專利名稱：：肌病的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于確定他汀類(statin)所誘導(dǎo)肌病的診斷方法。該方法尤其適用于確定警告、早期征兆以及癥狀性肌病。該方法包括收集脂質(zhì)生物學(xué)標(biāo)志物鐠并將其與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較。該方法還包括所述生物標(biāo)志物鐠的化學(xué)計量建模和統(tǒng)計分析。本發(fā)明還涉及用于實施確定他汀類所誘導(dǎo)肌病之診斷方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
：高水平的血液膽固醇是導(dǎo)致動脈粥樣硬化和心血管疾病的主要風(fēng)險因素之一。臨床上可以用3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶抑制劑(合稱他汀類)使升高的膽固醇水平降低。他汀類已在大量的臨床試驗中顯示出有效降低膽固醇血液水平。當(dāng)前有大量不同的他汀類存在。高膽固醇值在歐洲和美國非常常見，使用他汀類來降低膽固醇值正顯著增加。在歐盟成員國中，他汀類的使用從1997年至2002年平均增長了30%。最近的臨床數(shù)據(jù)顯示，他汀類治療具有副作用。與他汀類有關(guān)的最主要且最重要的副作用是肌病。肌病是多種肌肉相關(guān)問題的總稱，所述肌肉相關(guān)問題例如肌肉疼痛(肌痛)、衰弱和痙攣(PaulD.Thompson等，AmJCardiol2006,97(增刊)69C-76C)。他汀類誘導(dǎo)肌病的確切機制尚不清楚。最近的研究顯示，臨床可接受劑量的阿托伐他汀和辛伐他汀導(dǎo)致血漿泛醌的水平降低。泛醌是參與線粒體電子傳遞并因此參與組織能量代謝的輔酶。他汀類(如阿托伐他汀和辛伐他汀)對骨骼肌明顯具有影響(PSlva等，ClinPharmacolTher2005:78:60-8)。代謝組學(xué)是致力于系統(tǒng)研究細(xì)胞、組織和體液(biofluid)中小分子(即代謝物)的學(xué)科。代謝物是細(xì)胞調(diào)節(jié)過程的終產(chǎn)物，其水平可被視為生物系統(tǒng)針對遺傳或環(huán)境變化的放大反應(yīng)。幾十年來，臨床醫(yī)生已依賴了代謝組學(xué)中包含的小部分信息，例如測量葡萄糖以監(jiān)測糖尿病以及測量膽固醇以監(jiān)測心血管健康。已開發(fā)新的精密的代謝組學(xué)分析平臺和3信息工具以提供廣泛和靈敏的代謝組測量。已知脂質(zhì)作為結(jié)構(gòu)組分(例如細(xì)胞膜)、能量儲存組分以及作為信號分子起到重要作用。脂質(zhì)被廣義定義為疏水或兩親性小分子，其全部或部分來源于基于碳負(fù)離子的硫酯縮合和/或基于碳正離子的異戊二烯單元縮合。脂質(zhì)組學(xué)可被看作是代謝組學(xué)的子領(lǐng)域，其目的是通過在分子水平上測量和表征廣泛的脂質(zhì)譜(脂質(zhì)組學(xué)語)來闡明與脂質(zhì)有關(guān)的生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的臨床脂質(zhì)測量對三酰甘油、膽固醇和脂蛋白的總量進行定量。然而，血清脂質(zhì)譜在分子水平上更加復(fù)雜。目前的脂質(zhì)組學(xué)平臺可以對多個脂質(zhì)類別的IOO余種不同脂質(zhì)分子進行定量表征，如鞘磷脂、磷脂、固醇酯、酰基甘油、固醇、膽汁酸、脂肪酸、類二十烷酸和類固醇?，F(xiàn)今,肌病主要根據(jù)患者的癥狀進行診斷。升高的肌酸激酶(creatinekinase,CK)可用于檢測具有肌肉癥狀的患者。然而，CK水平可由于其它原因(如運動)而升高，并且其不是他汀類所誘導(dǎo)肌病的可靠生物學(xué)標(biāo)志物。當(dāng)下，尚沒有診斷非癥狀性肌病的診斷方法或臨床檢測。并且，在接受他汀類治療時無法估計患者發(fā)生肌病的風(fēng)險。本發(fā)明公開了用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的風(fēng)險和早期征兆的方法。