專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息集成鑒別道地中藥材的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于以現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)而建立高通量技術(shù)方法，使用 一種或多種分離自人體或動(dòng)植物或微生物的各種組織和器官的細(xì)胞，被巿售檢 測(cè)儀器捕獲的各種細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)信息集成，經(jīng)各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué) 矩陣表示，也可以轉(zhuǎn)換成數(shù)字或字母構(gòu)成的條碼表示，賦予一種或一類(lèi)中藥及 其代謝產(chǎn)物或其復(fù)方制品生物功能的象征標(biāo)記。用于鑒別道地中藥材和飲片及 它們所組方的中成藥，區(qū)別同種物種不同產(chǎn)地及不同物種不同產(chǎn)地的中藥材， 用于指導(dǎo)中藥材的選種、選地、栽培或養(yǎng)殖或培養(yǎng)(克隆)、釆集或終止培養(yǎng)、
加工的控制指標(biāo)；作為一種或一類(lèi)中藥及其代謝產(chǎn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別項(xiàng)目，作 為分離中藥或中成藥的有效組分和有效成分的指標(biāo)或模型。
(二)
背景技術(shù)：
目前，鑒別中藥材的方法往往采用物理方法，化學(xué)方法，生物化學(xué)分析方 法，基因分析方法和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。物理方法包括外觀，氣味，酸堿度，和使 用紫外光譜、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜、核磁共振、透射電鏡、X射線、 薄層分析(TLC)、氣相色譜(GC)、質(zhì)譜(MC)、電子顯微鏡、電感耦合等離子 體原子發(fā)射光譜(ICP)等分析法；化學(xué)方法包括單體的元素分析、結(jié)構(gòu)或基團(tuán) 分析，氨基酸分析，糖組成分析等；生物化學(xué)分析方法包括酶分析，抗體分析 和活性分析等；以上方法用于化學(xué)單體是成功的，但用于中藥分析潛在難以克 服的問(wèn)題。因?yàn)橐晃端幉谋旧砭褪且粋€(gè)大復(fù)方，由已知和未知的含量不等的化 學(xué)成分組成，其中某一種甚至幾種成分或組分的多少或幾個(gè)比例往往難以反映
道地藥材和中草藥的質(zhì)量高低和好壞，對(duì)于由道地藥材和中草藥組成復(fù)方的質(zhì) 量判斷，往往束手無(wú)策。雖然，以上方法已列入中華人民共和囯藥典，尤其是 高效液相色譜分析方法，各版藥典不斷增加，讓它反映中醫(yī)藥理論和鑒別道地 藥材是困難的。
基因分析方法是只測(cè)定中草藥的幾個(gè)比例不到1%堿基的特征位點(diǎn)的堿基 序列，因?yàn)榻^大多數(shù)的中草藥沒(méi)有完成全基因序列的測(cè)定，特征位點(diǎn)的堿基序 列只能說(shuō)明物種或個(gè)體的相似性，不能代表中藥的功效，因?yàn)榛虻谋磉_(dá)與生 態(tài)環(huán)境有關(guān)，所以，基因分析方法用于中藥材質(zhì)量判斷可以作為一個(gè)鑒別項(xiàng)目， 但需要有與功能相關(guān)的指標(biāo)配合。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法是目前常用的藥物研究方法，中國(guó)為中藥材的藥理毒理研究 制訂了一整套的規(guī)范，努力想通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)直接反映中草藥的功效。因?yàn)閯?dòng)物 與人類(lèi)的天生差異，又因?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)的周期長(zhǎng)，成本高，穩(wěn)定性差， 一直沒(méi)有 用于中藥材的質(zhì)量檢測(cè)，也無(wú)法用于道地藥材的鑒別。
中醫(yī)藥是中國(guó)的國(guó)寶，而道地藥材則是寶中之寶。道地藥材是指來(lái)自特定 產(chǎn)區(qū)、生產(chǎn)歷史悠久、栽培和加工技術(shù)精細(xì)、質(zhì)量?jī)?yōu)良、療效顯著的藥材。道 地藥材是優(yōu)質(zhì)藥材的代名詞。道地藥材是一約定俗成的概念，是一個(gè)古代藥物 標(biāo)準(zhǔn)化的概念。它的產(chǎn)生是以幾百年甚至上千年的實(shí)踐教訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)的、 經(jīng)過(guò)臨床的考驗(yàn)的、有著豐富的中醫(yī)藥內(nèi)涵的科學(xué)。中藥材的最大特點(diǎn)和精華 是它的道地性。
從生物學(xué)上說(shuō)，道地藥材的形成是基因型與生境之間相互作用的產(chǎn)物。道 地藥材這一概念的形成和發(fā)展的全過(guò)程都離不開(kāi)特定產(chǎn)地，其本質(zhì)是同一藥材 在不同產(chǎn)地中質(zhì)量最佳者。因此，道地藥材一般在藥材前冠以地名，如陽(yáng)春砂、 宣木瓜、茅蒼術(shù)、岷當(dāng)歸、關(guān)黃柏及四大川藥、四大懷藥、遼五味、浙八味等等。古人早就有了概括"離其本土，則效異"。
今天，大量存在著離開(kāi)道地產(chǎn)區(qū)種植道地藥材，用有人稱(chēng)之為"唯有效成 分論"的化學(xué)藥管理方法鑒定中藥材品質(zhì)優(yōu)劣。收效甚微。導(dǎo)致道地藥材不道 地，甚至瀕臨滅絕，導(dǎo)致中醫(yī)處方不錯(cuò)而療效不好的想象時(shí)常發(fā)生，導(dǎo)致國(guó)內(nèi) 外中藥材巿場(chǎng)信用危機(jī)。問(wèn)題就出在沒(méi)有一種鑒別道地藥材的實(shí)用而有效的方 法。
