專利名稱：一個(gè)小麥pdr型的abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一個(gè)來(lái)自小麥(rr"ic鵬aseOV， L.)品種望水白的PDR (Pleiotropic Drug Resistance)型的ABC (ATP-Binding Cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基 因及其所編碼的蛋白質(zhì)，屬于基因工程領(lǐng)域，該P(yáng)DR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可作為 目的基因?qū)敫谐嗝共⌒←溒贩N，可以降低小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (deoxynivalenol， DON)的含量。
二、 背景技術(shù)-
由赤霉菌(^ksarj'"/B gr3肌'/7era咖)侵染引起的赤霉病(raB)是一種世界范圍
的真菌性病害，可對(duì)小麥，大麥、玉米等作物產(chǎn)生危害。該病害不僅直接造成作物 減產(chǎn)，因赤霉菌在籽粒中可產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物都非常有害的DON和其他一些 trichothecene toxins,故糧食品質(zhì)也受到嚴(yán)重影響。在赤霉菌產(chǎn)生的毒素中，DON 是其中重要的一種，也稱為致嘔毒素，該毒素屬于單端孢霉烯(trichothecenes) 家族，是包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家的糧食中最普遍存在的一類毒素，對(duì)人和動(dòng)物的 副作用主要是影響神經(jīng)系統(tǒng)，降低免疫力。為了保護(hù)消費(fèi)者的安全，目前，很多國(guó) 家都對(duì)小麥面粉中DON的含量做出了一定的限制。
人們最早將小麥對(duì)赤霉病的抗性分為抗侵染(Type I)和抗擴(kuò)展(Type II) 兩種類型。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)抗病品種存在能夠阻止毒素DON合成或促使其降解的因 素，于是又提出了第三類抗性(Type III)即抗毒素或降解毒素積累。自第三類抗 性(Type III)提出后，人們?cè)谶@方面做了很多的工作，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些和抗毒素 或降解毒素積累相關(guān)的基因，從抗病品種中分離出來(lái)的具有降解DON功能的鐮刀菌 乙?；D(zhuǎn)移酶基因；還從擬南芥中克隆出了可以降低D0N毒性的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶基因；PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首先是在酵母(&Jcc/ aro歷yces cerew'sj'ae)中發(fā)現(xiàn)，與抗真 菌性藥物的代謝有關(guān)，是作為排出胞內(nèi)有毒化合物的泵，可以將真菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒 素排出體外，減少對(duì)細(xì)胞的毒害。酵母,/W堪因的突變體對(duì)赤霉菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素 DON比野生型更為敏感，顯示了PDR蛋白在抗DON中的作用。但是在小麥中還沒有發(fā) 現(xiàn)有這類基因的報(bào)道。小麥品種望水白是到目前為止大家公認(rèn)的抗赤霉病最好，抗 性最穩(wěn)定、DON含量也很低的一個(gè)品種，所以從望水白中克隆出轉(zhuǎn)運(yùn)DON的基因、將 之轉(zhuǎn)到其他感病小麥品種中，有望降低小麥籽粒中DON的含量。三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于公開一個(gè)來(lái)自小麥(7^'Wc"歷L.)品種望水白的 PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，可作為目的基因?qū)肫渌←溒?種，提高小麥的赤霉病抗性，降低小麥籽粒中的DON的含量，進(jìn)行小麥品種改良。 技術(shù)方案
本發(fā)明的PDR型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，來(lái)自小麥品種望水白，命名為7a尸ZW7基 因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。該P(yáng)DR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋 白質(zhì)，命名為TaPDRl蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。 有益效果
1、 本發(fā)明公開了一個(gè)PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(&尸ZW7)及其所編碼的蛋白質(zhì)。 PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)樾←溨械氖状螆?bào)道，該基因來(lái)自小麥品種望水白，可 作為目的基因?qū)肫渌谐嗝共⌒←溒贩N，提高小麥的赤霉病抗性，降低小麥籽粒 中的DON的含量，進(jìn)行小麥品種改良。
