專利名稱：：高產(chǎn)率和高產(chǎn)量制造木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及高產(chǎn)率和高產(chǎn)量制造木糖醇的方法，更具體地，涉及利用產(chǎn)木糖醇微生物的木糖醇脫氫酶缺陷突變體高產(chǎn)率和高產(chǎn)量制造木糖醇的方法。
背景技術(shù)：
：木糖醇，一種五碳糖醇，在食品和糖果工業(yè)中用作天然甜味劑。它有抑制牙齲菌變形鏈球菌(Streptococcusmutans)生長的抗齲齒療效(參見:Makinen，K.K,，J.Appl.Nutr.,44:16-28(1992))。其甜度與蔗糖相等，并且可以重量對重量的基準代替蔗糖。當溶解于水中時，木糖醇具有低粘度和負熱效應(yīng)，并且不需要胰島素來調(diào)節(jié)代謝。由于這些優(yōu)點，木糖醇在食品工業(yè)中的應(yīng)用正在快速增長。當前，通過化學(xué)還原主要從木材水解產(chǎn)物衍生的D-木糖來大規(guī)模生產(chǎn)木糖醇。D-木糖是在木質(zhì)纖維素中發(fā)現(xiàn)的主要戊糖，并且是第二位最豐富的天然糖(參見:Ladisch，M.R."etal.，EnzymeMicrob.Technol.，5:82-102(1983))。傳統(tǒng)的木糖醇生產(chǎn)方法包括四個步驟植物材料的酸水解，純化水解產(chǎn)物得到純D-木糖，D-木糖氫化作用得到木糖醇以及和木糖醇的結(jié)晶化(參見Aminoff，C.，etal.，InCounsdl，J.N.(ed.).Xylitol.AppliedSciencePublishers,London,p.1-9(1978))。但是，純D-木糖的純化是高成本并造成污染的步驟(參見Kind，V.B.,etal,,Gidroliz.Lesokhim.Promst,3:11-12(1987))。另外，用Raney鎳金屬催化劑在高溫高壓下將D-木糖氫化為木糖醇很危險并引起污染(參見Hyv6nen，L.，etal"InAdvancesinFoodResearch,Vol.28,edsChishester,C.O.,Mrak，E.M.和Stewart,G..,AcademicPress,NewYork,pp.373-403(1982))?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)木糖醇生產(chǎn)方法的缺點，包括髙污染水平和廢物處理的顧慮，激發(fā)了研究者去開發(fā)其生產(chǎn)的替代途徑。最具吸引力的方法之一是生物生產(chǎn)。生物生產(chǎn)不需要高純度的底物D-木糖，并且是安全環(huán)保的方法。木糖醇由天然同化(assimilating)木糖的酵母和真菌，如管囊酵母(Pachysolentannophiulus)、季也蒙氏假絲酵母(Candidaguilliermondii)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)產(chǎn)生(參見Dahiya，J.S.，Can.J.Microbiol"37:14-18(1991)，Yahashi,Y.，etal.，J.Ferment.Bioeng.，81:148-152(1996),Kim，S.Y.，etal.，F(xiàn)oodSci.Biotechnol"7:282-285(1998)，Morimoto,S.,etal"J.Ferment.Technol.，64:219-225(1986))。雖然據(jù)報告假絲酵母(Candidasp.)是最具活性并因而可能是最有用的菌株，但是由于與底物D-木糖(木糖醇的低產(chǎn)率昂貴原料)有關(guān)的高生產(chǎn)成本，木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)尚待實現(xiàn)。為開發(fā)更低成本的生產(chǎn)方法所進行的努力包括采用對溶解氧的控制(參見Kim,S.Y.等的美國專利5,686,277(1997))。但是，在工業(yè)化規(guī)模中將溶解氧控制在0.8-1.2%的水平并不容易，結(jié)果是，木糖醇產(chǎn)率低于70%,并且生產(chǎn)率不能實現(xiàn)經(jīng)濟效益。為了解決這些問題，本領(lǐng)域一直存在對利用代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)率和高產(chǎn)量的產(chǎn)木糖醇的新型菌株的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用產(chǎn)木糖醇微生物的木糖醇脫氫酶缺陷突變體，高產(chǎn)率和高產(chǎn)量地制造木糖醇的方法。該目的通過阻斷或滅活目的基因的表達，修飾產(chǎn)木糖醇微生物的代謝途徑來實現(xiàn)，所述微生物優(yōu)選天然同化木糖的酵母和真菌。因此，本發(fā)明的主要目的是通過利用木糖醇脫氣酶的表達被部分木糖醇脫氫酶基因的缺失、替換或添加所阻斷的遺傳修飾的微生物，提供高產(chǎn)率和高產(chǎn)量制造木糖醇的方法。本發(fā)明的上述和其他目的和特征從下文的描述結(jié)合附圖將更為顯而易見，其中-圖1是酵母中木糖代謝的示意圖。圖2是pXYL2-Ura3的限制性酶切圖譜。