發(fā)明概述本發(fā)明公開了用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的方法，其包括以下步驟a)提供來自他汀類治療前或治療期間之個體的生物樣品；b)從所述生物樣品收集脂質(zhì)組學(xué)鐠；c)對所收集的脂質(zhì)組學(xué)鐠與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較，其中已通過將促炎性基因表達鐠與高劑量他汀類治療相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)鐠相結(jié)合建立了所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。該方法尤其適用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的風(fēng)險或早期預(yù)兆。該方法還可用于在表現(xiàn)出肌病臨床癥狀的個體中確定他汀類所誘導(dǎo)肌病。本發(fā)明的另一方面是提供用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的試劑盒。乘判別分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis,PLS/DA)。來自安慰劑(N=11)、阿托伐他汀(N=14)(A)和辛伐他汀(N=12)(B)組治療8周后的結(jié)果，其中分析中包含132種已鑒定脂質(zhì)作為變量。對于每種分子和每位受試者來說，其8周治療期后的水平通過減去治療前所有受試者的中值水平并除以相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差來計算。在模型中使用4種潛變量(Q2=0.46)。標(biāo)簽為患者ID編號。不同組的輪廓線用于指引。潛變量(LV)1和3的分?jǐn)?shù)表明特異性針對他汀類治療(LV1)的血清脂質(zhì)變化以及他汀類特異性變化(LV3)。圖2表示針對從圖1中通過變量投影重要性(variableimportanceintheprojection,VIP)分析所選擇的辛伐他汀(B)或阿托伐他汀(A)組中最重要脂質(zhì)的LV3載荷(loading)-只顯示了兩組中至少之一的VIP值大于2的脂質(zhì)。圖3表示針對組合的肌肉基因表達和血清脂質(zhì)數(shù)據(jù)進行的PLS/DA分析。來自安慰劑(N=5)、阿托伐他汀(N=6)(A)和辛伐他汀(N=6)(B)組的受試者接受介入后的結(jié)果。分析中包括來自4條富集途徑的總共38種基因和132種脂質(zhì)作為變量。在多變量分析前對數(shù)據(jù)進行自動換算。該模型中使用3個潛變量(Q2-0.50)。標(biāo)簽為患者ID編號。該PLS/DA分?jǐn)?shù)圖表明，介入之后在分子譜中觀察到所述治療之間的治療特異性差異。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供他汀類所誘導(dǎo)肌病的早期生物學(xué)標(biāo)志物。所述早期生物學(xué)標(biāo)志物可用于在實際肌病任何癥狀發(fā)生前確定由于用他汀類進行膽固醇降低治療而發(fā)生肌病的風(fēng)險。該生物標(biāo)志物還可用于他汀類所誘導(dǎo)肌病的早期征兆。當(dāng)檢測出肌病早期征兆時，可以對膽固醇降低藥物進行調(diào)整。另外，該生物標(biāo)志物可在肌病臨床癥狀已出現(xiàn)時用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病。本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物可用作他汀類所誘導(dǎo)肌病的生物標(biāo)志物。本發(fā)明提供了用于確定患者發(fā)生他汀類所誘導(dǎo)肌病的風(fēng)險和早期征兆的方法。該方法基于對所建立的個體脂質(zhì)i普與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較。通過將基因表達分析數(shù)據(jù)與血清脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合來建立所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。已通過肌肉活檢的全基因組微陣列分析檢測了與高劑量他汀類治療相關(guān)的基因表達譜。將來自微陣列分析和脂質(zhì)組學(xué)分析的信息進行結(jié)合并進行統(tǒng)計學(xué)修正以提供可用于他汀類所誘導(dǎo)肌病的脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。本發(fā)明公開了用于確定肌病的方法。