所以，科學(xué)界、中醫(yī)界和中藥產(chǎn)業(yè)界希望有一個(gè)接近人體的、簡(jiǎn)易的、周 期短的、成本低的，穩(wěn)定性好，與人體相關(guān)性強(qiáng)的鑒別道地藥材的方法出現(xiàn)。 一種基于高通量的細(xì)胞學(xué)信息鑒別道地中藥材的方法是一種可重復(fù)、穩(wěn)定、有 對(duì)應(yīng)相關(guān)和簡(jiǎn)易的新方法。
發(fā)明內(nèi)容
1. 以現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)為基礎(chǔ)建立的快速、微量、體外篩選模 型和測(cè)試方法，結(jié)合自動(dòng)化技術(shù)發(fā)展起來(lái)的已商品化的巿售技術(shù)平臺(tái)或儀器的 一種高通量地從各種細(xì)胞捕獲中藥材細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息技術(shù)。將從各種細(xì)胞捕獲 中藥材細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息經(jīng)組合構(gòu)成的數(shù)值，經(jīng)各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué) 矩陣表示，也可以轉(zhuǎn)換成數(shù)字或字母構(gòu)成的條碼表示，賦予一種或一類(lèi)中草藥 及其代謝產(chǎn)物或其復(fù)方制品的特有信息，作為它們的各種生物功能的象征標(biāo)記。
2. 使用象征標(biāo)記區(qū)別相同物種不同生長(zhǎng)地、不同物種不同生長(zhǎng)地的道地藥 材、中草藥和天然藥物。
3. 使用象征標(biāo)記作為一種或一類(lèi)中草藥及其代謝產(chǎn)物和它們的中成藥質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)的鑒別項(xiàng)目。
4. 使用象征標(biāo)記指導(dǎo)中國(guó)道地藥材、中藥材和飲片及天然藥物的選種、選 地、栽培或養(yǎng)殖或培養(yǎng)(克隆)、釆集或終止培養(yǎng)、加工的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制指標(biāo)。
5.使用象征標(biāo)記作為指標(biāo)或模型分離中國(guó)道地藥材、中草藥和天然藥物中 的有效組分和有效成分分離模型。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是 1.常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)操作
l.l選合適的穩(wěn)定的細(xì)胞株，于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞消化。
1. 2基線測(cè)量取16孔或96孔檢測(cè)板，在每孔中加入50ul細(xì)胞培養(yǎng)基。
1. 3接種細(xì)胞每孔103~104個(gè)/100111。
1.4細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)正常。
1. 5換無(wú)血清培養(yǎng)基后2小時(shí)，加入被測(cè)試樣品。
2. 中藥材提取
取中藥材烘干，打粉，稱(chēng)取中國(guó)藥典中藥材人用量的千分之15的量。加lmL 純凈水，浸泡，超聲，沸水加熱，離心，取上清液備用。
3. 微量中藥材提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中藥材提取液10uL，加入16孔或96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使 用巿售儀器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息。細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息用以下預(yù)先設(shè)定的公式和條 件(編制成軟件)轉(zhuǎn)換成中藥材象征標(biāo)記的數(shù)字或條碼。
3. 1選取橫坐標(biāo)的8 ~ 10個(gè)時(shí)間區(qū)間(8 ~ 10個(gè)數(shù)位)的細(xì)胞學(xué)信息，用0 ~ 9數(shù)字和A Z或相應(yīng)的條碼表示。
3.2以無(wú)中藥材為對(duì)照的細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息為參照點(diǎn)。
4. 使用中藥材細(xì)胞學(xué)象征標(biāo)記的數(shù)字或條碼標(biāo)記相同物種不同生長(zhǎng)地、不 同物種不同生長(zhǎng)地的道地藥材、中草藥和天然藥物。作為它們的鑒別，鑒定， 生產(chǎn)過(guò)程和有效成分分離過(guò)程的一種質(zhì)量控制和指標(biāo)。
圖l、從A549細(xì)胞株(非小型肺癌細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖2、從RBL細(xì)胞株(大鼠嗜堿性白細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖3、從C0S7細(xì)胞株(非洲綠猴腎細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖4、從C0S1細(xì)胞株(非洲綠猴腎細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖5、從3T3細(xì)胞株(成纖維細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖6、從C2C12 (肌原細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖7、從HELA細(xì)胞株(人宮頸癌細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖8、從H印G2細(xì)胞株(人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖9、從MCF7細(xì)胞株(人乳腺癌細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖10、從MCF7/Adr細(xì)胞株(人乳腺癌耐藥細(xì)胞)捕獲的冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞動(dòng)態(tài)
