專利名稱：海洋低溫α-淀粉酶基因工程菌、重組酶及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。涉及一種低溫a-淀粉酶基因的表達(dá)載體；本發(fā)明 還涉及其基因工程菌株大腸埃希氏菌Escherichia coli EGPS230 ;本發(fā)明還涉及該菌株產(chǎn) 重組低溫a-淀粉酶的方法與產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
a -淀粉酶為a -1 ， 4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(a -1 ， 4-glucan-4-glucanohydrolase EC.3.2丄1)，是最重要的工業(yè)酶制劑之一，已被廣泛應(yīng)用在食品、發(fā)酵、紡織、造紙和制 藥等諸多行業(yè)。低溫淀粉酶一般來源于低溫微生物，F(xiàn)eller等人在1992年篩選到一株產(chǎn) 淀粉酶的南極嗜冷海豚毒素交替單胞菌Alteramonas haloplanctis A23，該菌在4°C生長良 好，在1『C細(xì)胞繁殖和酶分泌將會(huì)受到影響。在0-3(TC，該菌的淀粉酶活力比來自恒 溫的動(dòng)物淀粉酶活力高7倍。通常情況下，在相對較低溫度范圍內(nèi)，低溫淀粉酶的活性 比相應(yīng)的嗜溫淀粉酶要高。例如，嗜冷性海洋微生物中分離的淀粉酶在6(TC時(shí)活性約為 40°〇時(shí)的50%。最適反應(yīng)溫度與嗜溫淀粉酶相比要低20-3(TC。當(dāng)超過最適反應(yīng)溫度 時(shí)，該酶極易失活。美國Genencor是開發(fā)用于工業(yè)應(yīng)用的新酶的領(lǐng)先者，該公司宣稱其 Optisize(R)淀粉酶在低溫下有高活性。 低溫淀粉酶的特殊性質(zhì)使其在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢，食品行業(yè)是低 溫淀粉酶的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域，很多風(fēng)味物質(zhì)為保持其風(fēng)味不丟失，常常需要在低溫條 件下發(fā)酵。0-2(TC溫度范圍內(nèi)(此時(shí)同源的嗜溫型酶不活潑)，低溫微生物具有高生長速 率、高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱等系統(tǒng)，因 此在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢。與此同時(shí)低溫發(fā)酵還能夠減少中溫菌的污染的危險(xiǎn)，尤 其是在連續(xù)發(fā)酵操作中。 環(huán)境治理是低溫酶又一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，在低溫條件下來自低溫微生物的淀粉酶催 化速度較嗜溫型淀粉酶更快，低溫微生物及其產(chǎn)生的淀粉酶還可替代化學(xué)方法，這些特 點(diǎn)可以使廢水處理費(fèi)用降到最低程度。另外在一些季節(jié)性變化幅度大的地區(qū)，溫度變化 很大，這就使微生物分解有機(jī)污染物如大分子碳水化合物和類脂的效率降低。將能夠分 泌低溫淀粉酶等酶類的低溫微生物接種到這種環(huán)境里去，則有助于提高對難處理化學(xué)物 質(zhì)的生物降解能力。這些微生物具有高催化活性酶及它們在較低溫度下的特殊專一性， 使得低溫微生物及其產(chǎn)生的低溫淀粉酶成為生物治理的理想工具。另外，由于低溫淀粉 酶在0-2(TC的溫度范圍內(nèi)具有高活性的特點(diǎn)，因此，其在飼料、紡織和洗滌工業(yè)的應(yīng)用 方面同樣具有較大的潛力。 相信隨著研究的持續(xù)深入以及生物工程技術(shù)的充分利用，低溫淀粉酶工業(yè)應(yīng)用 前景將會(huì)更廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過分子生物學(xué)技術(shù)將從海洋耐冷細(xì)菌中克隆的一種低溫a-淀粉酶的基因聯(lián)入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法獲得了海洋耐冷細(xì)菌 Pseudoalteromonas arctica GS230的a -淀粉酶基因，并通過分子生物學(xué)技術(shù)將上述低溫 a-淀粉酶基因與表達(dá)載體連接。 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種基因工程菌株大腸埃希氏菌 EPGS230(Escherichia coli EPGS230)， CGMCC No.2700 。 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種制備重組低溫a -淀粉酶的方法， 其包括用上述本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的低溫a-淀粉酶。
本發(fā)明涉及的低溫a -淀粉酶基因來源于海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctica GS230,其基因序列已在GenBank公開，登錄號(hào)為EU849122,公眾如果需要，淮海工學(xué) 院海洋學(xué)院可以對外提供。 本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)重組表達(dá)載體即可，優(yōu) 選大腸桿菌，進(jìn)一步優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。 以上技術(shù)方案中所有基本分子生物操作均參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第三版， 科學(xué)出版社，2002年) 本發(fā)明的低溫a-淀粉酶不僅可以水解淀粉，對于由葡萄糖以a-l， 4糖苷鍵聚 合的多糖都有一定的催化能力。