專利名稱：中藥白術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于鑒定中藥白術(shù)的引物 及其鑒定方法。 技術(shù)背景白術(shù)"z^acz^ZoflfesfflacrocepAa^aKoidz)是著名中藥材"浙八味"之一， 有補(bǔ)脾益氣，燥濕利水，固表止汗等功效，是目前中草藥市場上使用較多的一種(8-川)隨著中藥現(xiàn)代化步伐的加快，中藥的標(biāo)準(zhǔn)化已成為中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和打入國 際市場的瓶頸。藥用植物的發(fā)展離不開標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，即目前大力推行的GAP(Good agriculturing Practice,中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)工作的核心。而物種的 鑒定方法是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制和管理的前提。隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和現(xiàn)代 化學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展，使藥材的科學(xué)鑒定成為可能7)。然而，利用形態(tài)及理化方法對藥材進(jìn)行鑒定需要豐富的經(jīng)驗，且結(jié)果不夠 可靠，尤其是破碎或粉末狀態(tài)的藥材則更難鑒別，而基于植物DNA序列的分子 遺傳標(biāo)記技術(shù)適合于物種的鑒別，因此可以建立一種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對白術(shù) 進(jìn)行鑒定。目前，分子遺傳標(biāo)記在動植物品種鑒定方面已得到廣泛應(yīng)用。在藥材鑒定 方面，已建立了鑒別性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，并已成功地用于龜甲、鹿類 等中藥的鑒別。但這種方法不是對所有的中藥都有統(tǒng)一的方法和引物，對不同 的中藥材，其鑒定方法、引物都有不同。 參考文獻(xiàn)1) Cao H. ， Liu Y.P. ， 1998. Applications of molecular markers in the detection of herbal medicine. Chin. Pharm. J. 33(5): 269-273.2) Fu， R. Z. et al. ， 2000. RAPD differentiation of five medicinal Dysosma species. Chin. Pharm. J. 9(2), 57-60.3) Braurmer et al 1992 rDNA and RAPD variation in the rare plant family Lactoridaceae. Amer丄Bot. 79:1436-1439.4) Elizabeth et al., 2003 2003. Development of species-specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci. 43:345 - 349.5) Bandana, D. ， Mahipal.， S. ， 2003. Molecular detection of cashew husk (Anacardium occidentale) adulteration in market samples of dry tea (Camellia sinensis). Planta Med. 69:882-884.6) Elizabeth, A. S. ， Michael, D. C. ， Geunhwa， J". ， 2003. Development of species—specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci. 43:345 - 349.7) Hosokawa， Keizo et al.， 2004. The Sequences of the Spacer Region between the atpF and atpA Genes in the Plastid Genome Allows Discrimination among Three Varieties of Medicinal Angelica, Planta Med S)劉國聲.1980，白術(shù)根莖揮發(fā)油的化學(xué)成分.植物學(xué)報，22 (4): 2959) 陳仲良.1989，中藥白術(shù)的化學(xué)成分II.白術(shù)三醇的a-甲基丁酰衍生物.化 學(xué)學(xué)報，47: 102210) 李金蘭等.1996,白術(shù)本草研究.藥學(xué)實踐雜志，14(4) :220.11) 林強(qiáng)等.1997，白術(shù)揮發(fā)油成分的分析.華西藥學(xué)雜志，12 (2): 119 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供--種對白術(shù)藥材能準(zhǔn)確鑒別其真?zhèn)蔚闹兴幇仔g(shù)鑒別性 聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及其鑒定方法。用于鑒定中藥白術(shù)的引物鑒定引物DNA序列為引物ccl: 5'-accaaattccattctccc -3，；弓|物cc2: 5， - tatgtccataatacacaa -3，， 用全 自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色 粉末結(jié)晶。中藥白術(shù)的鑒定方法包括如下步驟-1) 藥材DNA提取采用改良CTAB法提取藥材DNA;2) 鑒別性PCR:將鑒定引物的白色粉末結(jié)晶用無離子水溶解并稀釋至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格將各反應(yīng)物品加入PCR反應(yīng)管中，得到反應(yīng)混合液；組 分 終濃度10 X Buffer (Mg2+free) 2.5ulMgCl2 2.0 2.5uldNTPs 0.5ul引物ccl、引物cc2各 l.OulTaq酶(5U / nl ) 0.25ul共試品DNA模板(20 ng / pi) 2.0 2.5ul雙蒸水 加至25ul3) PCR循環(huán)將反應(yīng)混合液放入PCR儀中，按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng) 步驟一在94。