專利名稱：一種快速檢測轉基因玉米品系Mon810的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及轉基因產品的檢測方法，更具 體說是一種快速檢測轉基因玉米品系Mon810的方法，通過肉眼觀察反應管 濁度或觀察加入1000 x SYBR Green后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判 斷擴增情況。
背景技術：
21世紀是生物科技的世紀，轉基因生物正飛速發(fā)展。目前，世界各國 已進行田間試驗的轉基因作物超過5000種，批準商品化的轉基因作物有 160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、 甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等。我國轉基因生物研 究始于20世紀80年代初期，主要是轉基因抗蟲棉。近年來，政府不斷加大 對生物技術研究的支持力度，積極促進農業(yè)生物技術的研究與產業(yè)化開 發(fā)。
目前全世界轉基因作物種植面積中轉基因玉米占31%,其中轉基因玉 米Mon810的面積最廣。Mon810型轉基因玉米由美國孟山都公司研發(fā)，在 自然生長過程中會產生一種名為B t的毒素，后者能夠殺死長期困擾農場 的害蟲玉米螟，從而使農戶省下噴灑農藥的成本開支。這種玉米的安全性 一直是科學家以及法國乃至歐洲民眾爭論的焦點。法國政府宣布要在2008 年暫停種植MON 810型轉基因玉米。原因是"嚴重懷疑"MON 810型 轉基因玉米的安全性，并聲稱"存在一些新的科學事實"，證明轉基因玉 米對"動植物存在不利影響"。
轉基因作物安全性主要集中在轉基因作物釋放的環(huán)境安全性和由轉 基因作物生產出的食品的安全性上。包括對人和動物健康的風險、對生態(tài) 環(huán)境與農業(yè)的風險、對非目標生物的風險。針對第一種風險，聯(lián)合國經濟 發(fā)展與合作組織提出了食品安全性評估的"實質等同性"原則。如果轉基 因作物生產的產品與傳統(tǒng)產品具有實質等同性，則可以認為是安全的。
歐盟最早提出對轉基因食品進行標識管理。1999年，要求出口到歐盟 的非轉基因產品不得含有1%的轉基因產品污染；2002年，歐盟將標識的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亞、新西蘭對轉基因成分的最低含量做 了不同規(guī)定，域值從1-5%不等。
我國于2001年5月9日公布并實施《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》， 于2002年1月5日公布了農業(yè)轉基因生物安全評價、標識和進口安全管 理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業(yè)轉基因生物目 錄，并于2002年3月20日起正式實施。
轉基因成分檢測方法有Western blots、 ELISA、試紙條、竟爭性PCR、 實時定量PCR和PCR- ELISA等。轉基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含 有外源蛋白質(基因表達產物)和是否含有外源基因(DNA)。轉基因作 物中外源蛋白可以利用基于免疫學原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、試 紙條檢測、Western雜交等方法檢測，主要從待測樣品中按照一定的程序 抽提含有目的蛋白的基質，利用抗體與目的蛋白(抗原)特異結合的特性， 通過偶聯(lián)抗體與抗原抗體復合物的作用產生可檢測的信號。轉基因作物的 核酸檢測方法主要有兩種核酸分子雜交技術(Sourthern blot) , PCR 檢測技術。
目前，PCR檢測方法是最主要、最準確地檢測轉基因作物的方法，包 括定性PCR方法、復合PCR方法、巢式PCR方法、竟爭性定量PCR方法、熒光 定量PCR方法等。國內外推廣使用的是定性PCR和實時定量PCR檢測方法 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列 兩端互補的寡核苷酸引物。通過聚合酶的作用，在體外快速特異地擴增目 的片段，使微量、特定的目的DNA片段在幾小時內迅速擴增到百萬倍。擴 增產物經瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具有快速、 靈敏等優(yōu)點。
目前國際和國內轉基因檢測標準主要是定性PCR和實時熒光定量PCR 檢測。定性PCR方法技術成熟，穩(wěn)定，但反應體系和操作過程比較復雜，
需要專業(yè)人員；所需PCR儀價格在5萬元左右，擴增時間2-3小時，擴增結 果電泳時間需l小時左右；電泳常用染料EB是強致癌物，有較強毒性。實 時熒光定量PCR技術先進，靈敏度更高，擴增時間在l小時左右，擴增結果 實時在電腦上顯示；能檢測出樣品中外源基因的數(shù)量信息(拷貝數(shù))穩(wěn)定 性、體系和操作同定性PCR相當，但儀器和耗材價格較高； 一臺定量PCR在 50萬元左右，不宜大范圍推廣。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開一種快速檢測轉基因玉米品系Mon810的方法 及根據(jù)外源基因序列設計一套引物對其進行擴增，通過肉眼觀察濁度或觀 察加入SYBR Green后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結果判斷擴增情 況。
