專利名稱：一種生物涂層劑及其制備方法和在烤煙腋芽控制上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及利用微生物發(fā)酵 原理，從次生代謝產(chǎn)物中篩選出活性成分并加以應(yīng)用的技術(shù)。
技術(shù)背景烤煙是世界上ioo多個(gè)國(guó)家廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，田間栽培管理中的封頂打杈作業(yè)極其勞累費(fèi)力。為提高煙葉產(chǎn)量及減輕勞累，從20世紀(jì)50年代開(kāi)始，許多國(guó)家都先后應(yīng)用化學(xué)藥劑抑制腋芽生長(zhǎng)。 我國(guó)從80年代開(kāi)始，從國(guó)外引進(jìn)Flumetralin (抑芽敏)， Maleichydrazide (抑芽丹、芽敵)、Pendimethalin (除芽通)、 Butradlin (止芽素)等試驗(yàn)使用。這些藥劑的抑芽效果各有千秋， 但都是有機(jī)合成制劑，有殘留毒性，污染環(huán)境，對(duì)烤煙品質(zhì)有影響， 成本也較高，內(nèi)吸性MH類品種目前己經(jīng)禁用。近年來(lái)，為減少或消 除化學(xué)農(nóng)藥大量推廣應(yīng)用帶來(lái)的種種弊端，各國(guó)人民要求控制公害保 護(hù)環(huán)境的呼聲日益高漲，為此，國(guó)際《環(huán)境與發(fā)展大會(huì)》要求21世 紀(jì)初，世界生物農(nóng)藥應(yīng)用比例將提高到占總體農(nóng)藥的60%，世界平均 水平目前不到10%，我國(guó)僅為2%，因此，積極研創(chuàng)生物制劑已是當(dāng)務(wù)之急o發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種更安全，無(wú)毒副作用，不污染環(huán) 境，無(wú)殘毒顧慮，高效價(jià)廉的生物涂層劑，同時(shí)本發(fā)明提供了該生物 涂層劑的制備方法和在烤煙腋芽控制上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的生物涂層劑，其活性成分為e-苯乙醇，分子量為 122，分子式是C6H5CH2-CH2OH，結(jié)構(gòu)式為^V0112""01^""011 。上述生物涂層劑的制備方法，由下列步驟組成:(1) 、從植物中采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCCN0 NO 0357-1的病害標(biāo)本，選擇新鮮、癥狀典型的標(biāo)本進(jìn)行表面消毒，用滅 菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)， 然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔出生物活性強(qiáng)、固 體發(fā)酵物產(chǎn)率為25% 30%、小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)抽提物稀釋至1500 倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復(fù)比較篩選出高產(chǎn)菌株，依序編 號(hào)，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒i:，放入-4(TC -6(TC冰箱保存 備用；
(2) 、培養(yǎng)基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過(guò)濾，加葡萄糖 10 15克，磷酸二氫鉀2.5 3克，動(dòng)物蛋白胨l克，維生素B,5毫 克，檸檬酸O. l克，搖勻，室溫振搖培養(yǎng)8 10天，乙酸乙脂萃取抽 提2次，濃縮，無(wú)水硫酸鈉脫水得粗抽品e-苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇 等，放入-80'C低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> (3) 、將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行室內(nèi)快速生 物測(cè)定篩選，將預(yù)先提取的待測(cè)粗抽品稀釋為100倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26'C溫箱中培養(yǎng) 7天，篩選出活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的菌株培養(yǎng)所得粗品e-苯乙醇，并提供 生測(cè)試驗(yàn)；
(4) 、經(jīng)生測(cè)篩選到活性較高的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應(yīng)用IRV、 UV、 MS，結(jié)合H固R儀器解析，確定活性成分 P-苯乙醇的分子量、分子式和結(jié)構(gòu)式。
將生物涂層劑用于烤煙栽培過(guò)程的腋芽控制上，采用滴涂或淋滴 方式施用，達(dá)到了控制腋芽瘋長(zhǎng)，收到了良好的抑芽效果。該涂層劑 也可用于其它植物的封頂打杈，還可用于花卉、蔬菜保鮮，調(diào)控作物 生育，改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量等。由于本發(fā)明的生物涂層劑是從植物中 采集、分離、培養(yǎng)、萃取、過(guò)濾、干燥而得，整個(gè)加工過(guò)程安全無(wú)毒， 不含有毒成分，因而不污染環(huán)境、無(wú)殘毒，生產(chǎn)成本低，價(jià)格便宜， 每畝成本僅需8 9元，又能增進(jìn)烤煙品質(zhì)，控芽效果平均可達(dá)92% 98%。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的生物涂層劑，其活性成分為e-苯乙醇，分子量為