<古自 i口 ,s、
圖ll、從A549細(xì)胞株捕獲的杭白菊與淮菊細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖12、從A549細(xì)胞株捕獲的杭白菊與亳菊、貢菊細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖13、從A549細(xì)胞株捕獲的杭白菊與蘇菊細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖14、從A549細(xì)胞株捕獲的浙貝母與平貝母、土貝母細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖15、從A549細(xì)胞株捕獲的浙貝母與川貝母細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖16、從A549細(xì)胞株捕獲的浙貝母的不同加工方法細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖17、從A549細(xì)胞株捕獲的象山浙貝母與磐安浙貝母細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖18、從A549細(xì)胞株捕獲的溫郁金與廣西郁金細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖19、從A549細(xì)胞株捕獲的臨安元胡與東陽(yáng)元胡細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖20、從A549細(xì)胞株捕獲的浙江磐安玄參與湖北玄參、河南玄參細(xì)胞動(dòng)態(tài) 信息
圖21、從A549細(xì)胞株捕獲的臨安杭白術(shù)與東陽(yáng)杭白術(shù)細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖22、從A549細(xì)胞株捕獲的福建白術(shù)與安徽白術(shù)、河南白術(shù)細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖23、從A549細(xì)胞株捕獲的臨安、東陽(yáng)與磐安杭白芍細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖24、從A549細(xì)胞株捕獲的杭白芍與安徽白芍、河南白芍細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖25、從A549細(xì)胞株捕獲的浙麥冬與湖北麥冬、四川麥冬細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖26、從A549細(xì)胞株捕獲的麻黃與禹白芷細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖27、從A549細(xì)胞株捕獲的關(guān)大力細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖28、從A549細(xì)胞株捕獲的知母細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖29、從A549細(xì)胞株捕獲的川黃連細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖30、從A549細(xì)胞株捕獲的金銀花與板藍(lán)根細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖31、從A549細(xì)胞株捕獲的青蒿細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖32、從A549細(xì)胞株捕獲的大黃細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖33、從A549細(xì)胞株捕獲的火麻仁細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖34、從A549細(xì)胞株捕獲的獨(dú)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖35、從A549細(xì)胞株捕獲的秦艽細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖36、從A549細(xì)胞株捕獲的五加皮細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖37、從A549細(xì)胞株捕獲的廣藿香與蒼術(shù)細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖38、從A549細(xì)胞株捕獲的茯苓細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖39、從A549細(xì)胞株捕獲的車(chē)前子細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖40、從A549細(xì)胞株捕獲的茵陳細