是這些基因的天然大腸桿菌核糖體結(jié)合位點。本發(fā)明栽體可以是但不限于質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子或微型染色體。本發(fā)明再一方面，與aceA基因、aceB基因或glcB基因在DNA構(gòu)建體中可操作地連接的啟動子可以是例如但不限于tac、trc、lac、lpp、trp、入Pl、入Pr、lacUV5、araBAD、lpp-lac、phoA、recA、proU、cst-l、tetA、cadA、nar、cspA、T7、T71ac、T31ac、T-lac、T4基因32、nprMlac、VHb和蛋白質(zhì)A。在本發(fā)明再一方面，提供包括本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主細胞。宿主細胞可以是微生物，包括例如大腸桿菌細胞，并且可以還包括可能為本領(lǐng)域技術(shù)人員所期望的修飾或內(nèi)含物。所述宿主細胞可以產(chǎn)生L-蘇氨酸。一方面，所述宿主細胞與不帶有至少一個本發(fā)明DNA構(gòu)建體的親本細胞相比以更高產(chǎn)率產(chǎn)生L-蘇氨酸。IV.用于氨基酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及一般地上面描述的及以下要求保護的菌林和宿主細胞在生產(chǎn)氨基酸的發(fā)酵方法中的用途。此類氨基酸可以包括例如天冬氨酸家族的氨基酸。天冬氨酸家族的氨基酸可以包括例如L-蘇氨酸、L-曱硫氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸和L-賴氨酸。氨基酸可以通過例如在含有至少一種碳源、至少一種氮源以及，適當?shù)兀瑹o機鹽、生長因子等等的合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的菌林或宿主細胞而獲得。適宜碳源的實例包括但不限于碳水化合物，例如，葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、淀粉水解物、纖維素水解物以及糖蜜；有機酸，例如乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸、和富馬酸；以及醇類，例如甘油和乙醇。適宜氮源的實例包括但不限于氨，包括氨氣和氨水；無機或有機酸的銨鹽，例如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨和乙酸銨；和其它含氮物質(zhì)，包括肉骨、蛋白胨、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物和酵母提取物。適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基包括但不限于下列培養(yǎng)基1.基本培養(yǎng)基。Davis基本培養(yǎng)基(每升含有7.Og磷酸氫二鉀、2.0g磷酸二氫鉀、Q.5g/1檸檬酸鈉、0.1硫酸鎂、1.0g硫酸銨，pH7.0，補充碳源(典型地葡萄糖)至0.1%(w/v)以及按需補充氨基酸源(典型地0.r/。水解酪蛋白氨基酸(w/v)或0.15°/。酵母提取物(w/v))。2.LB(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lNaCl)3.BTY2(1.Og/1K2H0P4、10.0g/1(NH4)2S04、40.8g/1Bis-Tris、15g/l酵母提取物(Difco)、32.5g/l葡萄糖和1.2g/lMgS04-7H20，pH7.0)3.BTY3(1.Og/1K2HOP4、10.0g/l(NH4)2S04、40.8g/lBis-Tris、20ml/l的50%固體玉米漿(Sigma)、25.0g/l葡萄糖和1.2g/lMgS04-7H20pH7.0，按需補充氨基酸源(典型地1.0°/。水解酪蛋白氨基酸或1.5%酵母提取物(w/v))?？梢允褂帽景l(fā)明菌林以例如分批型或補料-分批型發(fā)酵法商業(yè)生產(chǎn)氨基酸。在分批型發(fā)酵中，在發(fā)酵開始時添加營養(yǎng)物。在補料分批型發(fā)酵或長期的補料分批型發(fā)酵中，一種或多種營養(yǎng)物(l)連續(xù)地向培養(yǎng)物供應(yīng)，(2)自發(fā)酵開始起供應(yīng)或者在培養(yǎng)達到某個階段后供應(yīng)，和/或(3)當補充的所述營養(yǎng)物自培養(yǎng)基中被耗盡時供應(yīng)。