該方法用于在任何臨床可觀察征兆發(fā)生前確定肌病的早期征兆。本方法的優(yōu)勢在于可以在任何身體肌病癥狀發(fā)生前對他汀類治療進行調(diào)整或停止。本發(fā)明的另一方面是提供用于在已患臨床肌病癥狀的個體中確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的方法。本發(fā)明的方法可用作針對已經(jīng)歷肌肉疼痛和其它肌病癥狀的患者中對肌病的生化診斷方法。該方法可用作其它肌病臨床診斷以外的驗證性診斷方法。在懷疑患有肌病的患者中通常測量肌酸激酶(CK)水平。該公開的方法可與CK水平測量平行使用。因為CK水平可由于例如運動和身體活動后小的肌肉損傷而升高，所以CK水平不是可靠的肌病生物標(biāo)志物。本發(fā)明提供了比CK水平更可靠的他汀類所誘導(dǎo)肌病的生物標(biāo)志物。本發(fā)明提供了用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的方法，其包括以下步驟a)提供來自他汀類治療前或治療期間個體的生物樣品；b)從所述生物樣品收集脂質(zhì)組學(xué)譜；c)對所收集的脂質(zhì)語與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較，其中已通過將促炎性基因表達鐠與高劑量他汀類治療相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)譜相結(jié)合而建立了所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。所收集的脂質(zhì)組學(xué)鐠與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物之間的差異指示著他汀類所誘導(dǎo)肌病或與之相關(guān)聯(lián)。所收集的脂質(zhì)組學(xué)鐠與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物之間的差異還可用于確定發(fā)生他汀類所誘導(dǎo)肌病的易感性或風(fēng)險。本發(fā)明的方法可用于確定發(fā)生由他汀類治療所致的他汀類所誘導(dǎo)肌病的風(fēng)險。另外，本發(fā)明的方法可用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的早期征兆。早期征兆可以在個體中出現(xiàn)肌病實際癥狀前確定。此外，本發(fā)明的方法可用于在已表現(xiàn)出肌病征兆的個體中確定他汀類所誘導(dǎo)肌病。本方法可以作為臨床診斷肌病的生化驗證。所述生物樣品可以是全血、血清、血漿樣品或組織樣品。從患者取血樣是常規(guī)臨床操作的一部分。取血樣可以與例如測量患者的膽固醇水平一起進行?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來制備所收集的血樣以及分離血清或血漿。可以使用各種化學(xué)的以及高分辨率的分析技術(shù)實施從所述生物樣品收集脂質(zhì)組學(xué)譜。合適的分析技術(shù)包括但不僅限于質(zhì)鐠和核共振鐠(nuclearresonancespectroscopy)。可以寸吏用4壬何能夠分辨單個月旨質(zhì)或脂質(zhì)類別并提供其結(jié)構(gòu)信息的高分辨率技術(shù)來收集生物樣品的脂質(zhì)鐠。本發(fā)明的一個實施方案是使用質(zhì)鐠(MS)收集脂質(zhì)組學(xué)譜。MS設(shè)備可以與高效分離方法(如HPLC或UPLC(超高效液相色鐠))聯(lián)用。用于收集脂質(zhì)鐠的分析技術(shù)應(yīng)能夠定量或測量單個脂質(zhì)或脂質(zhì)類別的確切量或至少相對量。當(dāng)將所收集脂質(zhì)鐠與參照脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物進行比較時，使用所收集脂質(zhì)組學(xué)鐠中的單個脂質(zhì)或脂質(zhì)類別的量。所述參照脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物可以建立自接受他汀類治療的同一個體，或者其可以來自一般人群。如果使用同一個體來創(chuàng)建參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物，則在他汀類治療前從該個體收集樣品。