C下反應(yīng)4到5分鐘，步驟二在94。C下反應(yīng)30至45秒，步驟三在61.5。C下反應(yīng)30至45秒，步驟四在72。C下反應(yīng)1至1.5分鐘， 重復(fù)步驟二至步驟四三十至四十次，步驟五在72。C下反應(yīng)7至IO分鐘。4) 電泳觀察取出PCR反應(yīng)液5ul，加入加樣緩沖液lul，用含有0.5%溴化乙錠的1.5%瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果，若有陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為白術(shù)。所述的改良CTAB法提取藥材DNA的步驟為1) 取約0.05 0. l克的硅膠干燥葉片，置入磨樣管中，用磨樣機(jī)研磨，磨 樣速度為4.0 5.0 rpm，磨樣時間為20 40s，然后在磨樣管中迅速加入65°C 預(yù)熱的含2%3 -巰基乙醇的2XCTAB提取緩沖液800 1000ul，搖均勻后轉(zhuǎn)入 5ml離心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨樣管，轉(zhuǎn)入同一個5ml管中， 65。C水浴30 35分鐘；2) 冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積 比為24: 1，緩慢顛倒15 30分鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為 8000 10000rpm;3) 離心后，吸取上層水相，加入1A0體積的IOXCTAB，輕輕混勻，再加 入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，緩慢顛倒15 30分鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為8000 10000rpm;4) 離心后吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積-20 "C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，于-2(TC放置2 12小時；5) 離心10 15min，離心速度為10000 12000rpm，棄水相；6) 加75%乙醇浸洗2 3次，用無水乙醇清洗1 2次，去乙醇，風(fēng)干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明解決了中藥白術(shù)的鑒定問題。我們在對白術(shù)的鑒別中，設(shè)計了鑒別 白術(shù)的一對高特異性引物，該鑒定引物在給定的PCR條件下，能將白術(shù)鑒定出 來。當(dāng)供試樣品用本鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察有無擴(kuò) 增條帶的出現(xiàn)，即可鑒定白術(shù)。用此對引物可以制造用于白術(shù)鑒別的反應(yīng)試劑 盒。本發(fā)明對于中藥生產(chǎn)、銷售部門快速、準(zhǔn)確地鑒定白術(shù)，搞好藥材的質(zhì)量 控制，是十分必要的，對各地市藥檢部門打擊假冒偽劣，凈化藥材市場具有十 分重要的價值。


附圖是采用引物ccl和引物cc2進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測的電泳圖(如圖所示， 白術(shù)在分子量為700bp位置有清晰條帶出現(xiàn)，而蒼術(shù)在分子量為700bp位置沒 有條帶出現(xiàn))；圖中K:空白對照，M:分子量。
具體實施方式
首先從白術(shù)及其近緣種、混淆種的原植物中提取總DNA，用PCR方法擴(kuò)增多 個基因片段并分別純化，對各純化片段進(jìn)行DNA序列分析，建立白術(shù)及其近緣 種、混淆種的DNA序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，選擇合適的D皿片段， 針對白術(shù)特有的片段，設(shè)計一對用于鑒定中藥白術(shù)的引物鑒定引物DNA序列 為弓i物 ccl : 5， - accaaattccattctccc -3，； 弓|物 cc2 : 5，-tatgtccataatacacaa -3，，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn) 行合成，即得到鑒定引物的白色粉末結(jié)晶。采用上述引物對中藥白術(shù)進(jìn)行鑒別，鑒定方法包括如下步驟1) 藥材DNA提取采用改良CTAB法提取藥材DNA;2) 鑒別性PCR:將鑒定引物的白色粉末結(jié)晶用無離子水溶解并稀釋至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格將各反應(yīng)物品加入PCR得到反應(yīng)混合液；組分終濃度10XBuffer (Mg2+free)2.5ulMgCl22.0 2. 5uldNTPs0.5ul引物ccl、引物cc2各l.OulTaq酶(5U/nl)0.25ul供試品DNA模板(20 ng / nl)2.0 2.5ul雙蒸水加至25ul3) PCR循環(huán)將反應(yīng)混合液放入PCR儀中，按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng) 步驟一在94。C下反應(yīng)4到5分鐘，步驟二在94。C下反應(yīng)30至45秒，步驟三在61.5。C下反應(yīng)30至45秒，步驟四在72。C下反應(yīng)1至1.5分鐘， 重復(fù)步驟二至步驟四三十至四十次，步驟五在72。C下反應(yīng)7至10分鐘。4) 電泳觀察取出PCR反應(yīng)液5ul，加入加樣緩沖液lul，用含有0.5%溴化 乙錠的1.5%瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果，若有陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)； 若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為白術(shù)。所述的改良CTAB法提取藥材DNA的步驟為1)取約0.05 0. 1克的硅膠干燥葉片，置入磨樣管中，用型號為BI0101 的磨樣機(jī)研磨，磨樣速度為4. 0 5. 0 rpm,磨樣時間為20 40s，然后在磨樣管中迅速加入65。