本發(fā)明基于轉基因玉米品系Mon810的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合 成酶基因特異性引物進行多聚酶鏈式反應(PCR)，從而提供檢測轉基因 玉米品系Mon810的方法。
本發(fā)明的技術方案如下
一種用于檢測轉基因玉米品系Mon810的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸 合成酶基因特異性引物，其中外引物正向序列為CTGCGTTGAACTCTAGGCC， 反向序列為 CTGGAACGTTTCCCTGTTGT ; 內引物正向序列為 TTCCCGAGCTCATGGCGAAAAATGCAAGACTAGCAAATGGGT ， 反向序列為 AGCTTGAAGGGTTGAGCCAGAGGCTCAGCCAGTCTAGTAGGA ， 環(huán)引 物為 CACTAAGACCTGAAGTCAGACGA。引物分別配制濃度為100 p M的母液，然后取 外引物各8yL，內引物各1jliL,環(huán)引物2pL，充分混合，為引物混合溶 液。
本發(fā)明采用上述一套引物進行快速檢測轉基因玉米品系Mon810的方 法，其特征在于包括如下步驟
(1)采用權利要求1所述的5條特異引物及一種具有鏈置換活性的 DM聚合酶，加入模板DM,在63-65匸進行45-60min,并且在80"持續(xù) 2min， 4'C保存，使擴增達到10'-l(T個拷貝；
其中的擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL，其各種成分分別 為10 x Buffer 2.5 |LiL, 4M BSA 6. 25 ja L， 0. 2M MgS04 0. 25 p L,混合引 物lnL， 10nM dNTPs 3. 5yL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2 n L, 模板DNA 1-5 nL,用滅菌去離子水補齊到25jnL;
(2)擴增反應結束，取體系液3-25nL，采用不同方法判斷擴增與否， 包括直接向擴增管中加入嵌入劑SYBR Green,通過顏色變化觀察有無擴 增反應；或評估擴增副產物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來觀察有無擴增反
應；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結果。 本發(fā)明所述的嵌入劑SYBR Green加入量為1-2 ja L。 本發(fā)明所述的檢測方法，模板DNA指的待測樣品采用CTAB法提取純
化得到的DNA。
為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗方法 做以詳細的說明。
1、 原理
本方法應用 一種新型的核酸擴增方法，其原理是采用5條特異引物及 一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63"C-65t:對核酸進行擴增，短時間 擴增效率可達到109-101(1個拷貝。具有高特異性、高效性、快速、簡便、易 檢測等特點。
2、 引物設計
本研究依據(jù)轉基因玉米品系Mon810外源基因與內源基因結合處序列 設計了5條引物。引物由大連寶生物公司合成。
包括正向內引物FIP、正向外引物F3、反向內引物BIP、反向外引物B3、 正向環(huán)引物LF、反向環(huán)引物LB。內引物長度通常超過40個堿基，外引物短 些，為25個堿基左右。
表l引物序列表如下:_
引物名稱 堿基數(shù)_序列(5'to3')_
F3-M0N810 19 CTGCGTTGAACTCTAGGCC
B3-MON810 20 CTGGAACGTTTCCCTGTTGT
FIP-MON810 42 TTCCCGAGCTCATGGCGAAAAATGCAAGACTAGCAAATGGGT
BIP-MON810 42 AGCTTGAAGGGTTGAGCCAGAGGCTCAGCCAGTCTAGTAGGA
LB-MON810 23 CACTAAGACCTGAAGTCAGACGA
3、 反應條件
反應試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、 Mon810品系特異性引物、 BSA、 MgS04和反應緩沖液。反應在恒溫條件下進行，反應時間依據(jù)引物的 效率和模板DNA質量變化， 一般為lh或更少。加入模板DNA，在63-65 €進 行45-60min，并且在80t:持續(xù)2min而終止。這項技術的優(yōu)點就是不需要熱 循環(huán)。由于擴增是在恒溫條件下進行的，因此僅需要恒溫水浴鍋或金屬加 熱塊維持反應溫度，不需要PCR儀等昂貴的儀器。 材料與方法
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液;Mon810品系特異性引物;BSA溶液；MgS04溶液；dNTPs;
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25yL，其各種成分及終濃度 分別為10 x Buffer 2. 5 |i L, 4MBSA6. 25pL, 0. 2M MgS04 0. 25 pL，引 物混合液lyL， 10nMdNTPs 3.5jnL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2 HL，模板DM 1-5 nL，用滅菌去離子水補齊到25yL。