2、 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的T2代種子和非轉(zhuǎn)基因種子，置于含濃度為20ng/ml DON的1/2MS培養(yǎng)基上，30天后，轉(zhuǎn)基因植株葉片比較大，伸展度好，子葉保持 綠色，長(zhǎng)出長(zhǎng)長(zhǎng)的白色的根；而對(duì)照則葉片比較小，葉片萎縮畸形，子葉已經(jīng)枯黃， 而且幼苗的真葉數(shù)目較少，沒有長(zhǎng)出根(如圖5)。表明TaPDRl與細(xì)胞毒素DON 的抗性有關(guān)，植物中的PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，所 以我們推測(cè)TaPDRl可以將赤霉菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素DON排出體外，減少對(duì)細(xì)胞的 毒害。
3、 利用本發(fā)明7^,Z^7基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種 啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子。 為了簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對(duì)抗生素抗性的酶，也可利用顏色 變化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來(lái)識(shí)別的化合物的酶 類，也可用無(wú)標(biāo)記選擇。轉(zhuǎn)化方法使用小麥中成熟的基因槍法。
四

圖1 fa戶ZM7在經(jīng)DON誘導(dǎo)的小麥望水白穗部中的克隆
注箭頭所示從DON誘導(dǎo)的望水白穗組織cDNA中擴(kuò)增出的ra/Wi7，
M表示分子量標(biāo)記 圖2半定量RT-PCR分析fa尸iW7基因在DON誘導(dǎo)的小麥望水白穗部的表達(dá)情況 注A表示ra尸Z /i7基因在DON誘導(dǎo)0， 6， 12, 24， 48， 72小時(shí)的穗部的表達(dá)，
B表示內(nèi)參7i/力uh'/ 基因在D0N誘導(dǎo)0， 6， 12, 24， 48， 72小時(shí)的穗部的表達(dá)圖3 7a尸/M7在中國(guó)春缺體-四體和缺失系上的染色體定位 注NT1A/1D表示普通小麥背景中缺失2條1A染色體，添加2條1D染色體， NT1B/1A表示普通小麥背景中缺失2條1B染色體，添加2條1A染色體， 其它號(hào)碼依此類推
NT7D/7A表示普通小麥背景中缺失2條7D染色體，添加2條7A染色體， 箭頭所指為7^ZW/在5A中缺失 圖4植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220. 6的構(gòu)建模式圖
圖5轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株在含DON的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30天后情況 注CK為野生型對(duì)照，
K10為轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性株L代
五具體實(shí)施例方式
1、 利用小麥cDNA基因芯片篩選小麥抗赤霉病相關(guān)基因
小麥(7riWcase"w/歷L.)品種望水白(公知公用材料，裴自友，賈高峰 等.普通小麥籽粒D0N含量的配合力分析,作物學(xué)報(bào)，2007，33(5):731 - 737)在幼 穗期采用單花滴注法接種DON (Sigma公司)水溶液(100ng/ml)，接種12、 24小 時(shí)后取樣，分別提取RNA (用Invitrogen公司的Trizol試劑提取)等量混合形成 實(shí)驗(yàn)組；用水接種作為對(duì)照，對(duì)照與DON接種的幼穗同時(shí)取樣，分別提取RNA等量 混合形成對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的R亂樣品用Superscript II反轉(zhuǎn)錄成cDNA (試 劑盒購(gòu)自Gibco/BRL， Gaithersburg, MD, USA)，并進(jìn)一步在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA。實(shí) 驗(yàn)組和對(duì)照組的cRNA樣品同時(shí)與小麥表達(dá)譜芯片GeneChip⑧Wheat Genome Array
(http:〃www. affymetrix. com/products/arrays/specific/wheat. affx)進(jìn)行雜 交，芯片雜交實(shí)驗(yàn)在"上海國(guó)家生物芯片工程中心"完成，實(shí)驗(yàn)步驟參照Af fymetrix 公司說(shuō)明書"Expressed Analysis Technical Manual"
(http:〃www. affymetrix. com/support/technical/manual/expression manual. affx)。以實(shí)驗(yàn)組信號(hào)與對(duì)照組信號(hào)比值大于2為標(biāo)準(zhǔn)篩選上調(diào)表達(dá)基因，得到編 號(hào)為BQ161629的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。由于該基因在誘導(dǎo)樣品中比在非誘導(dǎo)樣品中 的表達(dá)量高，實(shí)驗(yàn)組雜交信號(hào)與對(duì)照組雜交信號(hào)比值為255，所以初步判斷該基因 與D0N抗性具有密切相關(guān)性。
2、 Ta尸ZM7基因的克隆