122，分子式是C6H5CH「CH20H，結(jié)構(gòu)式為Q-CH2"0112""011 。
制備上述生物涂層劑時(shí)，按下列工藝步驟進(jìn)行 (1)、從植物中采集BotrytisCinereaPersr真菌的病害標(biāo)本(己
于1998年送交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏編號(hào)CGMCCNO NO 0357-1),選擇新鮮、癥狀典型的標(biāo)本進(jìn)行表面消 毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進(jìn)行單孢分離、 純化培養(yǎng)，然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔出生物 活性強(qiáng)、固體發(fā)酵物產(chǎn)率為25%~30%、小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)抽提物 稀釋至1500倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復(fù)比較篩選出高產(chǎn) 菌株，依序編號(hào)，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-4(TC -60'C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2) 、培養(yǎng)基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過(guò)濾，加葡萄糖10 15克，磷酸二氫鉀2.5 3克，動(dòng)物蛋白胨l克，維生素B,5毫克， 檸檬酸0.1克，搖勻，室溫振搖培養(yǎng)8 10天，乙酸乙脂萃取抽提2 次，濃縮，無(wú)水硫酸鈉脫水得粗抽品0-苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇等， 放入-80'C低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> (3) 、將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行室內(nèi)快速生物 測(cè)定篩選，將預(yù)先提取的待測(cè)粗抽品稀釋為IOO倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26'C溫箱中培養(yǎng) 7天，篩選出活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的菌株培養(yǎng)所得粗品活性物，例如，我 們從萵苣、蔥、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分離篩選到7個(gè)高產(chǎn) 菌株，按照前述方法分離培養(yǎng)，萃取、濃縮，即可得到粗制品提供生 測(cè)試驗(yàn)；
(4)、經(jīng)生測(cè)篩選到活性較髙的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應(yīng)用IRV (紅外)、UV (紫外)、MS (質(zhì)普)，結(jié)合HNMR儀器解析，確定活性成分P-苯乙醇的分子量、分子式和結(jié)構(gòu)式。
e-苯乙醇向來(lái)認(rèn)為是較好的食品添加劑，用途廣泛， 一直以來(lái) 都是作為天然香料應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其控制植物發(fā)芽
如烤煙腋芽具有很好的效果，平均控芽率達(dá)95%，超過(guò)目前進(jìn)口使用 的化學(xué)型抑芽劑。
目前國(guó)內(nèi)外通常采用有機(jī)化學(xué)合成或用微生物發(fā)酵制取生產(chǎn)3-苯乙醇，在微生物發(fā)酵制取e-苯乙醇時(shí)一般采用啤酒酵母菌或克魯 維酵母菌，將苯丙氨酸、氟苯丙氨酸經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化制取苯乙醇，所用原 料苯丙氨酸、氟苯丙氨酸價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高，不宜規(guī)?；I(yè)生 產(chǎn)；也有采用煙草廢棄物(煙梗、煙末)，適當(dāng)添加培養(yǎng)基，將煙草 中的木質(zhì)素、果膠、多酚類化合物經(jīng)微生物發(fā)酵降解并轉(zhuǎn)化成苯乙醇 的，但所用微生物依然是酵母菌類，且產(chǎn)率不夠高。本發(fā)明利用微生 物發(fā)酵生產(chǎn)P-苯乙醇，所用葡萄孢真菌Botrytis cinerea Persr于 1998年保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 編號(hào)為CGMCCN0 N0 0357-1。
釆用微生物(Botrytis Cinerea Persr)發(fā)酵制備出的P-苯乙醇 用于烤煙腋芽的控制研究，仍然遵循室內(nèi)外結(jié)合的辦法，首先在溫室 內(nèi)盆栽烤煙幼苗若干株，然后將6-苯乙醇配制成0.5%、 1%、 2%…… 8%系列濃度，分別用施藥瓶將1% 2%濃度制劑噴或淋滴到幼苗上，24 小時(shí)后即可觀察到幼苗心葉枯死，而大葉不受傷害，重復(fù)試驗(yàn)3批， 結(jié)果一致，證明該制劑對(duì)烤煙幼芽生長(zhǎng)有強(qiáng)烈觸殺功能。