然后從該個體的該第一脂質(zhì)譜來創(chuàng)建參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。該脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物用作基線或起點?？梢栽谒☆愔委熎陂g收集一系列脂質(zhì)組學(xué)鐠。然后，將這些脂質(zhì)組學(xué)譜與在他汀類治療前創(chuàng)建的參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較。所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物還可創(chuàng)建自一般人群。如果使用一般人群，則將來自人群的若干脂質(zhì)譜相組合，然后從此組合創(chuàng)建脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。優(yōu)選地，所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物為選自表1、更優(yōu)選表2所示脂質(zhì)中的一種或多種脂質(zhì)。通過如下所述將基因表達數(shù)據(jù)與脂質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合創(chuàng)建所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。將單一脂質(zhì)或脂質(zhì)類別的水平或量與參照脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物中的單一脂質(zhì)或脂質(zhì)類別的水平或量進行比較，以確定他汀類所誘導(dǎo)肌病。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>為了了解肌肉中他汀類應(yīng)答相關(guān)的途徑，我們在肌肉活檢中進行了全基因組微陣列分析。該活檢樣品取自三組個體。所述組為僅接受安慰劑的個體、接受阿托伐他汀治療的個體以及接受辛伐他汀治療的個體。微陣列實驗在他汀類治療后未觀察到任何副作用(如肌肉疼痛或肌酸激酶升高)的個體中進行。表21GPCho(34:3)13SM(d18:D/16:0)2GPCho(36:0)14SM(dl8:0/18:0)3GPCho(36:3)15SM(d18:謂:0)4GPCho(38:2J16SM(d18:l/22:0)5GPCho(38:3)17GPEtn(38:1)SGPCho(38:4)18GPEtn(40:4)7GPCho(38:5)19CtoE(18:0)8GPCho(0-38:5)20ChoE(18:2)9GPCh。(38:6〉21TG(54:2)10GPCho(38:7)22TG(54:3)11GPGho(0-38:7)23TG(56:5)12GPCho(40:6)GPCho-磷脂酰膽堿SM=鞘磷脂GPEtn-磷脂酰乙醇胺ChoE=膽固醇酯TG=甘油三酯首先進行單基因分析以顯示肌肉中受他汀類治療影響的基因。在阿托伐他汀組中僅記錄到輕微的變化，因為觀察到5種基因的表達在介入治療期間顯著改變。在辛伐他汀組中，基因表達變化顯著。基于分層聚類分析(hierarchicalclusteranalysis),選擇20種基因用于進一步的RT-PCR對照，從而鑒定出他汀類對人骨骼肌影響的基于基因表達的指玟(fingerprint)。因為在單基因表達中所記錄的差異一般來說相當(dāng)有限，所以我們進行基因集合豐度分析(genesetenrichmentanalysis,GSEA)以闡明在單基因分析中可能未出現(xiàn)的受影響的代謝途徑。在GSEA中，與標(biāo)準(zhǔn)相比，在阿托伐他汀或安慰劑組中似乎沒有途徑受到顯著影響(FDR<0.25)。令人感興趣地，在辛伐他汀組中，143條途徑在高劑量辛伐他汀治療中上調(diào)(FDR<0.25)。由于有大量的受影響途徑，我們將我們的系統(tǒng)分析限制在最受影響的途徑(FDR<0.10)中。為了研究高劑量他汀類治療如何影響血漿脂質(zhì)譜以及骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的代謝變化是否反應(yīng)在血漿脂質(zhì)組中，我們應(yīng)用了脂質(zhì)組學(xué)分析。分析了安慰劑、辛伐他汀和阿托伐他汀組的介入之前和之后的受試者樣品。在數(shù)據(jù)處理后，鑒定了總共132種脂質(zhì)分子并對其進行數(shù)據(jù)分析。