長期的分批或補料分批發(fā)酵的一種變異方案是重復(fù)的補料分批發(fā)酵或填充-和-抽取發(fā)酵(fill-and-drawfermentation),其中可以在特定時間移出發(fā)酵罐的部分內(nèi)容物(例如，當發(fā)酵罐滿時)而繼續(xù)補給營養(yǎng)物。以此方式，可以相對于未使用此類方法時延長發(fā)酵至更長時間。另一類發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵或恒化培養(yǎng)，采用完全培養(yǎng)基的連續(xù)補料而培養(yǎng)液體被連續(xù)地或半連續(xù)地抽取出來以便發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積保持大致恒定。連續(xù)發(fā)酵在理論上可以維持無限長的時間。在分批發(fā)酵中，培養(yǎng)的生物可以一直生長直到培養(yǎng)基中的任一種必需營養(yǎng)物被耗盡或者發(fā)酵條件變得不利(例如，pH降低到可以抑制微生物生長的值)時。補料分批發(fā)酵中通常采取措施以維持有利的生長條件(例如，通過使用pH控制)并通過向培養(yǎng)物補給一種或多種必需營養(yǎng)物以防止這些營養(yǎng)物的耗竭。培養(yǎng)的^:生物通常將以營養(yǎng)物的補料速率所決定的速率持續(xù)生長。一些情況下單一一種營養(yǎng)物，非常常見的是碳源，將對生長是限制性的。相同的原則適用于連續(xù)發(fā)酵期間，在該過程中補給的培養(yǎng)基中一種營養(yǎng)物可以是限制性的而其它營養(yǎng)物均是過量的。在微生物停止生長后，該限制性的營養(yǎng)物一般將以極低濃度存在于培養(yǎng)液中。盡管可以使用不同類型的營養(yǎng)物限制，但是最常使用的碳源限制。其它限制性營養(yǎng)物的實例包括氮、硫、磷、痕量金屬和氧源。維生素和氨基酸也可以是限制性營養(yǎng)物，尤其是在所培養(yǎng)的微生物對于限制性氨基酸或維生素而言是營養(yǎng)缺陷型的時候。培養(yǎng)后，可以根據(jù)多種方法中的一種或多種，從培養(yǎng)液部分地或完全地分離已經(jīng)積累在培養(yǎng)液中的氨基酸(例如，L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-賴氨酸或L-異亮氨酸)。例如，據(jù)報道離子交換樹脂可以用于根據(jù)美國專利5，342，766號所描述的方法純化L-蘇氨酸。該方法涉及首先從培養(yǎng)液中通過離心取出微生物，然后使用鹽酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至大約2。該酸化后的溶液隨后通過強酸性陽離子交換樹脂，并使用稀釋的氨水洗脫吸附物。通過在真空下蒸發(fā)去除氨，并濃縮所得溶液。添加醇并隨后冷卻以提供L-蘇氨酸晶體。從培養(yǎng)基中純化L-異亮氨酸的另一方法描述在美國專利5,474,918號中。VI.實施例以下實施例僅僅是本發(fā)明一些方面的代表。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本說明書中描述的本發(fā)明可以使用各種微生物及啟動子來實施。這些實施例和其中所用的菌林不應(yīng)解釋為以未在權(quán)利要求中明確說明的任何方式限制本發(fā)明。實施例1實施例l描述通過以導(dǎo)致aceBAK操縱子中基因表達增加的方式將tac啟動子插入aceB上游的位置，制備超量產(chǎn)生蘋果酸合酶和異檸檬酸裂解酶的菌抹。通過用來自質(zhì)粒pKD4(Datsenko和Wanner,2000)的編碼卡那霉素抗性基因的線性DNA轉(zhuǎn)化菌林s4370-69-2，將tac啟動子(deBoer等，1983，和圖5)插入野生型aceB基因的上游(圖3)。菌林s4370-69-2作為親本菌株缺乏抗生素抗性標記。其于2005年5月11日寸呆藏在農(nóng)業(yè)研究才幾構(gòu)保藏中心(theNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch,Peoria,IlHnois)保藏，具有保藏號NRRLB-30843。