(3) 擴增反應過程在63-65 "C進行45-60min,并且在80"C持續(xù)2min， 4C保存；
(4 )擴增反應結束，取體系液5-25 ji L用不同的檢測方法判斷擴增與否。
4、 擴增結果觀察 有三種觀察方法，適合不同情況下進行
1) 使用2%瓊脂糖凝膠，加入EB染色劑，100V電泳50min,在紫外燈下 觀察。反應會產生各種片斷長度的莖環(huán)結構的擴增產物，因此在電泳圖譜 中顯示為從點樣孔處開始的彌散和條帶現(xiàn)象。由于EB是致癌劑，因此該方 法應用不是很廣范。結果見圖l。
2) 由于反應形成大量雙鏈DNA產物，可以直接向擴增管中加入嵌入劑 SYBRGreen，紫外燈下或肉眼觀察，無擴增反應的管子呈橙色，有擴增反
應的管子將變?yōu)榫G色。結果見圖2。
3)檢測還可以通過評估擴增副產物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來進 行。在反應中，在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶 液中的Mg"結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性，可以 用肉眼觀察或濁度儀檢測反應管中的沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。
本發(fā)明的用于轉基因玉米品系Mon810檢測的擴增方法，具有以下優(yōu)
點
1) 操作筒便不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，只需一恒定溫 度就能反應，不需要預先進行雙鏈DNA的變性。
2) 高特異性該技術由5條引物擴增靶序列的6個區(qū)段，因此具有高 度特異性。
3) 快速高效整個擴增不到lh即可完成，產量可達到109-1019個拷貝；
4) 靈敏度高擴增模板可僅為10拷貝甚至更少。
5) 鑒定簡便可以用肉眼直接觀察反應管內沉淀的混濁度或者通過 SYBR Green顏色變化判斷擴增與否。


圖l為擴增產物的電泳分析圖譜。自左向右依次為陰性對照、陰性樣 品、Marker、陽性對照和陽性樣品。
圖2為擴增產物加入SYBR Green結果圖。左為Mon810陽性對照，右為 陰性對照。
圖3為擴增產物加入SYBR Green結果圖。從左邊依次為陽性對照、待 測樣品、陰性對照。
圖4為擴增產物加入SY肌Green結果圖。由左至右為陰性對照、待測 樣品l、陽性對照和待測樣品2。
圖5為擴增產物的電泳分析圖譜。由左至右Marker、陽性對照l、陽 性對照2、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照。
圖6為實施例4對比實驗瓊脂糖凝膠電泳結果。其中M，DL2000 DM， Marker; 1,5%; 2， 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5， 0.05%; 6， 0. 01%; 7, 0. 005%; 8，
陰性對照
為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面對本發(fā)明的試驗方法做以
詳細的說明，在此需加以說明的是
(1) 本發(fā)明所述的引物序列見表l。
(2) 轉基因玉米Mon810模板DNA的提取常規(guī)CTAB法提取(見附件) 實施例l
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液；Mon810特異性引物混合液；4M BSA溶液；0. 2M MgS04溶 液；
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL,其各種成分分別為 10 x Buffer 2.5 jliL， 4M BSA 6. 25jaL, 0. 2M MgS04 0. 25 jli L,混合引物l jLiL, 10pMdNTPs 3.5jLiL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l p L，模板DNA lpL，用滅菌去離子水補齊到25uL，混合均勻后離心；
(3) 擴增反應程序在63"C進行60min，并且在80。C保溫2min, 4n，
保存；
(4) 擴增反應結束，取體系液5pL，直接向擴增管中加入嵌入劑ln L 1000 xSYBR Green,震蕩混勻，肉眼觀察結果。無擴增反應的管子呈橙 黃色，有擴增反應的管子將變?yōu)榫G色。結果見圖3，由圖可見，待測樣品 位陽性樣品，還有Mon810成份。
實施例2
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液；Mon810特異性引物混合液；4M BSA溶液；0. 2M MgS04溶 液；
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25jiL,其各種成分分別為 10 x Buffer 2. 5pL， 4M BSA 6. 25jliL， 0. 2M MgS04，混合引物O. 25yL ， lOyM dNTPs 3.5uL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2 ja L，模板DNA