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種 核苷酸序列的表達(dá)載體，其特點(diǎn)是，它是含有來源于海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a-淀粉酶基因序列的表達(dá)載體pEtac-Hivamy;它由下列方法制得將海 洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctiac GS230低溫a -淀粉酶基因的核苷酸序列擴(kuò)增，與質(zhì)粒 pMD18-T載體連接，得到克隆載體pMD18-T-amy，再將克隆載體pMD18-T-amy和表達(dá)載 體pEtac-His6分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后連接得到表達(dá)載體pEtac-His6-amy。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還公開 了一種用于表達(dá)海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a -淀粉酶的基因工程菌 株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700。 該基因工程菌株 大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700是將前述的表達(dá)載體 pEtac-His6-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到。該基因工 程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，已于2008年 10月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.2700，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還公開 了一種用前述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a-淀粉酶的方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下， (l)將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角 瓶中，在37t:， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的OD6。。達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為 lmmol L—1誘導(dǎo)劑IPTG， 2(TC誘導(dǎo)16h，得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細(xì)胞， 13000Xg離心5min去掉上清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，0"C水浴中經(jīng)超聲波破碎5min， 13000Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶 液； (3)將粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進(jìn)行純化，即 得純化的重組低溫a-淀粉酶。 取上述的重組低溫a -淀粉酶，應(yīng)用大腸桿菌工程菌MCA1表達(dá)的低溫蛋白經(jīng)活 性實(shí)驗(yàn)鑒定，具有a-淀粉酶活性，證明該低溫蛋白即為所述的重組低溫a-淀粉酶。
以上所述方法得到的重組低溫a-淀粉酶具有以下特征該酶的分子量為 51.5KD;適合作用溫度3(TC，在0t:下有34.5X的酶活力；Ca2+有助于提高該酶的熱穩(wěn) 定性，酶液分別在2(TC保溫2.5h后，其殘余酶活為73% ;該酶的最適作用pH為7.5， 金屬離子Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+能夠 抑制酶活性；1%的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強(qiáng)烈抑制 作用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用；該酶的Km為7.28mg/ mL， Vmax為13.07mg.mL、min1 ;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽二、三、四糖。
本發(fā)明所述的用基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230) CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a -淀粉酶的方法制備工藝簡單，所得到的酶具有活力高、 作用溫度低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為pMD18-T-amy的構(gòu)建圖。 圖2為本發(fā)明熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增圖譜，其中，1 : DNA
Marker; 2: a -淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 圖3為重組表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy的構(gòu)建圖。 圖4為本發(fā)明表達(dá)質(zhì)粒pEt-28a-His6-amy經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切分析圖譜，其 中，M: DNA Marker; 1: EcoRI&Sall; 2: pEt-28a-His6-amy/EcoR I。