在使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和特異于啟動子構(gòu)建體的引物(tacaceB-kan3(SEQIDNO:11)、tac(2)aceB-kan3(SEQIDNO:12)或tac(3)aceB-kan3(SEQIDNO:13))的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)中，質(zhì)粒pKD4被用作模板。所有引物序列均列在圖4中。備選地，使用菌林s4397-184-l(Ptac-aceBAK)(表l)的染色體DNA作為模板，使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和特異于啟動子構(gòu)建體的引物(tac(4)aceB(SEQIDNO:14)、tac(5)aceB(SEQIDNO:15)或aceB-tac\lacrev(SBQIDNO:16))。這些PCR產(chǎn)物含有卡那霉素抗性基因，在該基因的側(cè)翼為與菌林MG1655(Blattner等，1997)的aceB等位基因序列同源的序列，且tac啟動子替代了aceBAK啟動子(Chung等，1988)。使用AdvantageHFTMpCR試劑盒(Clontech)遵循廠商指導(dǎo)進行PCR。50y1反應(yīng)物包括5jal10xHFPCR反應(yīng)緩沖液(Clontech專有配方)、10xHFdNTP混合物(Clontech專有配方)、1^150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、ImMEDTA、5mM2-巰基乙醇、0.25%Thesit、1.1|ig/ju1TagStart抗體、Clontech專有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和專有量的DeepVentDNA聚合酶組成)、每種引物(100pmo1/y1)各0.5p1和1m1才莫板DNA(1-50pg"l)。按如下在AppliedBiosystems9700熱循環(huán)儀中進行循環(huán)94"C預(yù)處理4分鐘，然后25個循環(huán)，每個循環(huán)為94°C10秒、55°C30秒和68'C90秒。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表l.8種不同過表達菌林的構(gòu)建。所列為用于引入每種啟動子基因融合物的引物和模板以及所得菌林的菌林名稱。然后使用PCR產(chǎn)物，按照具有以下修改的以前描述過的方案(Datsenko和Wanner，2000)，轉(zhuǎn)化帶有質(zhì)粒pKD46的菌林s4370-69-2:將帶有質(zhì)粒PKD46的菌林s4370-69-2在定軌搖床上30。C生長的50mlLB(Difco)培養(yǎng)物，于250ml帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)至OD,為0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培養(yǎng)物再生長2.0小時，此時才艮據(jù)Datsenko和Wanner(2000)的方案制備電感受態(tài)細胞。通過將1.0-3.0Mg沉淀的PCR產(chǎn)物懸浮在45jal電感受態(tài)細胞中并將該混合物轉(zhuǎn)移至0.lcm電穿孔杯中，實施電穿孔。然后在Bio-RadGenePulser1I中以1.8kV、25pF和200Q對電穿孔杯進行脈沖。之后細胞在lml2YT(Difco)中37X:培養(yǎng)4小時，將整個lml鋪在具有50jag/ml卡那霉素的LB瓊脂(Difco)上，37t:孵育1-2天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得卡那霉素抗性菌林中的質(zhì)粒pKD46，產(chǎn)生菌抹s4397—184-1(Ptac—aceBAK)、s4480-140-5(Ptac(2)-aceBAK)、s4480-148-l(Ptac(3)-aceBAK)、s4480-199-l(Ptac(4)-aceBAK)、s4538-003-l(Ptac(5)-aceBAK)和s4480-199-4(PtacAlac-aceBAK)(表1)。