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖41、從A549細(xì)胞株捕獲的附子與丁香細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖42、從A549細(xì)胞株捕獲的陳皮與香附細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖43、從A549細(xì)胞株捕獲的山楂細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖44、從A549細(xì)胞株捕獲的檳榔細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖45、從A549細(xì)胞株捕獲的大薊細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖46、從A549細(xì)胞株捕獲的茜草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖47、從A549細(xì)胞株捕獲的白芨細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖48、從A549細(xì)胞株捕獲的艾葉細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖49、從A549細(xì)胞株捕獲的姜黃細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖50、從A549細(xì)胞株捕獲的丹參細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖51、從A549細(xì)胞株捕獲的劉寄奴與馬鞭草細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖52、從A549細(xì)胞株捕獲的三棱細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖53、從A549細(xì)胞株捕獲的半夏細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖54、從A549細(xì)胞株捕獲的苦杏仁與紫菀細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖55、從A549細(xì)胞株捕獲的紫菀與遠(yuǎn)志細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖56、從A549細(xì)胞株捕獲的遠(yuǎn)志細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖57、從A549細(xì)胞株捕獲的鉤藤與天麻細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖58、從A549細(xì)胞株捕獲的石菖蒲細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖59、從A549細(xì)胞株捕獲的黨參與黃芪細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖60、從A549細(xì)胞株捕獲的巴戟天與淫羊藿細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖61、從A549細(xì)胞株捕獲的當(dāng)歸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖62、從A549細(xì)胞株捕獲的北沙參與黃精細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖63、從A549細(xì)胞株捕獲的浮小麥細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖64、從A549細(xì)胞株捕獲的五味子與烏梅細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖65、從A549細(xì)胞株捕獲的山茱萸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖66、從A549細(xì)胞株捕獲的蛇床子細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖67、從A549細(xì)胞株捕獲的六味地黃丸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖68、從RBL細(xì)胞株捕獲的六味地黃丸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖69、從C0S7細(xì)胞株捕獲的六味地黃丸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息 圖70、從3T3細(xì)胞株捕獲的六味地黃丸細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
圖71、從A549細(xì)胞株(非小型肺癌細(xì)胞)捕獲的不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草綜合細(xì) 胞動(dòng)態(tài)信息
圖72、冬蟲(chóng)夏草從A549細(xì)胞株捕獲的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息轉(zhuǎn)換成數(shù)字和條碼
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不 僅限于此。
實(shí)例一從不同細(xì)胞株捕獲的道地藥材(冬蟲(chóng)夏草)細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