C預(yù)熱的含2% P -巰基乙醇的2XCTAB提取緩沖液800 1000ul， 搖均勻后轉(zhuǎn)入5ml離心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨樣管，轉(zhuǎn)入同 一個5ml管中，65。C水浴30 35分鐘；2) 冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積 比為24: 1，緩慢顛倒15 30分鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為 8000 10000rpm;3) 離心后，吸取上層水相，加入1/10體積的IOXCTAB，輕輕混勻，再加 入加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，緩慢顛 倒15 30分鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為8000 10000rpm;4) 離心后吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積-20 。C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，于-2(TC放置2 12小時；5) 離心10 15min，離心速度為10000 12000rpm，棄水相；6) 力B 75%乙醇浸洗2 3次，用無水乙醇清洗1 2次，去乙醇，風(fēng)干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存?zhèn)溆?。實施?1) 藥材DNA提取采用改良CTAB法提取藥材DNA。(1) 取約0.05克的硅膠干燥葉片，置入磨樣管中，用型號為BI0101的磨 樣機(jī)研磨，磨樣速度為4.0rpm，磨樣時間為20s，然后在磨樣管中迅速加入65 "C預(yù)熱的含2%P -巰基乙醇的2XCTAB提取緩沖液800ul，搖均勻后轉(zhuǎn)入5ml離 心管中，再用800ul 2XCTAB清洗磨樣管，轉(zhuǎn)入同一個5ml管中，65。C水浴30 分鐘；(2) 冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體 積比為24: 1，緩慢顛倒15分鐘，混合均勻，離心10分鐘，離心速度為8000rpm;(3) 離心后，吸取上層水相，加入1/10體積的IOXCTAB，輕輕混勻，再 加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，緩慢顛倒 15分鐘，混合均勻，離心10分鐘，離心速度為8000rpm;(4) 離心后吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積 -2(TC預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，于-2(TC放置2小時；(5) 離心10min，離心速度為10000rpm，棄水相；(6) 加75%乙醇浸洗2次，用無水乙醇清洗1次，去乙醇，風(fēng)干，用100 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存?zhèn)溆谩?) 鑒別性PCR:將鑒定引物的白色粉末結(jié)晶用無離子水溶解并稀釋至5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，然后在PCR反應(yīng)管中依次加入雙蒸水 15.25ul、 10XBuffer (Mg2+ free) 2. 5ul、 MgC12 2. 0ul、 dNTPs 0. 5ul、引物 ccl和引物cc2各1. 0ul、供試品DNA模板(20 ng / W ) 2. 5ul和Taq酶(5U / i4 ) 0. 25ul (所用的10XBuffer (Mg2+free)、 MgC12、 dNTPs0. 5ul、和Taq 酶(5U / W )均購買自匕海申能博彩生物科技有限公司)，得到反應(yīng)混合液。3) PCR循環(huán)將反應(yīng)混合液放入PCR儀中，94。C預(yù)變性4min，然后按下 列參數(shù)進(jìn)入30個循環(huán)94。C變性30sec， 61. 5°C復(fù)性30sec， 72。C延伸lmin。 循環(huán)結(jié)束后在72°C保持7min。4) 電泳觀察取出PCR反應(yīng)液5ul，加入加樣緩沖液lul，用含有0.5%溴化 乙錠的1.5%瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果，若有陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)； 若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為白術(shù)。實施例21) 藥材DNA提取采用改良CTAB法提取藥材DNA。(1) 取約0. 1克的硅膠干燥葉片，置入BIO101磨樣管中，用型號為BI0101 的磨樣機(jī)研磨，磨樣速度為5.0 rpm，磨樣時間為40s，然后在磨樣管中迅速加 入65。C預(yù)熱的含2%0 -巰基乙醇的2XCTAB提取緩沖液1000ul，搖均勻后轉(zhuǎn)入 5ml離心管中，再用1000ul 2XCTAB清洗磨樣管，轉(zhuǎn)入同一個5ml管中，65°C 水浴35分鐘；(2) 冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體 積比為24: 1，緩慢顛倒30分鐘，混合均勻，離心15分鐘，離心速度為10000rpm;(3) 離心后，吸取上層水相，加入1/10體積的IOXCTAB，輕輕混勻，再 加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，緩慢顛倒 15 30分鐘，混合均勻，離心15分鐘，離心速度為10000rpm;(4) 離心后吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積 -2(TC預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，于-2(TC放置12小時；(5) 離心15min，離心速度為12000rpm，棄水相；(6) 加75%乙醇浸洗3次，用無水乙醇清洗2次，去乙醇，風(fēng)干，用200ul 0. 1X TE溶解DNA沉淀，-20 °C保存?zhèn)溆谩?) 鑒別性PCR:將鑒定引物的白色粉末結(jié)晶用無離子水溶解并稀釋至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，然后在PCR反應(yīng)管中依次加入雙蒸水 15.25ul、 10XBuffer (Mg2+ free) 2. 5ul、 MgC12 2. 