質(zhì)粒pXYL2-Ura3用于阻斷熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因?？s寫xyl2，木糖醇脫氫酶基因；Ura3，乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因。圖3是在2.5升發(fā)酵罐中，熱帶假絲酵母的木糖醇脫氣酶基因阻斷的突變體的木糖醇發(fā)酵分布圖。甘油用作初始細胞生長和輔因子再生的共底物。符號，細胞干重；o，D-木糖；甘油；▽，木糖醇。圖4是顯示輸氧速率(OTR)對木糖醇生產(chǎn)動力學(xué)的影響的分布圖。虛線和實線分別指示D-木糖和木糖醇濃度。符號t，OTR,lOmmol02rV(300rpm);o，OTR，24mmo1021"h"(400rpm);，OTR，42mmo1021"1T1(500rpm)。圖5是熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因阻斷的突變體在2.5升發(fā)酵罐中的補料(fed-batch)培養(yǎng)分布圖。護，細胞干重；，葡萄糖；o，D-木糖；y，甘油；▽，木糖醇。圖6是熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因阻斷的突變體在2.5升發(fā)酵罐中的補料培養(yǎng)分布圖?！?，細胞干重；，葡萄糖；o，D-木糖；t，甘油；▽，木糖醇。發(fā)明詳述I.產(chǎn)木糖醇微生物的遺傳修飾本發(fā)明提供了制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)木糖醇微生物的木糖醇脫氫酶缺陷突變體，直至培養(yǎng)基中所含的木糖被完全消耗的步驟，所述突變體的木糖醇脫氫酶的表達被部分木糖醇脫氫酶基因的缺失、替換或添加所阻斷。產(chǎn)木糖醇微生物包括天然同化木糖的酵母和真菌，優(yōu)選假絲酵母并更優(yōu)選利用季也蒙氏假絲酵母(Candidaguillermodi)、近平滑假絲酵母或熱帶假絲酵母。碳源、氮源和微量元素沒有特別限制。在優(yōu)選的實施方案中，甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、纖維二糖或這些材料的混合物被用作木糖醇生產(chǎn)的細胞生長和輔因子再生的碳源，酵母提取物用作氮源，磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂或這些材料的混合物用作微量元素。另外，產(chǎn)木糖醇菌株的發(fā)酵條件不受特別限制。在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)酵溫度的范圍從20。C至40。C。更具體的描述如下通常，在制造木糖醇的生物方法中，用同化木糖的酵母和真菌從木糖生產(chǎn)木糖醇。如圖1所示，多數(shù)同化木糖的酵母經(jīng)兩個酶氧化還原反應(yīng)，用木糖還原酶(EC1丄1.21)和木糖醇脫氫酶(EC1丄1.9)利用木糖(參見Alexander,M.A.，etal.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，29:478-486(1988))。木糖還原酶催化D-木糖還原成木糖醇，木糖醇脫氫酶催化木糖醇氧化成D-木酮糖。D-木酮糖被木酮糖激酶轉(zhuǎn)化為5-磷酸D-木酮糖，然后進入磷酸戊糖途徑。木糖醇脫氫酶需要NAD作為輔因子，而木糖還原酶則利用NAD(P)H。因此，木糖同化作用的整體效率與木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的活性相關(guān)聯(lián)。在利用木糖的酵母，具柄畢赤氏酵母(Pichiastipitis)中，木糖還原酶和木糖醇脫氫酶分別由XYL1和XYL2編碼(參見Amore，R.,etal.，Gene,109:89-97(1991)，K6tter，P.，etal"Curr.Genet"18:493-500(1990))。由木糖制造木糖醇的主要的產(chǎn)率限制因素是木糖醇在細胞生長和維持中的消耗。因此，如果從木糖醇向D-木酮糖的代謝步驟通過使相應(yīng)的酶，木糖醇脫氫酶的失活而阻斷，并且如果補充細胞生長和輔因子再生的共底物，則木糖醇的產(chǎn)率應(yīng)該達到理論上100%的水平。為了分析木糖醇脫氫酶基因XYL2的DNA序列，利用基于具柄畢赤氏酵母中XYL2基因的序列設(shè)計的引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，從熱帶假絲酵母的基因組DNA擴增部分推測的XYL2基因。純化擴增的DNA片段并插入pGEM-TEasy中。對部分XYL2基因進行測序，隨后測定完整的核苷酸序列。利用XYL2基因的DNA序列，通過缺失、替換或添加，構(gòu)建不能表達酶活性的修飾的木糖醇脫氫酶基因。然后，構(gòu)建基因阻斷的質(zhì)粒pXYL2-Ura3。將用pXYL2-Ura3擴增的線性阻斷DNA片段插入宿主菌株熱帶假絲酵母中，并選擇其木糖醇脫氫酶基因被同源重組所滅活的突變體。II.木糖醇的生產(chǎn)在含有50ml木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml燒瓶中對遺傳修飾的菌株的木糖醇的生產(chǎn)進行評估。