偏最小二乘判別分析(PLS/DA)表明脂質(zhì)鐠中存在藥物特異性變化(圖1)。與由所述兩種藥物通用的他汀類治療所致變化相關(guān)的第一潛變量(LV1)的差異預(yù)期與他汀類介入組中甘油三酯和膽固醇酯的降低有關(guān)。辛伐他汀和阿托伐他汀脂質(zhì)鐠之間的差異可見于第三潛變量(LV3)中。在變量投影重要性分析后，鑒定出每個介入組最重要的脂質(zhì)種類。圖2中顯示了在辛伐他汀和阿托伐他汀組中針對最重要脂質(zhì)在阿托伐他汀-辛伐他汀差異(LV3)方向上的載荷列表。明顯地，這兩種他汀類之間最主要的血漿脂質(zhì)譜差異似乎是脂質(zhì)類別特異性的，其中在辛伐他汀組中多種磷脂酰乙醇胺和長鏈甘油三酯上調(diào)，而醚磷脂酰膽堿和膽固醇酯的下調(diào)。基因表達分析顯示出在高劑量辛伐他汀介入組中骨骼肌中與炎癥和線粒體損傷有關(guān)的途徑上調(diào)。我們研究了任何這些變化是否與血清脂質(zhì)組中觀察到的差異有關(guān)。我們基于GSEA分析選擇了一部分基因。選擇了來自PLC、tubby、類二十烷酸生物合成以及sodd途徑的基因，其基于FDRq-值排在第2至第5位。包括總共38種基因表達鐠及132種脂質(zhì)。針對肌肉基因表達與血漿脂質(zhì)鐠數(shù)據(jù)組合的PLS/DA分析表明，三個治療組之間存在明顯差異(圖3)。所述載荷表明，治療后的辛伐他汀組主要與類二十烷酸合成途徑的多個基因的變化以及多種磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂分子種類的變化相關(guān)聯(lián)。由于偏最小二乘分析(partialleastsquaresanalysis)使所測變量的方差矩陣(例如基因表達與脂質(zhì)鐠數(shù)據(jù)的組合)乘積和所測數(shù)據(jù)與目的性質(zhì)的相關(guān)性最大化(例如治療組)，因此這些結(jié)果清楚地顯示在辛伐他汀組中上調(diào)基因(途徑)和脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物之間存在高度相關(guān)性。本發(fā)明的另一方面提供了用于實現(xiàn)確定他汀類所誘導(dǎo)肌病之方法的試劑盒。該試劑盒包含參照脂質(zhì)以形成脂質(zhì)組學(xué)參照生物標(biāo)志物和必要的試劑。ii來自脂質(zhì)組學(xué)分析的脂質(zhì)根據(jù)"脂質(zhì)代謝和途徑策略(LipidMaps)"(http:〃www.lipidmaps.org)來命名。例如，將含有16:0脂肪酸鏈的溶血磷脂酰膽堿命名為單酰甘油磷脂酰膽堿GPCho(16:0/0:0)。在脂肪酸組成未確定的情形中，對總的碳數(shù)和雙鍵數(shù)作標(biāo)記。例如，磷脂酰膽堿類GPCho(16:0/20:4)表示為GPCho(36:4)。然而，GPCho(36:4)可代表其它分子種類如GPCho(20:4/16:0)或GPCho(18:2/18:2)。這樣的同質(zhì)異構(gòu)體(massisomer)可通過層析進行分離。以下實施例對本發(fā)明進行舉例說明，但不意在限制本發(fā)明的范圍。實施例進行基因表達和脂質(zhì)組學(xué)分析的患者來自早前針對高劑量他汀類治療對骨骼肌代謝影響的研究(8)中37位受試者的血漿樣品用于血漿脂質(zhì)組分析。受試者的年齡在31~69歲之間，他們的平均血清總膽固醇濃度為5.9±0.9mmol/L,并且血清甘油三酯低于4.5mmol/L。選擇來自18位年齡匹配男性(用阿托伐他汀(n=6)、辛伐他汀(n=6)或安慰劑(n=6)進行治療)的肌肉樣本用于全基因組廣泛表達分析(wholegenomewideexpressionanalysis)。進行研究的患者以前從未接受過他汀類治療。他們被告知在研究期間遵循其日常飲食習(xí)慣。在初次篩選中排除掉患有家族性高膽固醇血癥的患者和血清總膽固醇〉7.0mmol/L的患者。另一些排除標(biāo)準(zhǔn)包括使用一并調(diào)節(jié)脂質(zhì)的藥物或抗氧化維生素、腎或肝功能不良以及使用已知影響阿托伐他汀或辛伐他汀代謝的藥物。該研究方案被坦佩雷大學(xué)醫(yī)院倫理委員會所接受，并獲得所有參與人的書面同意。實施例1.基因表達分析基因表達根據(jù)所給的說明書，使用Sentrix人-6表達微珠芯片分析對46,000種已知基因、候選基因和剪接變體(Illumina，SanDiego，CA，USA)進行微陣列實驗。使用Ultra-Turrax(IKATurraxT8/S8N-5G,IKA-Werke,Staufen，Germany)對活檢樣品進行勻漿。