烤煙幼苗試驗(yàn)證實(shí)P -苯乙醇雖是食品添加劑，但對(duì)控制烤煙腋芽 生長(zhǎng)也有很好的功能，于是可進(jìn)一步加工配制成含有效成分10 25% 的乳油(苯乙醇10 25%、溶劑10 25%、乳化劑8 10%、展散劑 5%)，供烤煙大田期正規(guī)田間試驗(yàn)，具體方法是在大田烤煙生長(zhǎng)到封 頂打杈時(shí)，選擇生長(zhǎng)整齊，高矮基本一致，施肥管理基本相同的地塊 作試驗(yàn)，四周劃保護(hù)行，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)面積30 50株 煙，分別掛牌標(biāo)志，釆用國(guó)內(nèi)普遍推廣應(yīng)用的化學(xué)型抑芽劑(如除芽 通、滅芽靈、抑芽敏、芽?jī)?、止芽素?作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，將生物涂層劑和化學(xué)抑芽劑同田相間排列，重復(fù)四次，按各自使用書(shū)對(duì)水施用，間隔40天，組織有關(guān)試驗(yàn)人員聯(lián)合調(diào)査其效果，隨機(jī)5點(diǎn)取樣，分別 計(jì)算控芽百分率，必要時(shí)采摘芽位的鮮芽稱重。經(jīng)多年、多點(diǎn)田間試 驗(yàn)表明，新型生物涂層劑控制烤煙腋芽的效果達(dá)到92% 98%，超過(guò)化 學(xué)型抑芽劑。加之，安全無(wú)毒副作用，對(duì)環(huán)境友好，無(wú)殘毒顧慮，又 能促進(jìn)烤煙產(chǎn)量質(zhì)量的提高，市場(chǎng)前景好。
權(quán)利要求
1、一種生物涂層劑，其特征在于它的活性成分為β-苯乙醇，分子量為122，分子式是C6H5CH2-CH2OH，結(jié)構(gòu)式為 id="icf0001" file="A2007100930280002C1.tif" wi="45" he="14" top= "33" left = "135" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 一種權(quán)利要求1所述生物涂層劑的制備方法，其特征在于包 括下列步驟-.(1) 、從植物中采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCCNO NO 0357-l的病害標(biāo)本，選擇新鮮、癥狀典型的標(biāo)本進(jìn)行表面消毒，用滅 菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)， 然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔出生物活性強(qiáng)、固 體發(fā)酵物產(chǎn)率為25% 30%、小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)抽提物稀釋至1500 倍仍然有效的菌株，再誘變育種，反復(fù)比較篩選出高產(chǎn)菌株，依序編 號(hào)，將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-4(TC -6(TC冰箱保存 備用；(2) 、培養(yǎng)基每升使用去皮馬鈴薯200克水煮過(guò)濾，加葡萄糖 10 15克，磷酸二氫鉀2. 5 3克，動(dòng)物蛋白胨l克，維生素B,5毫 克，檸檬酸O. l克，搖勻，室溫振搖培養(yǎng)8 10天，乙酸乙脂萃取抽提2次，濃縮，無(wú)水硫酸鈉脫水得粗抽品e-苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇等，放入-8(TC低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?3) 、將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行室內(nèi)快速生 物測(cè)定篩選，將預(yù)先提取的待測(cè)粗抽品稀釋為100倍、200倍……1200 倍系列濃度各5毫升，移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好 浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26。C溫箱中培養(yǎng) 7天，篩選出活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的菌株培養(yǎng)所得粗品苯乙醇，并提供 生測(cè)試驗(yàn)；(4) 、經(jīng)生測(cè)篩選到活性較高的組分，再用柱層析和TLC法純化， HPLC分析，應(yīng)用IRV、 UV、 MS，結(jié)合H麗R儀器解析，確定活性成分 P-苯乙醇的分子量、分子式和結(jié)構(gòu)式。
3、 權(quán)利要求1所述生物涂層劑在烤煙腋芽控制上的應(yīng)用，采用滴 涂或淋滴方式，用來(lái)控制腋芽的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種活性成份為β-苯乙醇的生物涂層劑，是從植物中采集、分離、純化培養(yǎng)，選拔生物活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的株系，進(jìn)行小麥抑芽快速檢測(cè)，再反復(fù)比較篩選出高產(chǎn)菌株，再經(jīng)培養(yǎng)、溶劑萃取、濃縮、干燥而得，將其用于烤煙腋芽的控制上，有效率達(dá)92～98％，整個(gè)加工過(guò)程安全無(wú)毒，不含有毒成份，因而不污染環(huán)境、無(wú)殘毒，生產(chǎn)成本低，價(jià)格便宜，該生物涂層劑也可用于花卉、蔬菜保鮮，調(diào)控作物生育，改善品質(zhì)提高產(chǎn)量等。
文檔編號(hào)C12P7/22GK101313676SQ200710093028
公開(kāi)日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者劉云輝, 劉令輝, 沈嘉祥, 陳正邦 申請(qǐng)人:劉令輝