實施例2以下實施例描述通過以導(dǎo)致glcB基因產(chǎn)物表達增加的方式將tac啟動子插入大腸桿菌glcB基因上游的位置，制備超量產(chǎn)生蘋果酸合酶的菌林。通過用來自質(zhì)粒pBSL175(Alexeyev等，1995)的編碼壯觀霉素抗性基因的線性DNA轉(zhuǎn)化菌林s4370-69-2，將tac啟動子(deBoer等，1983，和圖5)插入glcB基因的上游，從而驅(qū)動GlcB表達(圖3)。在使用引物glcBUS-spc2(SEQIDNO:18)和tac-glcB-spcl(SEQIDNO:17)(所有引物序列列在圖4中)的PCR中，質(zhì)粒pBSL175被用作模板。該PCR產(chǎn)物含有壯觀霉素抗性基因，在該基因的側(cè)翼為與MG1655(Blattner等，1997)的glcB等位基因序列同源的序列，而tac啟動子替代了該glcB基因緊上游的DNA。使用Advantage-HFTMPCR試劑盒(Clontech)遵循廠商指導(dǎo)進行該PCR。50jii1反應(yīng)物包括5p110xHFPCR反應(yīng)緩沖液(Clontech專有配方)、5ju110xHFdNTP混合物(Clontech專有配方)、1y150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、lmMEDTA、5mM2-巰基乙醇、0.25%Thesit、1.1pg/ja1TagStart抗體、Clontech專有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和專有量的DeepVentDNA聚合酶組成)、每種引物(100pmol/jul)各0.5|nl和1ju1模板DNA(1-50pg/jal)。按如下在AppliedBiosystems9700熱循環(huán)儀中進行循環(huán)94。C預(yù)處理4分鐘，然后25個循環(huán)，每個循環(huán)為94°C10秒、55°C30秒和68'C90秒。然后使用PCR產(chǎn)物，根椐具有以下改變的以前描述過的方案(Datsenko和Wanner,2000)，轉(zhuǎn)化帶有質(zhì)粒pKD46的菌林s4370-69-2:將帶有質(zhì)粒PKD46的菌林s4370-69-2在定軌搖床上30'C生長的50mlLB(Difco)培養(yǎng)物，于250ml帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)至OD,為0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培養(yǎng)物再生長2.0小時，此時才艮據(jù)Datsenko和Wanner(2000)的方案制備電感受態(tài)細胞。通過將1.0-3.0|ig沉淀的PCR產(chǎn)物懸浮在45p1電感受態(tài)細胞中并將該混合物轉(zhuǎn)移至0.1cm電穿孔杯中，實施電穿孔。然后在Bio-RadGenePulserII中以1.8kV、25jaF和200Q對電穿孔杯進行脈沖。之后細胞在1ml2YT(Difco)中37"C培養(yǎng)4小時，將整個1ml鋪在具有10jug/ml壯觀霉素的LB瓊脂(Difco)上，37X:孵育2-3天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得壯觀霉素抗性菌林中的質(zhì)粒pKD46，產(chǎn)生菌林s4397-109-2。實施例3以下實施例描述通過以導(dǎo)致glcB及aceBAK基因產(chǎn)物組成型地過量表達的方式將tac啟動子引入大腸桿菌glcB上游以及aceBAK操縱子上游的位置，制備超量產(chǎn)生蘋果酸合酶及異檸檬酸裂解酶的菌林。通過用來自質(zhì)粒pKD4(Datsenko和Wanner)的編碼卡那霉素抗性基因的線性DNA轉(zhuǎn)化菌林s4370-69-2，將tac啟動子(deBoer等，1983:和圖5)插入菌林s4397-109-2的野生型aceB基因上游(圖3)。在使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和tacaceB-kan3(SEQIDNO:11)(所有引物序列列在圖4中)的PCR中，質(zhì)粒pKD4被用作模板。該PCR產(chǎn)物含有卡那霉素抗性基因，在該基因的側(cè)翼為與菌林MG1655(Blattner等，1997)的aceB等位基因序列同源的序列，其中tac啟動子替代了該aceBAK啟動子(Chung等，1988)。