1. 取96孔檢測(cè)板，在每孔中分別加入50ulA549、 RBL、 C0S7、 C0S1、 3T3、 C2C12、 HELA、 HepG2、 MCF7、 MCF7/Adr細(xì)胞株培養(yǎng)基，檢測(cè)基線，接入A549、 RBL、 C0S7、 C0S1、 3T3、 C2C12、 HELA、 HepG2、 MCF7、 MCF7/Adr細(xì)胞，使每孔 細(xì)胞濃度為1000 ~ 10000個(gè)/100ul，置于測(cè)試臺(tái)放入二氧化碳培養(yǎng)箱開(kāi)始檢測(cè)。 細(xì)胞生長(zhǎng)18~24小時(shí)后，將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中2小時(shí)后加入加入被測(cè)試樣品。
2. 中藥材提取
取冬蟲(chóng)夏草原藥材烘干，打粉，稱(chēng)取O. 09g。加lmL純凈水，浸泡30分鐘， 超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液備用。
3. 微量中藥材提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中藥材提取液10uL，加入96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使 用巿售儀器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息。見(jiàn)圖1~10,所獲信息提示同一中藥從不同 來(lái)源的細(xì)胞株捕獲到的動(dòng)態(tài)信息不同；
實(shí)例二~九從A549細(xì)胞株捕獲的道地藥材"浙八味"(杭白菊、浙貝 母、溫郁金、元胡、杭白術(shù)、玄參、杭白芍、浙麥冬)與對(duì)應(yīng)的相同中藥名不 同產(chǎn)地藥材的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
1. 取96孔檢測(cè)板，在每孔中加入50ulA549細(xì)胞株培養(yǎng)基，檢測(cè)基線，接 入A549細(xì)胞，使每孔細(xì)胞濃度為1000 10000個(gè)/100ul，置于測(cè)試臺(tái)放入二氧 化碳培養(yǎng)箱開(kāi)始檢測(cè)。細(xì)胞生長(zhǎng)18~24小時(shí)后，將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中2 小時(shí)后加入被測(cè)試樣品。
2. 中藥材提取
取中藥材(不同產(chǎn)地菊花、貝母、郁金、元胡、白術(shù)、玄參、白芍、麥冬) 烘干，打粉，分別稱(chēng)取中國(guó)藥典中藥材人用量的千分之15的量。加lmL純凈水,
浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上 清液備用。
3.微量中藥材提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中藥材提取液10uL，加入96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使用巿售儀 器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息。見(jiàn)圖11~25,所獲信息提示同種物種不同產(chǎn)地及不 同物種不同產(chǎn)地的中藥材，存在明顯差異；
實(shí)例十從A549細(xì)胞株捕獲的41類(lèi)別的54種中藥材，包括相同中藥名不 同產(chǎn)地的中藥材細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
1. 取96孔檢測(cè)板，在每孔中加入50ulA549細(xì)胞株培養(yǎng)基，檢測(cè)基線，接 入A549細(xì)胞，使每孔細(xì)胞濃度為1000 ~ 10000個(gè)/100ul，置于測(cè)試臺(tái)放入二氧 化碳培養(yǎng)箱開(kāi)始檢測(cè)。細(xì)胞生長(zhǎng)18~24小時(shí)后，將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中2 小時(shí)后加入被測(cè)試樣品。
2. 中藥材提取
取54種中藥材(麻黃、禹白芷、關(guān)大力、知母、川黃連、金銀花、板藍(lán)根、
青蒿、大黃、火麻仁、獨(dú)活、秦艽、五加皮、廣藿香、蒼術(shù)、茯苓、車(chē)前子、
茵陳、附子、丁香、山楂、檳榔、大薊、茜草、白芨、艾葉、姜黃、丹參、劉 寄奴、馬鞭草、三棱、半夏、苦杏仁、紫菀、紫菀、遠(yuǎn)志、鉤藤、天麻、石菖
蒲、黨參、巴戟天、淫羊藿、當(dāng)歸、北沙參、黃精、浮小麥、黃芪、五味子、 烏梅、山茱萸、蛇床子)烘干，打粉，分別稱(chēng)取中囯藥典中藥材人用量的千分 之15的量。加lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘， 3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液備用。
3. 微量中藥材提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中藥材提取液10uL，加入96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使用市售儀
器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息。見(jiàn)圖26~66,所獲信息提示按傳統(tǒng)中醫(yī)分類(lèi)的中藥 材，各類(lèi)甚至同類(lèi)中藥材無(wú)一相同；
實(shí)例十一從4種細(xì)胞株捕獲的一種中成藥"六味地黃丸"的、由3個(gè)廠 家生產(chǎn)產(chǎn)品的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息