圖5為本發(fā)明基因工程菌株表達(dá)產(chǎn)物重組熱穩(wěn)定低溫酸性a-淀粉酶的 SDS-PAGE電泳圖，其中，1 :為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2 :粗酶液；3 : DEAE離子交換層析；4 : Ni親和層析；5:活性帶。 圖6為溫度對重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶酶活力的影響圖。 圖7為pH溫度對重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶酶活力的影響圖。 圖8為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶的溫度穩(wěn)定性圖。 圖9為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶的pH穩(wěn)定性圖。 圖10為重組a -淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk圖。 圖11為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶水解馬鈴薯淀粉產(chǎn)物薄層層析圖；其 中，M : Marker ; Gl :葡萄糖；G2 :麥芽糖；G3 :麥芽三糖；G4 :麥芽四糖；G5 :
麥芽五糖；G6 :麥芽六糖；G7 :麥芽七糖。
具體實(shí)施例方式以下參照附圖，進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員
進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。
下列實(shí)施例中的材料與方法為 所采用的分子克隆技術(shù)參見J.莎畝布魯克等編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
所使用的工具酶購自大連寶生物公司和上海生工生物工程公司，具體的反應(yīng)條 件和使用方法均參考商品說明書。 所使用的膠回收試劑盒購自大連寶生物公司，使用方法均參考商品說明書。
實(shí)施例l。
克隆質(zhì)粒pMD18-T-amy的構(gòu)建。 設(shè)計(jì)低溫a-淀粉酶基的引物正向引物l和反向引物2。在引物l加上EcoRI酶 切位點(diǎn)，在引物2加上Sal I酶切位點(diǎn)。 引物1序列5' -GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3 ，，劃線部分為 EcoRI位點(diǎn)。引物2序列5' -TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3，劃線部分為Sal I位點(diǎn)。 以Pseudoalteromonas arctica GS230的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR
產(chǎn)物電泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit試劑盒割膠回收純化。與pMD18-T載體
連接，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-T-amy(見圖l)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白菌落
初步篩選陽性克隆，進(jìn)一步將重組質(zhì)粒用EcoR I和Sal I同時(shí)進(jìn)行雙酶切后電泳檢測，在
1.5kb左右處有一條特異性亮帶(見圖2)，證明所選重組子為陽性克隆，與已經(jīng)獲得的淀
粉酶基因序列對比表明序列完全正確。 實(shí)施例2。
表達(dá)載體pEtac-Hise-amy的構(gòu)建。 重組T-載體(pMD18-T-amy)和pEt-28a-His6分別進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切，其
酶切反應(yīng)體系(20iiL)如下 10 X buffer H 2 y LEcoR I(或Sal I)(IOU P L1) 1 y LpEtac-His6(或PCR產(chǎn)物) 14 y L 將pMD18-T-amy進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切，膠回收1.5kb條帶，對pEac質(zhì)粒 進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切，膠回收5.6kb的條帶；將前后兩次膠回收產(chǎn)物混合，16。C連 接18h(如圖3)，構(gòu)建了 N端含有六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pEtac-Hivamy。外源基因 在E.coli表達(dá)時(shí)，為了簡化表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟，通常添加His、 MBP等標(biāo)簽，使表達(dá)產(chǎn) 物可以通過Ni-NTA層析柱純化(Schlieben et al.， 2004)。 因此在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)在N端 添加了 His6標(biāo)簽。重組質(zhì)粒pEtac-His6-amy經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，電泳驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在 1.5kb左右處出現(xiàn)一條亮帶，證明重組正確，見圖4。 實(shí)施例3。 一種用于表達(dá)實(shí)施例2所述的重組低溫a -淀粉酶重組表達(dá)載體的基 因工程菌株大腸埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700，它是將實(shí) 施例2所述的表達(dá)載體pEtac-His6-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到 的基因工程菌株大腸埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700。
實(shí)施例4。 一種用實(shí)施例3所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌 EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a -淀粉酶的制備方法， 其步驟如下 (1)將基因工程菌株以1%的接種量接入裝有50mL LB(蛋白胨，1% ;酵母粉，5〃頁