使用Advantage-HFPCR試劑盒(Clontech)遵循廠商指導(dǎo)進行該PCR。50ji1反應(yīng)物包括51lOxHFPCR反應(yīng)緩沖液(Clontech專有配方)、5ju110xHFdNTP混合物(Clontech專有配方)、1ju150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、ImMEDTA、5mM2-巰基乙醇、0.25%Thesit、1.1|ig/ji1TagStart抗體、Clontech專有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和Clontech專有量的DeepVentDNA聚合酶組成)、每種引物(100pmo1/p1)各0.5|i1和1|i1模板DNA(卜50pg/ji1)。按如下在AppliedBiosystems9700熱循環(huán)儀中進行循環(huán)94X:預(yù)處理4分鐘，然后25個循環(huán)，每個循環(huán)為94X:10秒、55°C30秒和68'C90秒。然后使用PCR產(chǎn)物，才艮據(jù)具有以下改變的以前描述過的方案(Datsenko和Wanner,2000),轉(zhuǎn)化帶有質(zhì)粒pKD46的菌林s4370-109-l:將帶有質(zhì)粒pKD46的菌林s4370-109-l在定軌搖床上30匸生長的50mlLB(Difco)培養(yǎng)物，于250ml帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)至OD,為0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培養(yǎng)物再生長2.0小時，此時根據(jù)Datsenko和Wanner(2000)的方案制備電感受態(tài)細胞。通過將1.0-3.0ng沉淀的PCR產(chǎn)物懸浮在45p1電感受態(tài)細胞中并將該混合物轉(zhuǎn)移至0.lcm電穿孔杯中，實施電穿孔。然后在Bio-RadGenePulserII中以1.8kV、25yF和200Q對電穿孔杯進行脈沖。之后細胞在lml2YT(Difco)中37C培養(yǎng)4小時，將整個lml鋪在具有50jug/ml卡那霉素的LB瓊脂(Difco)上，37"C孵育1-2天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得卡那霉素抗性菌抹中的質(zhì)粒pKD46，產(chǎn)生菌株s4538-006-l。實施例4以下實施例i兌明通過將tac啟動子放置于glcB和aceBAK操縱子上游并驅(qū)動glcB和aceBAK操縱子表達以提供組成型高表達水平的乙醛酸支路酶。乙酪酸支路基因的表達水平通過測量蘋果酸合酶和異檸檬酸裂解酶的酶比活性水平來評價。用于酶試驗的培養(yǎng)物在補充了0.1%(w/v)水解酪蛋白氨基酸(Difco)和0.4%(w/v)葡萄糖或0.4%(w/v)甘油與0.4%乙酸鈉(w/v)的組合的50mlDavis基本培養(yǎng)基(Difco)中于250ml帶擋板的搖瓶中在NewBrunswickG53搖床上240rpm、37C培養(yǎng)。才艮據(jù)Ornston和Ornston(1969)的方法，通過J艮蹤游離輔酶A自乙酰輔酶A的乙醛酸依賴性釋放，測量蘋果酸合酶的水平。根據(jù)Maloy等(1980)的方法，通過跟蹤乙醛酸的異檸檬酸依賴性生產(chǎn)，測量異檸檬酸裂解酶的水平。表2顯示相對于野生型，將tac啟動子引入aceB基因之前可以增加蘋果酸合酶和異檸檬酸裂解酶兩者的酶水平而無論是使用葡萄糖還是使用甘油加乙酸鹽進行培養(yǎng)。表2還顯示將tac啟動子引入glcB基因之前極大地增加蘋果酸合酶的水平，但是異檸檬酸裂解酶水平不變。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表2.7種過表達菌林以及親本菌林(s4370-69-"的蘋果酸合酶和異檸檬酸裂解酶比活性。每種菌林/培養(yǎng)基組合最少分析6次并顯示平均值。這些菌林在具有0.1。/。水解酪蛋白氨基酸(Difco)的Davis基本培養(yǎng)基(Difco)中生長。碳源為0.4%葡萄糖或者0.4%甘油+0.乙酸鈉。