5ul、 dNTPs 0. 5ul、引物 ccl和引物cc2各1. Oul、供試品DNA模板(20 ng / W ) 2. Oul和Taq酶(5U/ 14 ) 0. 25ul (所用的lOXBuffer (Mg2+ free)、 MgC12、 dNTPsO. 5ul、和Taq 酶(5U / W )均購買自上海申能博彩生物科技有限公司)，得到反應(yīng)混合液。3) PCR循環(huán)將反應(yīng)混合液放入PCR儀中，94。C預(yù)變性5min，然后按下 列參數(shù)進(jìn)入40個循環(huán)94。C變性45sec， 61. 5。C復(fù)性45sec， 72。C延伸1. 5min。 循環(huán)結(jié)束后在72°C保持10min。4) 電泳觀察取出PCR反應(yīng)液5ul，加入加樣緩沖液lul，用含有0. 5%溴化 乙錠的1.5%瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果，若有陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)； 若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為白術(shù)。
權(quán)利要求
1一種中藥白術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為引物cc15’-accaaattccattctccc-3’；引物cc25’-tatgtccataatacacaa-3’，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色粉末結(jié)晶。
2 —種使用如權(quán)利要求1所述引物的中藥白術(shù)的鑒定方法，其特征在于包括 如下步驟-1) 藥材DNA提取采用改良CTAB法提取藥材DNA;2) 鑒別性PCR:將鑒定引物的白色粉末結(jié)晶用無離子水溶解并稀釋至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格將各反應(yīng)物品加入PCR反應(yīng)管中，得到反應(yīng)混合液；組 分 終濃度10XBuffer (Mg2+free) 2.5ulMgCl2 2.0 2. 5uldNTPs 0.5ul引物ccl、引物cc2各 l.OulTaq酶(5U / pi) 0.25ul供試品DNA模板(20 ng / nl) 2.0 2.5ul雙蒸水 加至25ul3) PCR循環(huán)將反應(yīng)混合液放入PCR儀中，按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng) 步驟一在94。C下反應(yīng)4到5分鐘，步驟二在94。C下反應(yīng)30至45秒，步驟三在61.5。C下反應(yīng)30至45秒，步驟四在72。C下反應(yīng)1至1.5分鐘， 重復(fù)步驟二至步驟四三十至四十次，步驟五在72。C下反應(yīng)7至10分鐘；4) 電泳觀察取出PCR反應(yīng)液5ul，加入加樣緩沖液lul，用含有0. 5%溴化乙錠的1.5%瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果，若有陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為白術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種中藥白術(shù)的鑒定方法，其特征在于所述的改 良CTAB法提取藥材DNA的步驟為1)取約0.05 0. l克的硅膠干燥葉片，置入磨樣管中，用磨樣機(jī)研磨，磨 樣速度為4.0 5.0 rpm,磨樣時間為20 40s,然后在磨樣管中迅速加入65°C預(yù)熱的含2%P -巰基乙醇的2XCTAB提取緩沖液800 1000ul，搖均勻后轉(zhuǎn)入 5ml離心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨樣管，轉(zhuǎn)入同一個5ml管中， 65。C水浴30 35分鐘； 2) 冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積 比為24: 1，緩慢顛倒15 30分鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為 8000 10000rpm; 3) 離心后吸取上層水相，加入1/10體積的IOXCTAB，輕輕混勻，再加入 等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24: 1，緩慢顛倒15 30分 鐘，混合均勻，離心10 15分鐘，離心速度為8000 10000rpm; 4) 離心后吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積-20 "C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，于-2(TC放置2 12小時； 5) 離心10 15min，離心速度為10000 12000rpm，棄水相； 6) 加75%乙醇浸洗2 3次，用無水乙醇清洗1 2次，去乙醇，風(fēng)干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 "保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于鑒定中藥白術(shù)的引物及其鑒定方法。本發(fā)明設(shè)計的白術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物DNA序列為引物cc15’-accaaattccattctccc-3’；引物cc25’-tatgtccataatacacaa-3’。鑒定方法為提取藥材的總DNA；用本發(fā)明的一對鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，若用鑒定引物得到陽性擴(kuò)增，則供試品為白術(shù)，若無陽性擴(kuò)增則供試品不為白術(shù)。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)白術(shù)的快速、準(zhǔn)確地鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK101230389SQ20071016447
公開日2008年7月30日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者傅承新, 劉逸慧, 周曉龍, 攀 李, 川 陳, 陳斌龍 申請人:浙江大學(xué)