根據(jù)BQ161629序列設(shè)計(jì)特異引物SH49S (ACTTTGACAACAACCGACAG)和SH49A (GCATTAAGCACGATTTCC)，用小麥基因組TAC文庫(kù)(方玉達(dá)，劉耀光等.小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)文庫(kù)的構(gòu)建，生物工程學(xué)報(bào)，2000， 16(4) :433-436 )的菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)篩選含有BQ161629序列的TAC克隆。 反應(yīng)體系為TAC文庫(kù)菌液2iU; 10umol/LSH49S引物和SH49A引物各0.5ul; 10 X PCR buffer 2. 5 ii 1; 2. 5mmol/L dNTP 2. 5 y 1; 25mmol/L Mg2+1. 5 w 1; 5U/ w 1Taq polymerase 0. 25ul，加水至總體積25iU。反應(yīng)條件為94°C 3分鐘;94°C 30 秒，55°C 45秒，72°C 1分鐘，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘(本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)試劑購(gòu) 于TAKARA公司)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)篩選到的陽(yáng)性單克隆提 取質(zhì)粒并用染色體步行法對(duì)單克隆測(cè)序。用Softberry軟件
(http: 〃www. sof tberry. com)對(duì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該基因全長(zhǎng) 8140bp， 0RF 4305bp，編碼1435aa，分子量161KD。用預(yù)測(cè)的蛋白序列在 NCBI上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對(duì)，該基因?qū)儆赑DR亞家族，與水稻的PDR5基因 同源性最高，所以把該基因定名為化/^y 7。根據(jù)序列預(yù)測(cè)結(jié)果，在化尸ZW7 的5，和3，非翻譯區(qū)各設(shè)計(jì)一條引物CPDR1S
(CACGGATCCACAGACAGGCACAGAAAGA)和CPDR1A (AAACCCGGGTTGACAACAAC CGACAGA)， 從DON誘導(dǎo)的望水白穗組織cDNA中擴(kuò)增出望水白的cDNA序列4. 5Kb(包含 完整的0RF)。反應(yīng)體系5ul cDNA模板；10umol/L CPDR1S引物和CPDR1A引 物各2ul; 2XGC bufferll 25lU; 2. 5mmol/L dNTP 8ul; 5U/ul LA Taq polymerase 0. 5yl ，加水至總體積50 y 1。反應(yīng)條件為94°C 3分鐘；94°C 30 秒，58°C 45秒，72°C 4分鐘，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘(本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)試劑購(gòu) 于TAKARA公司)。PCR產(chǎn)物構(gòu)建到pGEM-T載體(promega公司)，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò) 增出的序列與軟件預(yù)測(cè)序列一致。
3、半定量RT-PCR分析ra尸Z7A7的表達(dá)量
小麥望水白幼穗期用DON水溶液(100ng/ml)對(duì)幼穗進(jìn)行單花滴注法接種，于 接種0h、 6h、 12h、 24h、 48h、 72h后分別取幼穗并提取RNA，用AMV Reverse Transcriptase XL (TAKARA公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板、SH49S和SH49A 為引物、管家基因7"/wh'/7為內(nèi)參(擴(kuò)增化力"力'77基因的引物為tubulin F-CTCATCACAGGCAAGGAAGAT和tubulin R- TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG)進(jìn)行RT-PCR，分 析7a尸"A7的表達(dá)情況。反應(yīng)體系2 ii lcDNA為模板；10 w mol/L SH49S引物和SH49A 引物各0.5y 1; 10XPCR buffer 2.5ii 1; 2. 5腿ol/L dNTP 2. 5y 1; 25腿ol/L Mg2+1.5yl; 5U/u ITaq polymerase 0. 25yl，加水至總體積25nl。反應(yīng)條件為 94°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C 45秒，72°C 1分鐘，27個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。(擴(kuò)增n/Zwh77基因的引物退火溫度為53"C，其它條件相同)
RT-PCR結(jié)果表明ra尸ZW7在小麥望水白穗部可被D0N誘導(dǎo)表達(dá)，并在較長(zhǎng)時(shí) 間內(nèi)維持較高水平(圖2)。
4、 7a尸ZW7在小麥染色體上的定位
用一套普通小麥品種中國(guó)春的缺體-四體材料(公知公用材料，莊麗芳，宋立 曉等.小麥EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)和染色體定位及其在追蹤黑麥染色體中的應(yīng)用，作 物學(xué)報(bào)，2008， 34(6) :926-933)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，對(duì)Ta尸ZM在小麥中進(jìn)行 染色體定位，染色體定位使用的引物為SH49S和SH49A (PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件都 與"2. ra尸"A7基因的克隆"中相同)。定位結(jié)果在缺失4A、 5A和5B染色體的材料 中各缺失了一條擴(kuò)增帶(如圖3)。根據(jù)TAC克隆測(cè)序的結(jié)果可知，引物SH49S和SH49A 可從化尸/W7的基因組序列上擴(kuò)增出269bp大小的片斷，這與5A上缺失的片斷大小一 致，所以可以將化尸ZW7定位于5A染色體上。