實施例5以下實施例說明過表達乙醛酸支路酶在增加蘇氨酸生產(chǎn)菌株中的蘇氨酸產(chǎn)率及效價中的用途。使用培養(yǎng)基BTC3(1.0g/lK2HP04，10.0g/1(NH4)2S04，40.8g/1Bis-Tris，20ml/1的50%固體玉米漿(Sigma),25.Og/l葡萄糖，和1.2g/1MgS04-7H20pH7.0)，在搖瓶中檢測這些過表達菌林的性能。使用活躍生長的LB(Difco)培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基BTY2(1.0g/1K2HP04，10.0g/1(NH4)2S04，40.8g/1Bis-Tris，15g/1酵母提取物(Difco)，32.5g/1葡萄糖和1.2g/1MgS04-7H20pH7.0)(0.1ml于20mlBTY2中)。18小時后，將0.25mlBTY2傳代至20mlBTC3中。再24小時后，收獲BTC3培養(yǎng)物，并測定蘇氨酸和葡萄糖的濃度。所有培養(yǎng)物在250ml帶擋板的搖瓶中于NewBrunswickG53搖床上240rpm、37。C生長。結(jié)果顯示在表3、4和5中。表3、4和5.搖瓶中突變菌林的蘇氨酸生產(chǎn)。培養(yǎng)物在培養(yǎng)基BTC3中生長并且測定蘇氨酸和葡萄糖的濃度。所示代表性實驗為每個菌抹6個搖瓶的平均值。當不同表顯示相同菌林時，結(jié)果以周隔開。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實施例6實施例6包括通過引入包括與大腸桿菌的天然glcB啟動子可操作地連接的lac啟動子的質(zhì)粒，制備過表達蘋果酸合酶G的菌林。實施例6是一個預(yù)示性實施例。實施例6中的實驗和程序尚未實施，并僅旨在進行舉例說明。構(gòu)建含有來自大腸桿菌菌林s4370-69-2的glcB基因的基于pUC的質(zhì)粒，其中所述基因與該基于pUC的質(zhì)粒的lac啟動子可操作地連接。該質(zhì)粒的構(gòu)建可以通過本領(lǐng)域已知的方法基于本公開進行。通過電穿孔將lac::glcB質(zhì)粒引入s4370-69-2親本菌林，產(chǎn)生通過lac啟動子的運作過表達glcB的菌株。該質(zhì)粒的包含可以通過限制性作圖和Southern印跡分析來展示。在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)本實施例中產(chǎn)生的菌抹以顯示glcB的表達水平。此培養(yǎng)基可以是，但不限于，補充水解酪蛋白氨基酸及葡萄糖或者甘油和乙酸鈉的組合的Davis基本培養(yǎng)基。與親本菌林的相似實驗相比，蘋果酸合酶G的水平增加，這可以通過與親本菌林中的比活性相比高最低2倍至最高75倍的比活性來說明。蘋果酸合酶G水平的增加導(dǎo)致修飾菌林中L-蘇氨酸的生產(chǎn)與親本菌林中L-蘇氨酸的生產(chǎn)相比增加，這可以通過如上所述在諸如BTC3等培養(yǎng)基中培養(yǎng)該修飾菌林來證明。含有質(zhì)粒的該修飾菌林的培養(yǎng)物的L-蘇氨酸產(chǎn)率比親本菌林增加多達10%。本文中引用或提及的專利、專利申請、出版物、科學(xué)文獻、書籍、網(wǎng)址及其它文獻和資料指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。這些引用的文獻和資料均特此并入作為參考，就如同將這些文獻和資料各自單獨地以參考方式完整地并入或者完整地陳列或重印在此處。此外，要求)特此完整地并入本發(fā)明的說明書中并構(gòu)成本發(fā)明說明書的一部分。申請人保留將來自任何此類專利、申請、出版物、科學(xué)文獻、網(wǎng)有資料和信息物理地并入本說明書中的權(quán)利。申請人保留物理地并入到本文件任何部分，包括說明書的任何部分和以上提及的權(quán)利要求(包括但不限于任何原始權(quán)利要求)中的權(quán)利。本發(fā)明已經(jīng)在本文中進行了寬而一般性的描述。落入此上位公開中的任何較窄類型和下位的組也構(gòu)成這些發(fā)明的部分。這包括每個發(fā)明的一般描述，該描述(包括其任何權(quán)利要求)特此包括自該類中除去或任選地允許除去任何主題的前提條件或否定限制，無論所排除的所有此類變異方案均形成本發(fā)明原始說明書的一部分。此外，當以馬庫什組描述發(fā)明的特征或方面時，該發(fā)明應(yīng)由此理解為就該馬庫什組的每一個和所有及任何單個成員或成員亞組進行了描述。