0.5% ; NaCl， 1% ; pH 7.0)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在37。C， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)， 當(dāng)培養(yǎng)菌液的0D6。。達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為lmmol 'L—1誘導(dǎo)劑IPTG， 2(TC誘導(dǎo)16h， 得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細(xì)胞， 13000Xg離心5min去掉上清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，0"C水 浴中經(jīng)超聲波破碎5min， 13000Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶 液； (3)將制取的粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進(jìn)行純 化，即得純化的重組低溫a-淀粉酶。見表l，在SDS-PAGE上a-淀粉酶的活性染色帶 與考馬斯亮藍(lán)染色帶一致，其分子量為51.7KDa(見圖5)。
表1粗酶液的純化
總,活 U總蛋白比活力 U,'mg魏ft倍數(shù) 儒回枚率 (%)
粗,液1232.8145.58.471.0l麵
離子交換柱M0.5l謹(jǐn)2.0譜
Nl親和柱3楊13,625.513,0128,1 實(shí)施例5。實(shí)施例4所制得的重組低溫酸性a -淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。 [OO58] (1)溫度對酶活力的影響。 將酶分別在在(TC -50°〇水浴中進(jìn)行酶活測定。用pH 7.5的Tris-HCl溶液配置的 1% (w v1)淀粉溶液作為作用底物。重組a -淀粉酶的最適作用溫度3(TC時(shí)，在0"仍 有34%的酶活力(見圖6)。
(2)pH對酶活力的影響。 將酶液與在不同pH的1% (w v1)的可溶性淀粉溶液中在3(TC下進(jìn)行酶活力測 定。采用兩種方法配制不同pH的1 % (w w "的可溶性淀粉溶液，第一種方法為不同pH 值的緩沖液為50mmo1 L—1檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0 4.0) ; 50mmo1 L—1檸檬酸-磷酸 氫二鈉緩沖液分別調(diào)節(jié)pH5-9，最適作用pH為7.5(見圖7)。
(3)溫度對酶熱穩(wěn)定性的影響。 將酶分別在20、 30和4(TC的水浴中保溫進(jìn)行溫度對酶穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)溫 度保溫2.5h，每隔lh取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一進(jìn)行酶活力測 定，以未處理酶液作為對照。酶液分別在20、 30、 4(TC分別保溫5h后，其殘余活性分別 為73%、 28%和0% (見圖8)。
(4)pH對酶穩(wěn)定性的影響。 將20 ii L酶液與180 y L濃度為0.04mol/L的各種不同pH(4.5-9)的通用緩沖液 混合，分別在30°C的水浴中保溫lh后，取10 ii L保溫后的酶液測定殘余酶活，對照組為
720iiL酶液與180iiL蒸餾水混合物。，見圖9。
(5)金屬離子或化學(xué)試劑對酶活性的影響。 將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度分別達(dá)到1 .Ommol L—1和 5.0mmol丄—、然后在9(TC下測酶活。將各種常用化學(xué)試劑與酶液混合，使其最終濃度分 別為lmmol L—1和5mmo1 L—1測酶活，均以未處理的酶液的酶活設(shè)為100% 。金屬離子 Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 Pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+等能夠強(qiáng)烈的抑 制酶活性。1%的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強(qiáng)烈抑制作 用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用，(見表2)。
表2金屬離子和化學(xué)試劑對重組低溫a -淀粉酶影響
離子相對酶活窗； ,丁化學(xué)試劍相對鷗潘
對照l猶OMg2*腳認(rèn)對照wo,oo
168.85斷+132-54SDS68JS
Cu2+17,05LT雄1,4SEDTA70.73
Ba2494.CJ2Co"諷《三氣乙酸m詞
123.26ro2+39,31尿素(1%)雄認(rèn)
33*5623.16*乙鐵73.85
155.37Zn2+32.29N-漠代丁二廳亜驗(yàn)6.19
Ag+22.1455.鄉(xiāng)DTT腦.，fl
Ca》11，Hg2+li*3S,通《1%)137,20 (6)酶動(dòng)力學(xué)研究。 以不同濃度(3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、 10、 15.0mg/mL)的可溶性淀粉作為底 物，對重組低溫淀粉酶進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究，測定底物不同濃度時(shí)的酶活，反應(yīng)體系為取 190 L不同濃度的淀粉溶液加入淀粉酶lOii L，于9(TC下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，取出后迅速 加入200 ii LDNS沸水浴5min，加入3mL蒸餾水，在520nm下測定吸光值。以不同濃度 的可溶性淀粉作為底物，對重組的純化淀粉酶進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)測定，根據(jù)Lineweaver-Burk 理論，由方程V1 = Km Vmax—1 S—VVmax—1求得該酶的7.28mg/mL， Vmax為13.07mg/ mL .min(見圖10)。 (7)重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶水解產(chǎn)物特異性研究。 以1% (wv1)的馬鈴薯淀粉作為底物，每毫升底物溶液中加入lOOi!L稀釋的酶 液，置于2(TC水浴中，分別反應(yīng)l、 4、 8和16h，取不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物進(jìn)行高效薄層層 析，展劑使用正丁醇、乙酸和水的混合物，顯色劑為5%濃硫酸和乙醇溶液，使用噴霧器 將顯色劑均勻噴撒到干燥后的薄層板上，置于105t:下顯色20 30min。該重組超低溫 a-淀粉酶可以很好的水解馬鈴薯淀粉，在作用lh后既已將馬鈴薯淀粉糊精化，繼續(xù)反應(yīng) 后形成含麥芽糖在內(nèi)的一系列寡糖，隨著水解時(shí)間的延長糊精逐漸減少，麥芽寡糖含量 逐漸升高，連續(xù)作用16h后層析圖中有少量葡萄糖生成(見圖11)，表明該重組a-淀粉酶分解馬鈴薯淀粉，其主要產(chǎn)物是麥芽糖和麥芽二、三和四糖c