使用TRIzol(#15596-018，12InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)提取總RNA。才艮據(jù)所給的說明書，利用Qiagen試劑盒(#74106和#79254，QiagenGmbH,Hilden,Germany)進行DNA酶處理和第二次RNA純化。根據(jù)說明書，使用Ambion的IlluminaRNA擴增試劑盒(貨號11755,Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)將200ng等分試樣的來自每個樣品的總RNA擴增為cDNA。過夜(14h)進行從cDNA到cRNA的體外轉(zhuǎn)錄(IVT)反應(yīng)，其包含用于標(biāo)記cRNA產(chǎn)物的生物素-11-dUTP(PerkinElmer,貨號PC3435-0402-生物素國ll畫dUTP，>95%，NEL539001EA,PerkinElmerLifeAndAnalyticalSciences,Inc.,Boston,MA，USA)。在擴增之前和之后，用NanodropND-1000分光光度儀(NanodropTechnologies,Wilmington,DE，USA)檢測RNA/cRNA的濃度，并利用BioRad的Experion自動電泳系統(tǒng)和RNAStdSens分析試劑盒(BioRadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)來控制RNA/cRNA質(zhì)量。在用于BeadStation的Illumina全基因組基因表達步驟(文件#11176837Rev.F，IlluminaInc.)后，將1500ng的每種樣品cRNA與Illumina的Sentrix小鼠-6表達微珠芯片陣列(Illumina,Inc.,SanDiego,CA,USA)在55。C雜交過夜(18h)。用1嗎/ml的Cyanine3曙鏈霉抗生物素蛋白(AmershamBiosciences#146065)檢測經(jīng)雜交的生物素化cRNA。用Illumina微珠陣列讀數(shù)儀掃描微珠芯片。用InforsenseKnowledgeDiscoveryEnvironment(Inforsense，London,UK)4吏用非線性三次樣條歸一化對獲自Illumina平臺的原始強度數(shù)據(jù)進行歸一化。InforsenseKDE平臺還用于進行單基因分析包括倍數(shù)變化計算和過濾探針。根據(jù)所使用的選擇標(biāo)準(zhǔn)(1.5倍變化和p值<0.05)，在安慰劑組中一種基因的表達顯著變化。在阿托伐他汀組中僅觀察到輕微的變化，因為觀察到5種基因的表達在介入期間顯著改變。然而，在辛伐他汀組中，lll種基因的表達變化顯著。26種基因的表達下調(diào)，85種基因的表達上調(diào)。實施例2.RT-PCR分析基于分層聚類分析(如實施例1中所述)，選擇20種基因用于進一步的RT-PCR對照，從而鑒定出他汀類對人骨骼肌影響的基于基因表達的指紋。通過實時定量TaqManPCR驗證在辛伐他汀組中記錄的微陣列表達結(jié)果(n=5，其中一例沒有足夠的肌肉RNA用于PCR)。使用之前純化的cRNA作為cDNA合成的原料。將1000ng-18pl等分試樣的cRNA與1|nlPromega隨機引物(C1181,PromegaU.S.,Madison,WI，USA)混合并在+70。C孵育IO分鐘。加入以下試劑使總反應(yīng)體積為25pi:1jil的lOfiMdNTP混合物(F09892,AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)、1pi的PromegaM國MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U/pl(M3682)和4Hi的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄(RT)5x反應(yīng)緩沖液。最后，以如下順序進行孵育逆轉(zhuǎn)錄10分鐘，45。C50分鐘以及70。C10分鐘。使用10pl體積進行PCR反應(yīng)，其由2nl等分試樣的1:10稀釋的cDNA樣品和AbgeneABsolute2xQPCRROX混合物(AB-1139,Abgene，Epsom,UK)組成。引物濃度為300nM,通用探針文庫(Exiqon，Vedbaek,Denmark)的探針濃度為100nM，通常的長探針濃度為200nM。