5、 轉(zhuǎn)基因擬南芥的功能驗(yàn)證
把7s尸ZW7的基因組序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220. 6中(如圖4)， 植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220. 6的構(gòu)建如圖4所示，先用BamH I和Kpn I雙酶 切將目標(biāo)片斷ra尸"y /的全序列插入到載體pBI220. 6 (公知公用材料，Ya-Ping Chen et al., Plastidial Glut athione Reductase from Haynaldia villosa is an Enhancer of Powdery Mildew Resistance in Wheat (Triticum aestivum). Plant and Cell Physiology, 2007, 48(12) : 1702-1712)的35S啟動(dòng)子后面的多酶切位點(diǎn) 處，然后用EcoR I和Hind III雙酶切將載體pBI220. 6的完整表達(dá)框插入到載體 pC層BIA1301 (公知公用材料，薛仁鎬，基因槍法轉(zhuǎn)化大豆萌動(dòng)種子影響因素的研究， 大豆科學(xué)，2008, 27 (2): 194-198)的多酶切位點(diǎn)處。構(gòu)建好的表達(dá)載體用330V 電壓電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌C58ci (公知公用材料張彬等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)春小麥遺傳轉(zhuǎn)化 體系的優(yōu)化研究,核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21(2): 124 127)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆接 種于YEB液體培養(yǎng)基(含50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液0D600 為0.6 0.8，然后離心收集菌體沉淀，將菌體再重懸于同體積的轉(zhuǎn)化滲透液 (1/2MS+5。/。蔗糖+0. 044uM6BA+0. 05% Silvet77)中備用。
野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Co10 (公知公用材料，戴富明等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)木 霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥及其Ti代對(duì)油菜菌核病抗性提高,上海交通大學(xué)學(xué)報(bào) (農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2005,23(1): 36-40)種子浮于0.8%的瓊脂中4QC條件下春化處理 48h后，播種到基質(zhì)(腐質(zhì)營(yíng)養(yǎng)土 蛭石為1:1)中，22GC 25QC， 16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)。利用浸花法用上述備用的農(nóng)桿菌菌體轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)化后保濕 48h，以后在正常條件下生長(zhǎng)，直到收獲種子。
將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后收獲的擬南芥種子經(jīng)0. 1%的升汞消毒15min，無(wú)菌水清洗2遍 后置于含50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4°C黑暗條件下春化處理48h后，轉(zhuǎn)到 22°C 25°C， 16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)7天。潮霉素共篩選出8棵陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株， 把陽(yáng)性苗移栽到基質(zhì)中在相同條件下繼續(xù)生長(zhǎng)。提取8棵植株的DNA，用Sh49A和 Sh49S為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)7a尸Z^ 厶以擬南芥肌動(dòng)蛋白基因acti/j 2為內(nèi)參(引物 為ACT2-F:TGGTGATGGTGTGTCT和ACT2-R: ACTGAGCACAATGTTAC) (PCR反應(yīng)體系和 反應(yīng)條件都與"2. 7^尸ZW7基因的克隆"中相同)。8棵植株都能擴(kuò)增出目標(biāo)片段， 說(shuō)明7s尸ZW7己經(jīng)完全整合到擬南芥基因組。
轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的T2代種子和非轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)O. W的升汞消毒15min，無(wú)菌 水清洗2遍后置于含濃度為20ng/ml DON的1/2MS培養(yǎng)基上，4°C黑暗條件下春化 處理48h后，轉(zhuǎn)到22"C 25"C， 16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)30天，觀察分析轉(zhuǎn)基 因陽(yáng)性和非轉(zhuǎn)基因CK的植株在DON環(huán)境中生長(zhǎng)情況。30天后，轉(zhuǎn)基因植株葉片比 較大，伸展度好，子葉保持綠色，長(zhǎng)出長(zhǎng)長(zhǎng)的白色的根；而對(duì)照則葉片比較小，葉 片萎縮畸形，子葉已經(jīng)枯黃，而且幼苗的真葉數(shù)目少，沒有長(zhǎng)出根(如圖5)。表明 TaPDRl與細(xì)胞毒素DON的抗性有關(guān)，植物中的PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé) 物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，由此我們推測(cè)TaPDRl可以將赤霉菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素DON排出體 外，減少對(duì)細(xì)胞的毒害，從而達(dá)到降低小麥籽粒中DON的含量。
利用本發(fā)明ra尸ZW7基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種 啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子。 為了簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對(duì)抗生素抗性的酶，也可利用顏色 變化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來(lái)識(shí)別的化合物的酶 類，也可用無(wú)標(biāo)記選擇。轉(zhuǎn)化方法使用小麥中成熟的基因槍法。<formula>formula see original document page 9</formula>agtggagctg aXtg^ggaa agtggctatt ctctactc"tg gtggagg卿 cctggagtgg gtagcaaatc gcggcgattg
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1435
PRT
小麥(Triticum aestivum) TaPDRl蛋白質(zhì) 2
Ala Ser Gly Arg Gly Ser
Leu
Trp Gly
Pro Phe
Asn
Arg
65
Thr
Leu
50
Arg
Gly
35
Arg
Ser
20
Arg
5
Arg
Arg Ser Phe
Ala Ala
Trp Ala Ala
Ala Val Val
Glu Met Glu
Ala Gly Arg
Phe Leu
Pro
Phe 145 Phe
Ala 130 Val
Arg 115 lie
Ala 100 Arg
Gly
85
Leu
His
70
Leu
Ser Gin
40 Leu Glu 55
Gly Gly
Ser
25
Gin
Arg
10
lie
Ala Ala
aagaaacttt ttactgtcta aaaaaacgag gtaatgctat tgacaattgc ctggtcttga ctgggcgaac atgagcttct actctcataa gat3taatcc
ctcagaattt ag肌tccagc gcacggtttt ttggagccac ctgttgtggc cattagccta t"tg犯tacac "tctatttcct tggtggcgtt tgtggaacct ggtactactg gcgataacac
tgg3gg3Cgg
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tagtgggtct tgcccgcatc tgaatccata
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ggC333CCCC
cagcccagtg tatgggcstt cggcttcttc
Arg
His
Ser Ser Gly His His
Lys Leu Pro
Val Asp lie
Leu Glu Arg
Leu Arg
Glu Val Arg
Gly Ser Arg
Leu Gin Gly
Leu 165 Gin
Ala 150 Val
Asp Arg 120 Tyr Gin 135
Leu Pro
Val 105 Val
Asn
90
Phe
Val 75 Arg
Thr
60
Asp
Leu Asp Asp Arg Val
Gin
Gly Leu Ser
Thr Leu
Gly Arg Leu
Asn Val Asn
lie His lie Leu 180
Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser
Gly 185 Ser
Ala 170 lie
Trp 155 Ser
Val 140 Asn
Ser Lys Gly Lys Ser
lie
Ala
Gin
Asp
45
Tyr
Gly
Ala
Asp
Gly 125
Gin
Ser Asn Pro Thr
Ser Ala Ala 15
Ala Ala Asp 30
Asp Glu Glu
Asp Arg Met
His Glu Asn 80
Ser Gly Glu 95
Ser Glu Arg 110
lie Asp Leu
Val Asp Ala
Ala Thr Asn 160
Lys Lys Thr
175 Ser Arg Met 190
Leu Met Arg
2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4308Ala
Thr 225 Val
Glu
Asp
Pro
Gin 305 Asp
Ser
Pro
Ser
Met 385 Tyr
Tyr
Phe
Thr
Tyr 465 His
Ser
Ser
Lys
Leu 545 Gly
Leu
Lys
Pro
Leu 625 Phe
Leu
Leu
Leu 210 丁yr
Tyr
Thr
Met
Asp 290 Glu
lie
Gly
Ala
Ser 370 Asn
Asn
His
Arg
Ser 450 Arg
Val
Gin
Trp
Arg 530 Gly
Gin
lie
Met
Trp 610 Val
Ala