木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基由D-木糖、葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂組成。修飾的菌株以100%的產(chǎn)率將D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。但是，并非培養(yǎng)基中的所有D-木糖都轉(zhuǎn)化為木糖醇，表明被修飾的菌株消耗的所有D-木糖都被轉(zhuǎn)化為木糖醇，木糖醇生產(chǎn)受到缺乏木糖還原酶所需的輔因子的限制，因為木糖醇不能被進一步代謝再生輔因子。木糖醇生產(chǎn)期間，為了輔因子再生，需要另外的共底物碳源，因而篩選各種碳源用于木糖醇生產(chǎn)的效率。在含有50ml木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基和各種共底物的250ml燒瓶中進行木糖醇發(fā)酵。雖然細胞在含有葡萄糖作為共底物的培養(yǎng)基中生長最好，但是在用甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖和纖維二糖作為共底物時木糖醇的生產(chǎn)更有利。特別是，在甘油用作共底物時，培養(yǎng)基中的所有D-木糖都轉(zhuǎn)化為木糖醇。當熱帶假絲酵母的遺傳修飾突變體用甘油作為共底物分批培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的D-木糖在大約48小時內(nèi)被完全消耗，并產(chǎn)生產(chǎn)率98.3。/。和容積產(chǎn)率0.97gl"h"的木糖醇。但是，在補料培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)基中的D-木糖在大約14-15小時內(nèi)被消耗，并產(chǎn)生產(chǎn)率為97-100%和容積產(chǎn)率為3.48gl"h"的木糖醇。結(jié)果是，這表明了補料培養(yǎng)生產(chǎn)木糖醇比分批培養(yǎng)更有效。另一方面，在攪拌速度300-500rpm和輸氧速率(OTR)10-42mmolC^l"h"的條件下，補料培養(yǎng)熱帶假絲酵母的突變體時，木糖醇產(chǎn)量在1.4-3.5gl"h"的范圍內(nèi)變動，木糖醇產(chǎn)率不變。特別是，在攪拌速度500ipm和輸氧速率(OTR)42mmo1021"h"的條件下，木糖醇的產(chǎn)量最大。但是，在攪拌速度300rpm和輸氧速率(OTR)42mmo1021"h"的條件下進行補料培養(yǎng)工作的情況下，木糖醇產(chǎn)量沒有明顯降低。結(jié)果是，可以得出結(jié)論，攪拌速度和輸氧速率(OTR)影響甘油同化速率和隨后的木糖醇生產(chǎn)速率。為了低成本生產(chǎn)木糖醇，通過利用玉米芯的水解產(chǎn)物，補料培養(yǎng)熱帶假絲酵母的遺傳修飾突變體，所述玉米芯水解產(chǎn)物是一種主要含有木糖成分的廢料，能給出與利用純D-木糖相似的木糖醇產(chǎn)率。因此，已發(fā)現(xiàn)玉米芯的水解產(chǎn)物代替D-木糖，能以低成本方式用作生產(chǎn)木糖醇的底物。本發(fā)明通過下列實施例進一步進行說明，所述實施例不能用于限制本發(fā)明的范圍。實施例l.-構(gòu)建熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶缺陷突變體用總DNA提取試劑盒制備熱帶假絲酵母的基因組DNA。部分XYL2基因經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行擴增。所用引物的DNA序列如下所示引物XYL2-F:5，-aatggtcttgggtcacgaatcc-3，(SEQIDNO:l)引物XYL2-R:5，-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3,(SEQIDNO:2)產(chǎn)生的片段用PCR產(chǎn)物純化試劑盒提純，然后插入pGEM-TEasy載體中(PROMEGA,USA)。然后，在克隆在pGEM-TEasy載體中的XYL2基因片段的兩端，導(dǎo)入Bamffl限制性酶的兩個靶位點，形成的質(zhì)粒稱作pGEM-XYL2。用引物Ura3-F和Ura3-R，通過PCR利用熱帶假絲酵母的基因組DNA擴增1.2-kb的URA3基因。所用引物的DNA序列如下所示引物Ura3-F:5，-ggatccattctagatgatctggtttggattgttggag-3，(SEQIDNO:3)引物Ura3-R:5，-ggatccatctcgagtcatgagaactaaactagcag-3，(SEQIDNO:4)如圖2所示，PCR擴增的URA3基因被插入到pGEM-XYL2中產(chǎn)生pGEM-Ura3。轉(zhuǎn)化熱帶假絲酵母的線性DNA用PCR以引物XYL2-F和XYL2-R進行擴增。產(chǎn)生的DNA片段XYL2-URA3-XYL2用作阻斷盒。熱帶假絲酵母用阻斷盒轉(zhuǎn)化，并在YNB板(6.7gl"的無氨基酸酵母氮源，20g1"葡萄糖和15gr1瓊脂)上選擇。選擇的轉(zhuǎn)化株既在YNB板上又在含木糖作為唯一碳源的木糖板(6.7gr1的無氨基酸酵母氮源，20gl"D-木糖，和15gl"瓊脂)上孵育。