最后在rtPCR系統(tǒng)(ABIPrism7700序列檢測系統(tǒng)，ApliedBiosystems)中進行PCR反應(yīng)，其包括以下流程95。C15分鐘，40個循環(huán)的95。C15秒，以及60。C1分鐘。RT-PCR分析表明，在辛伐他汀組中似乎有5種基因是他汀類早期肌病前效應(yīng)的最靈敏候選標(biāo)志物，所述基因分別為ALOX5AP(+3.6倍，p=0.041)、CCL5(十11.9倍，p=0.011)、COL3A1(+27.1倍，p=0.026)、MYL5(+8.0倍，p=0.021)、MYBPH(+49.0倍，p=0.027)。實施例3.血漿的脂質(zhì)組學(xué)分析將包含ll個脂質(zhì)類別的一等分試樣內(nèi)標(biāo)混合物(10ml)和0.05M氯化鈉(10ml)加至血漿樣品(10ml),用氯仿/甲醇(2:1,100ml)提取脂質(zhì)。渦旋混勻(2分鐘)、靜置(l小時)和離心(10000RPM,3分鐘)后，分離出下層并將含有3種經(jīng)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)混合物(10ml)加至提取物(內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)均列于附錄中)。隨機確定進行LC/MS分析的樣品順序。14使用WatersQ-TofPremier質(zhì)譜儀聯(lián)合Acquity超高效液相色譜(LC)TM(UPLC)來分析脂質(zhì)提取物。柱保持在50°C,其是包含1.7mm顆豐立的AcquityUPLCTMBEHC1810x50mm。二元溶劑系統(tǒng)(binarysolventsystem)包括A.水(1%1MNH4Ac、0.1%HCOOH);B.LC/MS級(Rathburn)乙腈/異丙醇(5:2，1%1MNH4Ac、0.1%HCOOH)。梯度從65%A/35%B開始，在6分鐘內(nèi)到達100。/oB并再保持7分鐘。包括5分鐘重新平衡步驟的總運行時間為18分鐘。流速為0.200ml/分鐘，注入量為0.75ml。樣品組織器(sampleorganizer)的溫度;殳置為10'C。在WatersQ-TofPremier質(zhì)鐠儀上使用ESI+模式進行脂質(zhì)鐠測定。使用0.2秒的掃描持續(xù)時間收集質(zhì)量范圍為m/z300~1200的數(shù)據(jù)。原料溫度設(shè)為120。C，并于250。C使用氮氣作為脫溶劑氣體(desolvationgas)(800L/h)。取樣錐(samplingcone)和毛細(xì)管的電壓分別為39V和3.2kV。使用利血平(50mg/L)作為鎖噴霧(lockspray)參照化合物(5ml/分鐘；IO秒掃描頻率)。使用MZmine軟件(版本0.60)來處理數(shù)據(jù)(14)。使用內(nèi)部光譜文庫(internalspectrallibrary)來鑒定脂質(zhì)。4吏用如下的多個內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進行歸一化。使用l-十七?；?2-羥基-sn-甘油-3-磷酸膽堿對除去膽固醇酯以外的所有單酰基脂質(zhì)(如單酰甘油和溶血磷脂)進行歸一化，用1，2-雙十七酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿對除去磷脂酰乙醇胺和乙醇胺縮醛磷脂之外的所有二?；|(zhì)進行歸一化，用1，2-雙十七?；?811-甘油-3-磷酸乙醇胺對磷脂酰乙醇胺和乙醇胺縮醛磷脂進行歸一化，用十七烷酸甘油三酯對甘油三酯和膽固醇酯進行歸一化。使用串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定所選的脂質(zhì)分子種類。使用ESI+模式運行MS/MS，碰撞能斜坡(ramp)從15至30V，質(zhì)量范圍從m/z150起始。其它條件如上所示。在脂質(zhì)組學(xué)分析和數(shù)據(jù)處理后，鑒定了總共132種脂質(zhì)分子并對其進行數(shù)據(jù)分析。偏最小二乘判別分析(PLS/DA)(17)表明脂質(zhì)譜中存在藥物特異性變化(圖1)。與由所述兩種藥物通用的他汀類治療所致變化相關(guān)的沿第一潛變量(LV1)的差化預(yù)期與他汀類介入組中甘油三酯和膽固醇酯的降低有關(guān)(補充材料)。辛伐他汀和阿托伐他汀脂質(zhì)譜之間的差異可見于第三潛變量(LV3)中。在變量投影重要性(VIP)分析后，鑒定出每個介入組最重要的脂質(zhì)種類。