在缺少本文中未具體公開的或者本文中未描述為必要的任何一個或多個元素、一個或多個限制因素的情況下實施。因此，例如，術(shù)語"包含，，、"包括，，、"含有，，、"例如"等應(yīng)以開放式的非限制方式來理解。本發(fā)明人在要求保護其發(fā)明時，保留將任何過渡性短語替換為任何其它的過渡性短語的權(quán)利，并且本發(fā)明應(yīng)理解為包括這些替換后的過渡方案并構(gòu)成本發(fā)明原始說明書的部分。因此，例如，術(shù)語"包含，，可以用過渡性短語"基本上由……組成"或"由……組成，，之任一替換。正如本文及所附權(quán)利要求中使用的，除非上下文有清楚的相反說明，否則單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括對復(fù)數(shù)的提及。例或?qū)嵤┓桨富蚍椒?。在任何情況下都不得將本專利解釋為限于專利商標局的任何審查員或任何其它官員或雇員所作出的任何言論，除非請人特別地且無附加條件或無保留地明確采納了該言論。本文中使用的術(shù)語和措詞作為描述性而非限制性術(shù)語進行使用，在這些術(shù)語和措詞或其任何部分的使用中無意排除目前已知的或者以后出現(xiàn)的任何等同物，不論該等同物是否在本文中進行過陳述或顯示或描述，也不論該等同物是否被認為可預(yù)期的，而是應(yīng)認可，各種修飾均在所要求保護的發(fā)明的范圍內(nèi)，不論這些權(quán)利要求在授權(quán)時是否因任何原因進行過或未進行過改變或修改。因此，應(yīng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案和可選特性進行了具體公開，但是其中包含本文描述的具體方法和組合物是優(yōu)選實施方案的代表，是示例性的，不旨在限制本發(fā)明的范圍。其它的目的、方面和實施方案將是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說明書后所明了的，包括在由權(quán)利要求的范圍所定義的發(fā)明的精神內(nèi)。在給出實施例的地方，說明書應(yīng)解釋為包括但不僅僅限于這些實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于明了可以對此處公開的本發(fā)明進行各種替代和修飾而不偏離本發(fā)明的范圍和精神，而且從本發(fā)明的描述(包括本文中以舉例說明性方式給出的描述)，顯然可以使用各種修飾方案和等價方案來實現(xiàn)本發(fā)明的構(gòu)思而不偏離其范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可以在形式和細節(jié)上進行改變而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。所描述的實施方案應(yīng)在所有方面均被視為舉例說明性的而非限制性的。因此，例如，其它的實施方案也落入本發(fā)明的范圍以及以下權(quán)利要求中。權(quán)利要求1.通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸產(chǎn)品的方法，包括(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌，其中所述細菌產(chǎn)生所述L-氨基酸并且含有重組核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體具有使得至少一種選自由aceBAK操縱子中的基因和glcB基因組成的組的基因在所述細菌中過表達的可操作配置；(b)在發(fā)酵培養(yǎng)基和細菌中的至少一種中富集所述L-氨基酸；和(c)從發(fā)酵培養(yǎng)基和細菌中的至少一種中分離所述L-氨基酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌是大腸桿菌(EscherichiacolU菌抹。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組核酸包含可操作地連接在所述至少一種基因上游的啟動子序列，該啟動子序列對于所述aceBAK操縱子或glcB基因是非天然的。