Thr
匕ys
195 Thr
Cys
Val
Leu
Leu 275 Pro
Ser
Cys
Gly
Arg 355 Thr
Glu
Leu
Gly
Cys 435 Lys
His
Gly
Thr
Glu 515 Asn
Leu
lie
Thr
Leu 595 Thr
Glu
Pro
His
Ser
Gly
Gly
Ser
Asp 260 Ser
Glu
Asn
Ala
Gin 340 Ala
Phe
Thr
Phe
Pro 420 Pro
Lys
Val
Gin
His 500 Ser
Ser
Val
Ser
Val 580 Pro
Phe
Ser
Ala
Gin 660
Met
Lys
His
Gin 245 Phe
Glu
lie
lie
Asp 325 Lys
Leu
Gin
Val
Asp 405 Arg
Glu
Asp
Ser
Gin 485 Pro
Phe
Phe
Ala
Asp 565 Leu
Thr
Gly
Ser
Ala 645 Met
Val
Leu
Thr 230 Tyr
Ser
Leu
Asp
Val 310 Met
Lys
Phe
lie
Met 390 Asp
Asp
Arg
Gin
Val 470 Met
Ala
Lys
lie
Met 550 Ser
Phe
Phe
Leu
Val 630 Gly
Ala
Val
Asp 215 Phe
Asp
Arg
Ala
Ala 295 Thr
Pro
Arg
Met
Val 375 lie
lie
Asn
Lys
Gin 455 Pro
Leu
Ala
Thr
Tyr 535 Thr
Ala
Asn
丁yr
Val 615 Trp
Arg
Met
Ala
200 Lys
Glu
Leu
Arg
Ala 280 "Tyr
Asp
lie
Val
Asp 360 Lys
Ser
lie
lie
Gly 440 Gin
Glu
Lys
Leu
Val 520 lie
Val
Lys
Gly
Lys 600 Asn
Val
Phe
Gly
Asn
Ser
Glu
His
Cys 265 Arg
Met
Leu
Gly
Thr 345 Glu
Tyr
Leu
Leu
Leu 425 Val
Tyr
Phe
Glu
Thr 505 Met
Phe
Phe
Phe
Phe 585 Gin
lie
lie
Phe
Leu 665 Thr
Leu
Phe
Asn 250 Leu
Glu
Lys
Thr
Asp 330 Thr
lie
lie
Leu
Leu 410 Glu
Ala
Trp
Ala
Leu 490 Thr
Ser
匕ys
Phe
Phe 570 Ala
Arg
lie
Leu
Arg 650 Phe
Leu
Lys
Tyr 235 Ala
Gly
Arg
Ala
Leu 315 Asp
Gly
Ser
Gly
Gin 395 Ser
Phe
Asp
Tyr
Glu 475 Gin
Ser
Arg
Val
Arg 555 Gly
Glu
Asp
Ser
Thr 635 Gin
Arg
Gly
Val 220 Pro
Glu
Val
Glu
Thr 300 匕ys
Met
Glu
Thr
Gin 380 Pro
Glu
Phe
Phe
Leu 460 Arg
lie
匕ys
Glu
Thr 540 Thr
Ala
Leu
Phe
Lys 620 Tyr
Leu
Phe
Met
205
Ser Gly Asn lie
Glu Arg
Met Thr
Gly Ala 270 Ala Gly 285
Ala Val
Val
lie
Met
Gly 365 Leu
Pro
Gly
Glu
Leu 445 Asp
Phe
Pro
Tyr
Leu 525 Gin
Lys
Leu
Gin
Leu 605 Val
Tyr
Leu
Leu
Phe
Leu
Arg
Leu 350 Leu
Val
Pro
Tyr
Ala 430 Gin
Gin
Lys
Phe
Gly 510 Leu
Leu
Met
Thr
Phe 590 Phe
Pro
Val
Ala
Gly 670 Val
Thr
Val 255 Arg
lie
Gin
Gly
Gly 335 Thr
Asp
His
Glu
lie 415 Ala
Glu
Glu
Ser
Asp 495 Gin
Leu
l>eu
Pro
Phe 575 Thr
Phe
Val
Met
Phe 655 Ala
lie
Ser 240 Arg
Tyr
Lys
Gly
[>eu 320 lie
Gly
Ser
Val
Thr 400
Val
Gly
Val
Gin
Phe 480 Lys
Ser
Met
lie
Tyr 560 Ser
lie
Pro
Ser
Gly 640 Phe
Val
Leulie
Pro 705 Asn
Asn
Lys
Gly
Ala 785 Glu
Thr
Ser
Met
lie 865 Ser
Thr
Lys
lie
Trp 945 Val
Met
Arg
Met
Val
Val
Asp
Gly
Ala
Thr
Asn
Lys
Tyr
lie 690 Trp
Ala
Asn
Ser
Ala 770 Leu
Glu
Asn
Leu
Arg 850 Ser
Gly
Ser
Gin
His 930 Leu
Glu
Val
Leu
Asp 1010 Met 1025 Cys 1040 Glu 1055 Glu 1070 lie 1085 Trp 1100 lie 1115 Asn 1130 Glu
675 Phe
Trp
lie
Asp
Arg 755 lie
Thr
Asn
Arg
Ser 835 Glu
Gly
Ala
Gly
Glu 915 Ser
Arg
Glu
Gly
Thr 995 Glu
lie
lie
Ser
Thr 740
Gly
Val
Tyr
Glu
Pro 820 Phe
Gin
Ala
Gly
Ser 900 Thr
Pro
Leu
Val
Leu 980 lie
Phe
Trp
Val 725 Ser
Leu
Gly
Leu
Asn 805 Thr
Asn
Gly
Phe
Lys 885 lie
Phe
Asn
Ser
Met 965 Pro
Ala
Gly
Ala 710 Asn
lie
Phe
Phe
Ser 790 Glu
Arg
His
Phe
Arg 870 Thr
Glu
Ala
Val
Ser 950 Thr