1. 取96孔檢測(cè)板，在每孔中加入50ulA549、 RBL、 C0S7、 3T3細(xì)胞株培養(yǎng) 基，檢測(cè)基線，接入A549、 RBL、 C0S7、 3T3細(xì)胞，使每孔細(xì)胞濃度為1000 ~ 10000 個(gè)/100ul，置于測(cè)試臺(tái)放入二氧化碳培養(yǎng)箱開(kāi)始檢測(cè)。細(xì)胞生長(zhǎng)18~24小時(shí)后， 將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中2小時(shí)后加入被測(cè)試樣品。
2. 中成藥提取
取不同產(chǎn)家六味地黃丸(仲景牌六味地黃丸、清大牌六味地黃丸、同仁堂 牌六味地黃丸)烘干，打粉，分別稱(chēng)取中國(guó)藥典中藥材人用量的千分之15的量。 加lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，3500轉(zhuǎn)/分離 心15分鐘，取上清液備用。
3. 微量中成藥提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中藥材提取液10uL，加入96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使 用巿售儀器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息。見(jiàn)圖67~70,所獲信息提示同一處方的中 藥復(fù)方不同生產(chǎn)廠家的制品，也存在明顯差異。
實(shí)例十二冬蟲(chóng)夏草A549細(xì)胞株動(dòng)態(tài)信息的數(shù)字和條碼獲得
1. 取96孔檢測(cè)板，在每孔中加入50ulA549細(xì)胞株培養(yǎng)基，檢測(cè)基線，接 入A549細(xì)胞，使每孔細(xì)胞濃度為1000 ~ 10000個(gè)/100ul，置于測(cè)試臺(tái)放入二氧 化碳培養(yǎng)箱開(kāi)始檢測(cè)。細(xì)胞生長(zhǎng)18~24小時(shí)后，將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中2 小時(shí)后加入被測(cè)試樣品。
2. 中藥材提取
取不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草(青海果洛州、西藏那曲地區(qū)各縣5處、青海海南州 同德縣、青海海南州、青海海南州祈連縣、青海玉樹(shù)地區(qū)各縣3處、云南玉龍)
烘干，打粉，分別稱(chēng)取O. 09g。力口lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸 水加熱20分鐘，3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液備用。
3.微量中藥材提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取冬蟲(chóng)夏草提取液10uL，加入96孔板除對(duì)照組外的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。使用巿售 儀器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息(見(jiàn)圖71)。冬蟲(chóng)夏草A549細(xì)胞株細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息用 以下預(yù)先設(shè)定的公式和條件(編制成軟件)轉(zhuǎn)換成中藥材象征標(biāo)記的數(shù)字或條 碼。
1. 選取橫坐標(biāo)的8 10個(gè)時(shí)間區(qū)間(8~10個(gè)數(shù)位)的細(xì)胞學(xué)信息，用0~ 9數(shù)字和A Z或相應(yīng)的條碼表示。
2, 以無(wú)中藥材為對(duì)照的細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息為參照點(diǎn)。
經(jīng)統(tǒng)計(jì)方法處理，道地藥材冬蟲(chóng)夏草的A549細(xì)胞株動(dòng)態(tài)信息用數(shù)字 CHC765467和條碼(見(jiàn)圖72 )表示。
權(quán)利要求
1、一種基于細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息集成鑒別道地中藥材的方法是指利用高通量技術(shù)手段獲取的一種或多種細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息集成鑒別各種道地中藥材。
2、 權(quán)利要求1所指的高通量技術(shù)手段是以現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)為基礎(chǔ)建立的快速、微量、體外篩選模型和測(cè)試方法，并結(jié)合自動(dòng)化技術(shù)發(fā)展起 來(lái)的已商品化的巿售技術(shù)平臺(tái)或儀器。
3、 權(quán)利要求l所指的一種或多種細(xì)胞是分離自人體或動(dòng)植物或微生物的各 種組織和器官的細(xì)胞，包括原代培養(yǎng)細(xì)胞，也可以是巿售的永生化細(xì)胞和基因 改造過(guò)的細(xì)胞。
4、 權(quán)利要求1所指的細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息集成是指可以被各種巿售高通量檢 測(cè)儀器捕獲的各種細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)信息，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附、 細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、細(xì)胞變異、細(xì)胞存活、細(xì)胞毒性、細(xì)胞形態(tài) 等細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。