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述啟動子選自tac啟動子、trc啟動子、lac啟動子、trp啟動子、入-Pt啟動子、入-PR啟動子、lacUV5啟動子、araBAD啟動子、lpp啟動子和lpp-lac啟動子。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種基因選自aceB、aceA和glcB.6.權(quán)利要求3的方法，其中所述非天然啟動子替代所述aceBAK操縱子和glcB基因中的至少一個的天然啟動子，并且其中所述天然啟動子被缺失或間斷。7.權(quán)利要求3的方法，其中插入所述非天然啟動子而不造成所述aceBAK操縱子和glcB基因中的至少一個的天然啟動子的缺失。8.權(quán)利要求l的方法，其中僅所述至少一種基因在所述細菌中過表達。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述L-氨基酸選自L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸、L-賴氨酸和L-甲硫氨酸。10.包含重組核酸的細菌，其中所述重組核酸具有使至少一種選自由aceBAK操縱子中的基因和glcB基因組成的組的基因在所述細菌中過表達的可操作配置。11.權(quán)利要求io的細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌林。12.權(quán)利要求io的細菌，其中所述重組核酸包含可操作地連接在所述至少一種基因上游的啟動子序列，該啟動子序列對于所述aceBAK操縱子或glcB基因是非天然的。13.權(quán)利要求12的細菌，其中所述非天然啟動子選自Uc啟動子、trc啟動子、lac啟動子、trp啟動子、入-Pt啟動子、入-Pa啟動子、lacUV5啟動子、araBAD啟動子、lpp啟動子和lpp-lac啟動子。14.權(quán)利要求12的細菌，其中所述aceBAK操縱子的天然啟動子被該非天然啟動子替代。15.權(quán)利要求12的細菌，其中在所述aceBAK操縱子中插入所述非天然啟動子而不置換或間斷所述aceBAK操縱子的天然啟動子。16.權(quán)利要求13的細菌，其中所述glcB基因的天然啟動子被所述非天然啟動子替代。17.權(quán)利要求13的細菌，其中所述非天然啟動子與所述glcB基因可操作地連接而不替代與所述glcB基因可操作地連接的天然啟動子。18.選自具有如下保藏號的菌林及其衍生物的細菌菌林NRRLB-30843、NRRLB-30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和證LB-30851。19.包含非天然啟動子的重組核酸，其中該重組核酸具有使編碼大腸桿菌aceA蛋白、aceB蛋白和glcB蛋白中的至少一種蛋白的基因在細菌中過表達的可操作配置，并且其中所述基因包括以下中的至少一個a)編碼選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:8的蛋白質(zhì)的DM;b)才艮據(jù)SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25中的至少一個的核酸；c)僅就遺傳密碼而言與根據(jù)b)的核酸簡并的核酸;d)含有根據(jù)a)或b)的核酸的沉默突變的核酸；e)與b)的核酸至少80。/。一致的核酸；或f)在嚴緊條件下與根據(jù)b)的DNA雜交的核酸。20.包含權(quán)利要求19的至少一種核酸的載體。全文摘要本發(fā)明提供在生產(chǎn)天冬氨酸衍生的氨基酸及化學(xué)品方面具有改良性質(zhì)的微生物株。本發(fā)明還提供制備此類株系的方法。這些方法包括改變aceBAK操縱子、glcB基因或者兩者的表達。表達的改變可以通過增加轉(zhuǎn)錄、解除天然的轉(zhuǎn)錄控制和/或其它方式來實現(xiàn)。也可以考慮置換這些基因的天然啟動子；例如，可以用tac啟動子(Ptac)置換它們的天然啟動子。文檔編號C12P13/00GK101365797SQ200680030255公開日2009年2月11日申請日期2006年6月20日優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日發(fā)明者J·N·德里亞,S·W·喬丹申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司