Gly
Val
Gly 695 Tyr
Glu
Ala
Thr
Ala 775 Phe
Thr
Ser
Val
Ala 855 Pro
Thr
Gly
Arg
Thr 935 Asp
Leu
Val
Glu
680 Phe
Trp
Phe
Ala
Gly 760 lie
Gly
Asn
Gin
Asn 840 Glu
Gly
Leu
Ser
lie 920 Val
Val
Val
Asp
Leu
Val
Ser
Leu
Arg 745 Asp
Leu
Ser
Thr
lie 825 Tyr
Ser
Val
Met
lie 905 Ser
Tyr
Asp
Glu
Gly 985
lie
Ser
Ser 730 Thr
Ser
Phe
Ser
Ser 810 Thr
Tyr
Arg
Leu
Asp 890 Thr
Gly
Glu
Glu
Leu 970 Leu
Pro
Pro 715 Ser
Val
Gly
Asn
Ser 795 Met
Leu
Val
Leu
Thr 875 Val
Leu
Tyr
Ser
Lys 955 Asp
Ser
Arg 700 Met
Arg
Gly
Phe
lie 780 Asn
Pro
Pro
Asp
Gin 卿 Ala
Leu
Ser
Cys
lie 940 Thr
Val
Thr
685 Gly
Met
Trp
Glu
Trp 765 Leu
Thr
lie
Phe
Met 845 Leu
Leu
Ala
Gly
Glu 925 Leu
i\rg
Leu
Glu
Asp
Tyr
Ala
Ala 750
Val
Tyr
Val
Asp
Gin 830 Pro
Leu
Val
Gly
Tyr 910 Gin
Tyr
Lys
Arg
Gin 990
lie
Ser
Asn 735 lie
Ser
Leu
Ser
Glu 815 Pro
Ala
Ser
Gly
Arg 895 Pro
Thr
Ser
lie
Asn 975 Arg
Gin
Gin 720 Pro
Leu
lie
Leu
Asp 800 Ala
Leu
Glu
Asp
Val 880 Lys
Lys
Asp
Ala
Phe 960 Ala
Lys
調(diào)
Pro Thr Ser Gly Leu
Arg Thr Leu Leu Pro Met Asn Gin Asp
Ala lie Leu Gly Gly Leu Phe Glu Leu
Val His Leu Arg Val Glu Ala Leu Ser
Arg Gin Met His Glu Val Asp lie Phe
1015
Asn
1030
Pro
1045
Lys
1060
Ser
1075
Lys
1090
Ser
1105
lie
1120
Lys
1135
Pro
Thr Ser Arg His lie Ser Tyr Glu Thr
Val Ala Asn Pro Ser lie lie Phe 1005
Asp Ala Arg Ala Ala Ala lie 1020
Val Asn Thr Gly Arg Thr Val 1035
lie Asp lie Phe Glu Ser Phe 訓(xùn)
Gly Gly Arg Val lie Tyr Ala 1065
Lys lie Val Glu Tyr Phe Glu 1080
Thr Glu Gly Tyr Asn Pro Ala 1095
Pro Ser Ala Glu Ala Arg Leu 1110
Ala Asn Ser Asp Leu Tyr Arg 1125
Leu Ser Val Pro Pro Pro Gly 1140
Lys Tyr Ser Gin Asn Phe Tyr1145 1150 1155
Asn Gin Cys Val Ala Asn Phe Trp Lys Gin Tyr Lys Ser Tyr Trp
1160 1165 1170
Lys Asn Pro Ala His Asn Ala Met Arg Phe Leu Met Thr Leu lie
1175 1180 1185
Tyr Ala Leu Val Phe Gly Thr Val Phe Trp Gin Lys Gly Thr Lys
1190 1195 1200
lie Asn Ser Gin Gin Asp Uu Ala Asn Leu Leu Gly Ala Thr Tyr
1205 1210 1215
Ala Ala Val Phe Phe Leu Gly Ser Ala Asn Cys lie Thr Val Gin
1220 1225 1230
Pro Val Val Ala lie Glu Arg Thr Val Phe Tyr Arg Glu Lys Ala
1235 1240 1245
Ala Gly Met Tyr Ser Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Thr Gin Thr Cys
1250 1255 1260
Val Glu Val Met Tyr Asn lie Val Gin Gly lie Glu Tyr Thr Leu
1265 1270 1275
lie lie Tyr Ser Met lie Gly Tyr Glu Trp Lys Ala Ala Lys Phe
1280 1285 1290
Phe Tyr Phe Leu Phe Phe lie lie Ser Cys Phe Asn Tyr Phe Thr
1295 1300 1305
Leu Phe Gly Met Met Leu Val Ala Leu Ser Ser Ser Ala Met Leu
1310 1315 1320
Ala Asn lie lie lie Ala Phe Val Leu Pro Leu Trp Asn Leu Phe
1325 1330 1335
Ser Gly Phe Leu Val Met Arg Pro Leu lie Pro lie Trp Trp Arg
1340 1345 1350
Trp Tyr Tyr Trp Ala Asn Pro Val Ser Trp Thr lie Tyr Gly Val
1355 1360 1365
lie Gly Ser Gin Phe Gly Asp Asn Thr Ser Pro Val Ser Val Thr