L,用滅菌去離子水補齊到25jiL,混合均勻后離心；
(3) 擴增反應程序在65t:進行45fflin，并且在80t:保溫2邁in， 4'C，
保存；
(4)擴增反應結束，取體系液15mL，直接向擴增管中加入嵌入劑2 juL 1000 xSYBR Green，震蕩混勻，肉眼觀察結果。無擴增反應的管子呈 橙黃色，有擴增反應的管子將變?yōu)榫G色。結果見圖4，由圖可以看出，待 測樣品l為陰性樣品，不含有Mon810成分，樣品2還有Mon810成分。
實施例3
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液；Mon810特異性引物混合液；4M BSA溶液；0. 2M MgS04溶
液；
(2) 擴增反應體系擴增反應的總體積為25nL,其各種成分分別為 10 x Buffer 2. 5^L, 4M BSA 6. 25pL， 0. 2M MgS04，混合引物0.25iuL ， IOiliM dNTPs 3.5juL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2 ju L,模板DNA
L，用滅菌去離子水補齊到25juL，混合均勻后離心；
(3) 擴增反應程序在63。C進行60min，并且在80C保溫2min， 4匸，
保存；
(4) 擴增反應結束，取體系液25nL經2。yi瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外 燈下觀察結果。無擴增反應的管子無明顯條帶，有擴增反應的管子出現(xiàn)階 梯狀條帶。結果見圖5，樣品l和2豆含有Mon810成分。
實施例4
對比實驗轉基因玉米Mon810的定性PCR測定方法與本發(fā)明的測定方 法的對比
(1) 本發(fā)明試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產的Bst DNA聚合酶大 片段和10倍Buffer溶液；BT176特異性引物混合液；4M BSA溶液；0. 2MMgS04 溶液；DNA模板包括含有轉基因玉米BT176成份5。/L 1%、 0. 5%、 0.1%、 0. 05%、 0. 01%、 0. 005%、 0. 001%的樣品。
(2) 本發(fā)明擴增反應體系擴增反應的總體積為25pL，其各種成分 分別為10 x Buffer 2. 5pL, 4M BSA 6. 25pL， 0. 2M MgS04 0. 25 jiL,
混合引物lyL, 10jaMdNTPs 3.5pL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2p L，模板DNA 5yL,用滅菌去離子水補齊到25pL,混合均勻后離心；
(3) 本發(fā)明擴增反應程序在63lC進行60min，并且在80t:保溫2min, 4X:，保存；
(4) 本發(fā)明擴增反應結束，取體系液3pL，經2%瓊脂糖凝膠電泳分 析，紫外燈下觀察結果。無擴增反應的管子無明顯條帶，有擴增反應的管 子出現(xiàn)階梯狀條帶。結果見圖6(A): M，DL2000 DNA, Marker; 1， 5%; 2， 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5， 0.05%; 6， 0. 01%; 7， 0. 005%; 8，陰性對照。
(5) PCR 反應引物采用本發(fā)明反應中一對外引物F3和B3。 PCR反應 為25uL體系，10XPCRbuffer(Promega)2. 5 u L， 10 mM dNTPs ( Promega ) 0. 5 uL，上游和下游引物(10mM)各O. 5 wL， Taq酶(5 U/u L， Promega ) 0.5 uL， DNA模板liiL，滅菌去離子水19.5 y L。反應程序為95 。C預變 性5min， 95 。C變性30 s, 58。C退火30 s, 72。C延伸30 s, 72 。C延伸7 min。 PCR產物取IO uL于2n/。瓊脂糖凝膠電泳，v電壓下40 min，通過凝膠成 像分析儀觀察結果圖6(B): M，DL2000 DNA, Marker; 1， 5%; 2,1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5， 0.05°/。； 6， 0. 01%; 7. 0. 005%; 8，陰性對照。
由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度明顯高于PCR方法的 敏感度，能檢測出Mon810含量更低的樣品。
附件常規(guī)CTAB法提取轉基因玉米Mon810 DNA的方法
(1) 取轉基因玉米Mon810，約100mg,放入研缽中，加入少量液氮迅 速磨碎。液氮反復加入3~4次，磨碎成粉末為止。
(2) 加入1. 5mL預熱至65。C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣(依 試樣不同，可適當增加緩沖液的用量)，65。C保育30min,期間不停顛倒 混勻；
(3) 約12000g離心10min。轉移上清至一新離心管，加入l倍體積的酚 氯仿異戊醇(25: 24: 1 ),充分混合。約12000g離心15min。轉移上清
至一新離心管中；
(4) 加入1倍體積的氯仿異戊醇(24: 1),充分混合。約12000g離 心15min。轉移上清至一新離心管中；