選擇可以在YNB上生長但不能在木糖板上生長的突變體，并以PCR證實所選突變體的遺傳修飾。結(jié)果，突變體的木糖醇脫氫酶基因(稱為"BS-xdh")被成功阻斷。實施例2:用遺傳修飾菌株生產(chǎn)木糖醇將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基(3gl'1酵母提取物，3gl"麥芽提取物，5gl"菌胨(bactopeptone)和20gl"葡萄糖)的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器以30。C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)物接種在含有50ml木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基(50gl"D-木糖醇，10gl"葡萄糖，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氫鉀和0.2gl"七水硫酸鎂)的250ml燒瓶中，并用震蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育36小時。每隔6小時取樣(樣品1-7)。分別分析樣品1-7的干細胞濃度(每升培養(yǎng)基的細胞干重)以及D-木糖和木糖醇濃度。用分光光度計(Shimadzu，Japan)在600nm處由樣品的光密度計算細胞干重。用高壓液相色譜(HPLC,Waters,USA)分析D-木糖、木糖醇和各種共底物的濃度，條件是使用Sugar-PakI柱(Waters)，水為流動相，柱溫90°C，流速0.5mlmiiT1。結(jié)果示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表1所示，BS-xdh將12.5gl"木糖轉(zhuǎn)化為12.5gl"木糖醇。木糖醇產(chǎn)率為100%。但是，24小時后，培養(yǎng)基中的D-木糖不再轉(zhuǎn)化為木糖醇，木糖醇的生產(chǎn)停止。D-木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)換率僅為28%，該結(jié)果表明全部的D-木糖并沒有被有效代謝，木糖醇生產(chǎn)受到木糖還原酶所需的輔因子缺乏的限制。實施例3:篩選輔因子再生的共底物將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基(3gl"酵母提取物，3gl"麥芽提取物，5gI—1菌胨和20gI—1葡萄糖)的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器以30。C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)物接種在含有50ml各種木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基(50gl"D-木糖，示于下表2的10gl"的各種碳源，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氫鉀和0.2g"七水硫酸鎂)的250ml燒瓶中，并用震蕩培養(yǎng)器以30°C和200rpm孵育96小時。發(fā)酵結(jié)束后，以前述方式測定產(chǎn)生的干細胞(A)、消耗的各種底物(B)、消耗的D-木糖(C)和產(chǎn)生的木糖醇(D)的濃度。從培養(yǎng)基中超過初始D-木糖濃度的消耗的D-木糖濃度計算D-木糖轉(zhuǎn)化率(E),從產(chǎn)生的超過消耗的D-木糖濃度的木糖醇濃度計算產(chǎn)率(F)。結(jié)果示于表2中。表2千細胞濃度(a)、消耗的共底物(b)、消耗的d-木糖(c)、產(chǎn)生的木糖醇(d)、d-木糖轉(zhuǎn)化率(e)和木糖醇產(chǎn)率(f)的比較碳源a(gr1)b(gr1)c(gl")d(gr1)e(gr1)f(gr1甘露糖2.99.036.436.372.899.6果糖"8.923.323.646.6101.2半乳糖2.79.226.027.052.0103.6麥芽糖2.28.329.927.259.890.9蔗糖4.48.935.536.071.0101.3乳糖0.40.12.52.75.0108.0纖維二糖159.139.438.378.897.2蜜二糖1.11.65.04.010.0訓(xùn)甘油3.29.145.246.290.4102.3醋酸鹽1.09.011.012.322.0112.1葡萄糖酸鹽1.02.13.94.07.8102.2丙酸鹽2.61.91.71.73.4100.0蘋果酸鹽2.10.94.04.18.0102.4如表2所示，當甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖或纖維二糖用作共底物時，可以實現(xiàn)超過90%的木糖醇產(chǎn)率，并且這些共底物的轉(zhuǎn)化率高于葡萄糖(28%)。特別是，當甘油是共底物時，更有助于木糖醇產(chǎn)生。甘油用作共底物時，產(chǎn)率和D-木糖的轉(zhuǎn)化率分別為100%和90%。因而，甘油被選作木糖醇生產(chǎn)的最佳共底物。