圖2中顯示了在辛伐他汀和阿托伐他汀組中對最重要脂質(zhì)在阿托伐他汀-辛伐他汀差異(LV3)方向上的載荷列表。明顯地，這兩種他汀類之間最主要的血漿脂質(zhì)譜差異似乎^J旨質(zhì)類別特異性的，其中在辛伐他汀組中多種磷脂酰乙醇胺和長鏈甘油三酯上調(diào)，而膽堿縮,脂和膽固醇酯下調(diào)。權(quán)利要求1.一種用于確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的方法，其包括以下步驟a)提供來自他汀類治療前或治療期間個體的生物樣品；b)從所述生物樣品收集脂質(zhì)組學(xué)模式；c)將所收集的脂質(zhì)組學(xué)模式與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較，其中已通過將促炎性肌肉組織基因表達譜與高劑量他汀類治療相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)譜相結(jié)合建立了所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述方法用于確定所述個體發(fā)生他汀類所誘導(dǎo)肌病的風(fēng)險。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述方法用于確定所述個體中他汀類所誘導(dǎo)肌病的早期征兆。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述方法用于在表現(xiàn)出肌病癥狀的個體中確定他汀類所誘導(dǎo)肌病。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述促炎性基因表達譜是花生四烯酸5-脂加氧酶激活蛋白(ALOX5AP)基因(UniprotID:P20292)途徑。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物是選自表1所示脂質(zhì)中的一種或多種脂質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物是選自表2所示脂質(zhì)中的一種或多種脂質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中從收集自與(b)中收集脂質(zhì)組學(xué)鐠相同個體的脂質(zhì)組學(xué)鐠建立所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物，并且所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物在所述個體開始他汀類治療前建立。9.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中從收集自健康普通人群的脂質(zhì)組學(xué)i普建立所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ALOX5AP基因的表達還用作生物標(biāo)志物。11.用于進行權(quán)利要求l所述方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物和進行分析所用的必要試劑。全文摘要本發(fā)明提供了確定他汀類所誘導(dǎo)肌病的診斷方法。該方法尤其適用于確定前兆、早期征兆以及癥狀性肌病。該方法包括從生物樣品(如血液或血清)收集脂質(zhì)組學(xué)譜，并將所得到的脂質(zhì)組學(xué)譜與參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物進行比較。已通過將促炎性肌肉組織基因表達譜與高劑量他汀類治療相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)譜相結(jié)合建立了所述參照脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及用于實施確定他汀類所誘導(dǎo)肌病之方法的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101522910SQ200780021728公開日2009年9月2日申請日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日發(fā)明者漢努·派瓦,泰爾霍·萊赫蒂邁基,雷約·拉克索寧,馬泰·奧倫西克申請人:佐拉生物科學(xué)有限公司