(5) 加入2倍體積CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min; 12000g離心 15min，棄上清；加入35(VL氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心IO min，轉 移上清至一新離心管。
(6) 加入0. 6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min。 12000g離心15min。棄上清。加入500-70%乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次。 12000g離心10min。棄上清。
(7) 干燥DNA沉淀，加1 OOfiL水或TE緩沖液溶解DNA
序列表
<110>天津巿農業(yè)科學院中心實驗室
<120> —種快速檢測轉基因玉米品系Mon810的方法及所用引物
<160> 5
<210> 1
<211> 19bp
<212> DNA
<213>人工序列
<權> 1
ctgcgttgaa ctctaggcc 19
<210> 2
<211> 20bp
<212>腿
<213>人工序列
<錫> 2
ctggaacgtt tccctgttgt 20
<210> 3 <211> 42bp <212>飄 <213>人工序列 <400> 3
ttcccgagct catggcgaaa aatgcaagac Ugcaaatgg gt 42
<210> 4
<211> 42bp
<212> ■
<213> 人工序列
<400> 4
agcttgaagg gttg3gccag aggctcagcc agtcUgtag ga 42
<210> 5
<211> 23bp
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
cactaagacc tgaagtcaga cga 2權利要求
1、用于檢測轉基因玉米品系Mon810的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因特異性引物，其特征在于，包括外引物正向序列CTGCGTTGAACTCTAGGCC，反向序列CTGGAACGTTTCCCTGTTGT；內引物正向序列TTCCCGAGCTCATGGCGAAAAATGCAAGACTAGCAAATGGGT，反向序列AGCTTGAAGGGTTGAGCCAGAGGCTCAGCCAGTCTAGTAGGA，環(huán)引物CACTAAGACCTGAAGTCAGACGA。
2、 一種采用權利要求1所述特異性引物快速檢測轉基因玉米Mon810 的方法，其特征在于包括如下步驟(1)采用權利要求1所述的5條特異引物及一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65 X:進行45-60min，并且在80X:持續(xù) 2min， 4X:保存，使擴增達到10'-1(T個拷貝；其中的擴增反應體系擴增反應的總體積為25nL，其各種成分分別 為10 x Buffer 2.5 mL， 4MBSA6. 25pL， 0. 2M MgS04 0. 25 jli L，混合引 物1mL， lOyM dNTPs 3.5yL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2 jn L， 模板DNA l-5nL,用滅菌去離子水補齊到25nL;(2)擴增反應結束，取體系液3-25nL，采用不同方法判斷擴增與否， 包括直接向擴增管中加入嵌入劑SYBR Green，通過顏色變化觀察有無擴 增反應；或評估擴增副產物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來觀察有無擴增反 應；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結果。
3、 如權利要求2所述的檢測方法，其中所述的引物混合溶液指的是 引物分別配制濃度為lOO)iM的母液，然后取外引物各8yL，內引物各lHL，環(huán)引物2jaL,充分混合，制得引物混合溶液。
4、 如權利要求2所述的檢測方法，其中嵌入劑SYBR Green加入量為 l一2iaL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉基因玉米Mon810的快速檢測方法及所用引物。其原理是采用5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在64℃左右對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增效率可達到10⁹-10¹⁰個拷貝。其鑒定采用肉眼直接觀察反應管內沉淀的混濁度或者通過加入SYBR Green顏色變化判斷擴增與否。本發(fā)明的檢測方法具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點，為轉基因作物的檢測開辟了廣闊的前景。
文檔編號C12N15/11GK101358236SQ200810053699
公開日2009年2月4日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權日2008年6月30日
發(fā)明者蘭青闊, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 趙 申請人:天津市農業(yè)科學院中心實驗室