權(quán)利要求
一種核苷酸序列的表達(dá)載體，其特征在于，它是含有來源于海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫α-淀粉酶基因序列的表達(dá)載體pEtac-His6-amy；它由下列方法制得將海洋細(xì)菌Pseudoalteromonasarctiac GS230低溫α-淀粉酶基因的核苷酸序列擴(kuò)增，與質(zhì)粒pMD18-T載體連接，得到克隆載體pMD18-T-amy，再將克隆載體pMD18-T-amy和表達(dá)載體pEtac-His6分別經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后連接得到表達(dá)載體pEtac-His6-amy。
2. —種用于表達(dá)海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a -淀粉酶的基因工 程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，它是將權(quán)利 要求1所述的表達(dá)載體pEtac-Hise-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCCNo.2700，其特征在于，所述的大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。
4. 一種用權(quán)利要求2或3所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCCNo.2700產(chǎn)重組低溫a-淀粉酶的方法，其特征在于，其步驟如下，(1) 將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在 37°C ， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的OD6。。達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為lmmol丄—1誘 導(dǎo)劑IPTG， 20。C誘導(dǎo)16h，得發(fā)酵液；(2) 將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細(xì)胞，13000Xg 離心5min去掉上清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，0。C水浴中經(jīng)超聲 波破碎5min， 13000 Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶液；(3) 將粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進(jìn)行純化，即得純 化的重組低溫a-淀粉酶。
5. —種如權(quán)利要求4所述方法得到的重組低溫a-淀粉酶，其特征在于該酶的分 子量為51.5KD;適合作用溫度3(TC，在0t:下有34.5X的酶活力；C^+有助于提高該酶 的熱穩(wěn)定性，酶液分別在2(TC保溫2.5h后，其殘余酶活為73%;該酶的最適作用pH為 7.5，金屬離子Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 Pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+能 夠抑制酶活性；1 %的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強(qiáng)烈抑 制作用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用；該酶的Km為7.28mg/ mL， Vmax為13.07mg.mL—1.min1 ;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽二、三、四糖。
6. —種如權(quán)利要求5所述重組低溫a -淀粉酶在淀粉水解中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及將一種低溫α-淀粉酶基因重組到表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主構(gòu)成的工程菌、利用工程菌表達(dá)的重組酶及該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明采用分子操作技術(shù)，通過細(xì)菌基因組的提取確規(guī)定、目的基因的擴(kuò)增、表達(dá)載體的構(gòu)建及重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞構(gòu)建了一株工程菌EPGS230，工程菌經(jīng)過培養(yǎng)，誘導(dǎo)、離心、超聲破碎、離子交換和親和層析等步驟獲得純化的重組低溫α-淀粉酶。本發(fā)明所述制備工藝簡單、酶活力高、作用溫度低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101691579SQ20091003497
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者劉姝, 劉紅飛, 呂明生, 房耀維, 李華鐘, 王淑軍, 陳麗 申請人:淮海工學(xué)院;江南大學(xué)