實施例4:用甘油作共底物的木糖醇生產(chǎn)(I)將如實施例l所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM200710085057.6說明書第10/16頁培養(yǎng)基的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器在30°C和200rpm孵育12小時。將lml種子培養(yǎng)物接種在含有50ml木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基(50gl"D-木糖醇，10gl"甘油，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氫鉀和0.2gr1七水硫酸鎂)的250ml燒瓶中，并用震蕩培養(yǎng)器在30eC和200rpm孵育60小時。在0、6、12、18、24、36、48和60小時分別獲取樣品(樣品11-18)。按照實施例2的描述分析干細胞濃度，D-木糖、甘油和木糖醇的濃度。結(jié)果示于表3中。表3用含有甘油作為共底物的木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基的木糖醇生產(chǎn)分布<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如表3所示，48小時BS-xdh將47.4gl"D-木糖轉(zhuǎn)化為46.6g1"木糖醇。培養(yǎng)基中所有D-木糖被成功轉(zhuǎn)化為木糖醇。該結(jié)果表明，用甘油作為共底物，充分供應(yīng)木糖還原酶所需的輔因子，D-木糖被有效轉(zhuǎn)化并生成木糖醇。另外，木糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為0.97g1"h"和98.3%。實施例5:用甘油作共底物的木糖醇生產(chǎn)(II)將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基的15ml試管中，并用展蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)基接種在含有50mlYM培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并用蔑蕩培養(yǎng)器在30eC和200rpm孵育12小時。將50ml所述種子培養(yǎng)物在pH4.5和30°C下，接種在含有1L補充了20gr甘油的木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基的2.5升發(fā)酵罐(KoBiotech，Korea)中。按照實施例2的描述分析細胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇濃度。結(jié)果示于圖3中。圖3是當甘油用作唯一碳源時，細胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇濃度隨時間改變的分布圖。實心圓(參)指細胞干重，空心圓(O)指D-木糖濃度，實心倒三角(▼)指甘油濃度，空心倒三角(▽)指木糖醇濃度。用于經(jīng)木糖還原酶將D-木糖還原為木糖醇的輔因子通過甘油作為唯一碳源的同化作用再生。發(fā)酵在14小時時終止，木糖醇的終濃度為48.8gl'1。木糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為3.48gl"h"和98yo。實施例6:輸氧速率對木糖醇生產(chǎn)動力學(xué)的影響將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器在30°C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)物接種在含有50mlYM培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并用震蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育12小時。將50ml所述種子培養(yǎng)物在pH4.5和30°C下接種在含有1L補充了20g"甘油的木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基的2.5升發(fā)酵罐(KoBiotech,Korea)中。發(fā)酵試驗在攪拌速度為300、400和500rpm，l.Ovol.vol".miiT1(vvm)通風(fēng)條件下進行。300、400和500rpm的輸氧速率(OTR)分別為10、24、42mmo1021"h—1。木糖醇和D-木糖的濃度變化采用實施例2所述的方法，在不同的OTR條件下，隨時間推移進行分析(參見圖4)。虛線和實線指D-木糖和木糖醇的濃度，實心倒三角(T)指OTR，10mmol021"h"(300rpm);空心圓(O)指OTR，24mmo1021"h"(400rpm);實心圓(*)指OTR,42mmol02r1h"(500rpm)。木糖醇的容積產(chǎn)率取決于攪拌速度和OTR，并且在1.4-3.5g.l".h'1的范圍內(nèi)變動，而木糖醇產(chǎn)率不取決于攪拌速度和OTR，并且在97%和100%的范圍之間。在攪拌速度500rpm和OTR42mmo102rh'1時，容積產(chǎn)率最大，但是在攪拌速度300rpm和OTR42mmo1021"h"的補料培養(yǎng)條件下，并不降低很多。