1370 1375 1380
Gly Gly Ser Leu Val Val Val Lys Gin Phe Leu Glu Asp Gly Met
1385 1390 1395
Gly lie Lys His Asp Phe Leu Gly Tyr Val Val Leu Ala His Phe
1400 1405 1410
Ala Tyr Val lie Gly Phe Phe Leu Val Phe Ala Tyr Ser lie Lys
1415 1420 1425
Val Leu Asn Phe Gin Lys Arg
1430 1435
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物SH49S
<222>(". (20)
<223>
<400>3
actttgacaa caaccgacag<210>4
<2U>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物SH49A
<222>(I)..(IS)
<223>
<400>4
gcattaagca cga加c<210>5
<211>28
<212>DNA
20
18
13<213>人工合成 <220>
<221> 引物CPDR1S
<222> (1)..(28) <223>
<400> 5
cacggatcca cagacaggca cagaaaga 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 引物CPDR1A
<222> (1)..(27) <223>
<400> 6
aaacccgggt tgacaacaac cgacaga 27
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 引物tubulin F
<222> (1)..(21) <223>
<400> 7
ctcatcacag gcaaggaaga t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 引物tubulin R
<222> (1)..(21) <223>
<400> 8
ttaaggtaag tgtaggttgg g 21
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221>弓I物ACT2-F
<222> (1)..(16) <223>
<400> 9
tg魄atggt卿ct 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 引物ACT2-R
<222> (i)..(n)
<223>
<400> 10
actgagcaca atgttac 1權(quán)利要求
1、一個(gè)PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，來(lái)自于小麥(Triticum asetivumL.)品種望水白，命名為TaPDR1基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2、 權(quán)利要求l所述PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)，命名為TaPDRl蛋白質(zhì)， 其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3、 權(quán)利要求1所述PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在感赤霉病小麥品種降低小麥籽粒中 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON含量中的基因工程應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)在降低小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇D0N含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)來(lái)自于小麥品種望水白的PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，屬于基因工程領(lǐng)域。PDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(TaPDR1)的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為小麥PDR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)。該基因在小麥中首次報(bào)道，mRNA表達(dá)分析表明該基因受DON誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)；染色體定位信息顯示該基因定位在小麥的5A染色體上；轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明該基因在擬南芥體內(nèi)超量表達(dá)可以提高野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Col0)對(duì)毒素DON的抗性。該P(yáng)DR型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可作為目的基因?qū)敫谐嗝共⌒←溒贩N，可以降低小麥籽粒中DON的含量。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101429512SQ20081024390
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者亓增軍, 劉大鈞, 毅 尚, 曹愛忠, 王秀娥, 邢莉萍, 陳佩度, 馬璐琳 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)