專利名稱：基于納米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法及應(yīng)用的制作方法
專利說(shuō)明基于納米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法及應(yīng)用 本發(fā)明涉及植物病毒核酸分離及鑒定領(lǐng)域。具體而言，納米磁珠與植物病毒形成磁珠-病毒復(fù)合物，加熱復(fù)合物使病毒核酸釋放到溶液中，實(shí)現(xiàn)病毒核酸的快速提取，涉及植物病毒核酸分離方法、試劑盒及應(yīng)用。植物病毒的分子生物學(xué)的鑒定是研究分子植物病理及預(yù)防控制植物病毒傳播的基礎(chǔ)，植物病毒核酸的提取是分子生物鑒定的前提。目前植物病毒核酸的提取通常采用Trizol試劑方法。然而，這種方法存在一些問題1、操作步驟復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高；2、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，核酸特別是RNA容易降解；3、試劑含有毒有害化學(xué)成分，損害人體污染環(huán)境；4、試劑昂貴，增加實(shí)驗(yàn)成本。
近年來(lái)，磁珠分離動(dòng)物病毒核酸的方法有報(bào)道。這種方法，磁珠吸附的是核酸，病毒首先需要裂解釋放出核酸。缺點(diǎn)如下1、針對(duì)核酸的操作步驟多，包括核酸從病毒釋放，在磁珠表面吸附和從磁珠表面洗脫等，核酸容易受到損害或降解；2、在病毒裂解及核酸吸附過程中往往用到異硫氰酸胍等有毒有害試劑；3、磁珠直徑是微米級(jí)，吸附能力有限。本發(fā)明目的是利用納米磁珠實(shí)現(xiàn)植物病毒核酸的快速提取。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以納米磁珠為載體來(lái)吸附植物病毒。含有植物病毒的水溶液中加入納米磁珠，納米磁珠與病毒形成磁珠-病毒復(fù)合物，外加磁場(chǎng)將復(fù)合物從水溶液液中分離，將復(fù)合物重新分散到水溶液中并加熱，病毒裂解其核酸釋放到溶液中，從而實(shí)現(xiàn)植物病毒核酸的快速提取。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，1、磁珠吸附的是病毒，針對(duì)核酸的直接操作步驟少利于保護(hù)核酸；2、操作方便時(shí)間短，30分鐘可完成操作過程能夠有效地防止核酸特別是RNA的降解，利于下一步的PCR擴(kuò)增；3、不需要有毒或有害試劑，利于身體健康和環(huán)境保護(hù)；4、與微米磁珠相比，納米磁珠比表面積增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)能夠高效富集植物病毒。

圖1不同納米磁珠快速提取植物病毒核酸RT-PCR電泳圖。
圖中1 Marker2 30納米磁珠3 300納米磁珠4 2000納米磁珠5 30納米固定有抗體磁珠6 300納米固定有抗體磁珠7 2000納米固定有抗體磁珠8 陽(yáng)性對(duì)照1.30納米、300納米、2000納米的磁珠按照文獻(xiàn)(Nano Lett. Vol2，pp183，Chem.Phy.Lett.Vol 401，pp19)所描述的方法制備。
2.南芥菜花葉病毒抗體由美國(guó)Agdia公司購(gòu)買。
3.磁珠氨基修飾后通過戊二醛將抗體固定到磁珠上。
4.南芥菜花葉病毒特異引物ArMV-FP/RP由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。
5.含有植物病毒溶液的制備。稱取一定量的帶南芥菜花葉病毒植物葉片，加入1ml PBS緩沖液，在研缽中研磨，收集研磨后的汁液于5000rmp的條件下離心5min，取上清備用。
6.納米磁珠對(duì)病毒的吸附。40μl的病毒汁液上清用60μl的PBS液稀釋，加入納米磁性顆粒混勻，放置30min，其間顛倒混勻樣品數(shù)次。用磁鐵吸附納米磁珠，移除上清，加入200μl PBS清洗納米磁珠。
7.將納米磁珠分散到水溶液中，95℃加熱10min。用磁鐵吸附納米磁珠后，吸取5μl上清做RT-PCR檢測(cè)。Trizol法提取的RNA經(jīng)過RT-PCR后做為陽(yáng)性對(duì)照。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、磁珠吸附的是病毒，針對(duì)核酸的直接操作步驟少利于保護(hù)核酸；2、操作方便時(shí)間短，30分鐘可完成操作過程能夠有效地防止核酸特別是RNA的降解，利于下一步的PCR擴(kuò)增；3、不需要有毒或有害試劑，利于身體健康和環(huán)境保護(hù)；4、納米磁珠能夠高效富集植物病毒。
權(quán)利要求
1.基于納米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于包括下列步驟，1)將納米磁珠加入含有植物病毒的水溶液中，納米磁珠與病毒形成磁珠-病毒復(fù)合物，2)外加磁場(chǎng)將復(fù)合物從水溶液中分離，3)加熱復(fù)合物，病毒裂解其核酸釋放到水溶液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于納米磁珠表面固定有病毒抗體，特異吸附植物病毒形成復(fù)合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于納米磁珠非特異吸附植物病毒形成磁珠-病毒復(fù)合體。
4 根據(jù)權(quán)利要求1和3任何一項(xiàng)所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于納米磁珠的直徑為5-3000納米。
5 根據(jù)權(quán)利要求1和3任何一項(xiàng)所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于納米磁珠的直徑為10-800納米。
6 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸方法的應(yīng)用，其特征在于提取的核酸可應(yīng)用于植物病毒分子生物學(xué)鑒定。
7 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法的應(yīng)用，其特征在于植物病毒為農(nóng)業(yè)部1992年公布的“中華人民共和國(guó)進(jìn)鏡植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄”中的植物病毒。
8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法的應(yīng)用，其特征在于植物病毒為番茄環(huán)斑病毒、番茄黑環(huán)病毒、煙草環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒、煙草脆裂病毒。
全文摘要
將納米磁珠加入含有植物病毒的水溶液中，納米磁珠與病毒形成磁珠－病毒復(fù)合物，外加磁場(chǎng)將復(fù)合物從水溶液中分離，將復(fù)合物重新分散到水溶液中并加熱，病毒裂解其核酸釋放到溶液中，從而實(shí)現(xiàn)植物病毒核酸的快速提取。這種方法步驟少，操作方便；時(shí)間短，能夠有效地防止核酸特別是RNA的降解，利于下一步的PCR擴(kuò)增；不需要有毒或有害試劑，利于身體健康和環(huán)境保護(hù)，納米磁珠比表面積大，能夠高效富集植物病毒。
文檔編號(hào)C12N15/33GK101063128SQ20071010600
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月28日
發(fā)明者聶棱, 江明 申請(qǐng)人:北京金納信生物科技有限公司