這表明攪拌速度和OTR影響甘油同化率和隨后的木糖醇生產(chǎn)。當BS-xdh將D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇時，充分的氧氣供應(yīng)對于輔因子的快速再生是必需的，并導(dǎo)致高木糖醇產(chǎn)率。這表明BS-xdh的木糖醇產(chǎn)率受到OTR的顯著影響。之前的研究已發(fā)現(xiàn)，當溶解氧的水平控制在0.8%和1.2%之間時，用非代謝工程化的近平滑假絲酵母的木糖醇產(chǎn)率和容積產(chǎn)率最大(參見Kim,S.Y.等美國專利5,686,277(1997))。但是，在工業(yè)規(guī)模上控制0.8-1.2%水平的溶解氧是不容易的，并且結(jié)果是，木糖醇產(chǎn)率低于70%并且產(chǎn)率不能實現(xiàn)經(jīng)濟效率。本實施例6顯示的結(jié)果證實了代謝工程化的突變體BS-xdh以幾乎是理論產(chǎn)率的97-100%產(chǎn)生木糖醇而與02輸送速率無關(guān)。這提示突變體的木糖醇產(chǎn)率產(chǎn)生自通過阻斷木糖醇脫氫酶基因而阻斷木糖代謝，而不是來自細胞胞質(zhì)中的氧化還原失衡。另外，在限制氧氣的條件下，細胞質(zhì)中合成的用于氧化還原平衡的副產(chǎn)物如乙醇和甘油不會在培養(yǎng)基中蓄積，因為培養(yǎng)基中充分供應(yīng)了氧氣。實施例7:用補料培養(yǎng)生產(chǎn)木糖醇(I)含D-木糖作為主要成分的玉米芯的半纖維素水解產(chǎn)物是工業(yè)化制造木糖醇的有經(jīng)濟價值的原材料，因其作為木糖醇前體比純D-木糖價廉得多。另外，在回收過程例如濃縮和結(jié)晶化中，高濃度的木糖醇也很重要。因而，為提高利用玉米芯的木糖醇終濃度，進行補料培養(yǎng)。將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器在30°C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)基接種在含有50mlYM培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并用簾蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育12小時。將50ml所述種子培養(yǎng)物接種在含有1L包括20g1"甘油的木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基的2.5升發(fā)酵罐(KoBiotech，Korea)中，并在pH4.5和30°C下培養(yǎng)。玉米芯水解產(chǎn)物用來制備木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基(IOOgrlD-木糖，7gl"葡萄糖，13gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油，10gl"酵母提取物，5gr1磯酸二氫鉀和o.2gr1七水硫酸鎂)。當D-木糖濃度降至iogr1的水平時，加入200ml補料溶液(feedingsolution)(500gl"D-木糖，35g1"葡萄糖，65gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油)。如實施例2描述的方法，隨時間推移分析細胞干重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的濃度(參見圖5)。實心方塊(B)表示細胞干重，實心圓(參)表示葡萄糖濃度，空心圓(O)表示D-木糖濃度，實心倒三角(V)表示甘油濃度，空心倒三角(V)表示木糖醇濃度。如圖5所見，81小時消耗的D-木糖的總量為167gl"，從D-木糖得到的99。/。產(chǎn)率的木糖醇終濃度為165gl'1。實施例8:用補料培養(yǎng)生產(chǎn)木糖醇(II)將如實施例1所述構(gòu)建的修飾的菌株BS-xdh接種在含有3mlYM培養(yǎng)基的15ml試管中，并用震蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育12小時。將lml所述種子培養(yǎng)物接種在含有50mlYM培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并用震蕩培養(yǎng)器在30。C和200rpm孵育12小時。將50ml所述種子培養(yǎng)物接種在2.5升發(fā)酵罐(KoBiotech，Korea)中，所述發(fā)酵罐含有1L包括20g.l"甘油的木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基，并在pH4.5和30。C下培養(yǎng)。玉米芯水解產(chǎn)物用來制備木糖醇生產(chǎn)培養(yǎng)基(50gl"D-木糖，4g"葡萄糖,7gl"L-阿拉伯糖，20gl"甘油，10gl.1酵母提取物，581"磷酸二氫鉀和0.221"七水硫酸鎂)。當D-木糖濃度降至10gl"的水平時，加入100ml補料溶液(500gl'!D-木糖，35gl'1葡萄糖，65gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油)。