5、 權(quán)利要求1所指的細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息集成是指經(jīng)由各種巿售高通量檢測(cè)儀 器捕獲的單一或各種細(xì)胞學(xué)所組合構(gòu)成的數(shù)值。
6、 權(quán)利要求1所指的鑒別道地中藥材是指用細(xì)胞學(xué)不同的動(dòng)態(tài)信息集成用符。
7、 權(quán)利要求l所指的道地中藥材，是指古代近代(1949年前)和現(xiàn)代中醫(yī) 藥書(shū)籍記載的中國(guó)單味中藥材的物種和生長(zhǎng)地，或它們的復(fù)方制品，可以是它 們的替代物。
8、 權(quán)利要求2所指的高通量是指一次(批)實(shí)驗(yàn)量可以是16個(gè)或16個(gè)以 上的樣品。
9、 權(quán)利要求2所指的快速、微量是指在120小時(shí)內(nèi)， 一次細(xì)胞學(xué)測(cè)試所用 的樣品在100亳克以?xún)?nèi)。
10、權(quán)利要求5所指的細(xì)胞學(xué)所組合構(gòu)成的數(shù)值是指單獨(dú)或組合構(gòu)成一系 列生物功能標(biāo)記符(functional signature ),可以經(jīng)各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法轉(zhuǎn) 換成數(shù)學(xué)矩陣表示，也可以轉(zhuǎn)換成3個(gè)以上數(shù)字或字母構(gòu)成的條碼表示，賦予 一種或一類(lèi)中草藥及其代謝產(chǎn)物或其復(fù)方制品的特有信息，作為它們的各種生 物功能或藥效的象征標(biāo)記或識(shí)別標(biāo)志。
11、 權(quán)利要求6所指的區(qū)別道地中藥材的同種物種不同產(chǎn)地及不同物種不同 產(chǎn)地的生物功能標(biāo)記符可作為一種或一類(lèi)中藥材及其代謝產(chǎn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別 項(xiàng)目。
12、 權(quán)利要求7所指的各種道地中藥材和飲片是指野生或飼養(yǎng)的動(dòng)物，野生 或栽培的植物，野生或培養(yǎng)的真菌和微生物，以及它們的代謝產(chǎn)物，也可以指 它們的單味的藥材和飲片或多味的復(fù)方制品，包括它們組成的中成藥。
13、 權(quán)利要求7所指的各種道地中藥材是指使用一種或多種不同溶媒的提取物和不同含量能改變或不改變一種或多種細(xì)胞信息的物質(zhì)。
14、 權(quán)利要求10所指的經(jīng)各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)矩陣表示，是指 經(jīng)捕獲的各種細(xì)胞和各種中草藥的集成信息，將空白對(duì)照組的加樣前細(xì)胞信息 集成數(shù)值設(shè)為1.0，再按取3個(gè)以上的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的對(duì)照組數(shù)值(C。)和 加樣后的數(shù)值(CJ，計(jì)算A《i/C。，A值取兩個(gè)有效數(shù)字，小于1.0的，用小數(shù) 點(diǎn)后第一位數(shù)字表示，A值等于l.O，用字母A, A值等于l.l的，用B表示，A 值等于1.2的，用C表示，依此類(lèi)推用D， E， F， G……表示。
15、 權(quán)利要求10所指的使用一種或多種細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息的象征標(biāo)記用于指 導(dǎo)中國(guó)道地藥材、中藥材和天然藥物的選種、選地、栽培或養(yǎng)殖或培養(yǎng)(克隆)、 采集或終止培養(yǎng)、加工的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制指標(biāo)。
16、 權(quán)利要求IO所指的一種或多種具有細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息的象征標(biāo)記可以作 為指標(biāo)或模型分離中藥的有效組分和有效成分。
全文摘要
一種基于現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)而建立的快速、微量、體外篩選模型的高通量技術(shù)方法，使用一種或多種分離自人體或動(dòng)植物或微生物的各種組織和器官細(xì)胞，被市售檢測(cè)儀器捕獲的各種細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)信息，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)矩陣或數(shù)字或字母構(gòu)成的條碼表示，作為一種或一類(lèi)中草藥及其代謝產(chǎn)物或其復(fù)方制品的各種生物功能或藥效的象征標(biāo)記或識(shí)別標(biāo)志；用于鑒別道地中藥材及其所組方的中成藥，區(qū)別同種物種不同產(chǎn)地、不同物種不同產(chǎn)地的中藥材；用于指導(dǎo)中藥材選種、選地、栽培或養(yǎng)殖或培養(yǎng)(克隆)、采集、加工的控制指標(biāo)；作為一種或一類(lèi)中藥及其代謝產(chǎn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別項(xiàng)目；作為分離中藥或中成藥的有效組分或有效成分的指標(biāo)或模型。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101182567SQ200710156900
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者傅惠英, 壽旗揚(yáng), 楊國(guó)良, 柯傳奎, 柯越海 申請(qǐng)人:柯傳奎