由實施例2描述的方法，隨時間推移而分析細胞千重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的濃度(參見圖6)。實心方塊(畫)表示細胞干重，實心圓(參)表示葡萄糖濃度，空心圓(O)表示D-木糖濃度，實心倒三角(V)表示甘油濃度，空心倒三角(V)表示木糖醇濃度。如圖6所見，96小時消耗的D-木糖的總量為186g1"，木糖醇終濃度和木糖醇產(chǎn)率分別為184gl"和99。/。。序列表<110>韓國科學(xué)技術(shù)院(KoreanAdvancedInstituteofScienceandTechnology)<120〉高產(chǎn)率和高產(chǎn)i制造木糖醇的方法(METHODFORMANUFACTURINGXYLITOLWITHHIGH-YIELDANDHIGH-PRODUCTIVITY)<130>SPI070850-47<160>4〈170〉Kopatentln1.71<210〉1<211〉22<212〉DNA<213>ArtificialSequence<220><223〉primer〈400〉1aatggtcttgggtcacgaatcc22〈210〉2<211〉23<212>腿<213>ArtificialSequence〈220〉<223>primer<400〉2gctctgaccaagtcgtaggcttc23<210>3<211>37<212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialSequence<220><223〉primer<400>3ggatccattctagatgatctggtttggattgttggag37<210>4<211〉35<212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificialSequence<220〉<223>primer〈400〉4ggatccatctcgeigtcatgagaactaaactagcag3權(quán)利要求1.一種制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)木糖醇微生物的木糖醇脫氫酶缺陷突變體，直至培養(yǎng)基中所含的木糖被完全消耗的步驟，所述突變體的木糖醇脫氫酶的表達被部分木糖醇脫氫酶基因的缺失、替換或添加所阻斷。2.權(quán)利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中產(chǎn)木糖醇微生物是假絲酵母(Candidasp.)。3.權(quán)利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的假絲酵母是季也蒙氏假絲酵母(C.guillermondi)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)或熱帶假絲酵母(C.tropicalis)。4.權(quán)利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的碳源是甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、纖維二糖或其混合物。5.權(quán)利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的氮源是酵母提取物。6.權(quán)利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的微量元素是磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂或其混合物。7.權(quán)利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的木糖醇脫氫酶缺陷突變體在20'C至40。C下培養(yǎng)。8.權(quán)利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中在攪拌速度為300-500rpm，輸氧速率(OTR)為10mmol021"h"至42mmol02r1h"的條件下補料培養(yǎng)木糖醇脫氫酶缺陷突變體。9.權(quán)利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中木糖以玉米芯水解產(chǎn)物的形式添加到培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明提供了通過利用產(chǎn)木糖醇微生物的木糖醇脫氫酶缺陷突變體，高產(chǎn)率和高產(chǎn)量制造木糖醇的方法。該目標通過阻斷或滅活目的基因的表達，修飾產(chǎn)木糖醇微生物的代謝途徑而得以實現(xiàn)，所述微生物優(yōu)選天然的同化木糖的酵母和真菌。文檔編號C12P7/02GK101255448SQ20071008505公開日2008年9月3日申請日期2007年2月28日優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日發(fā)明者金政會,高秉三申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院;株式會社Lpbio