專利名稱：葡聚糖酶、其編碼核酸及其表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡聚糖酶、其編碼序列、含有該序列的重組質(zhì)粒和菌株，以及由所述序 列編碼的葡聚糖在大腸桿菌中的表達和在酵母細(xì)胞中的發(fā)酵生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
葡聚糖是禾本科高等植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)非淀粉多糖，在谷物(大麥、燕麥、高 梁、大米和小麥)的胚乳細(xì)胞中含量尤其豐富。葡聚糖是由D型0構(gòu)像葡聚糖連接的多糖聚合物，具有線性的空間結(jié)構(gòu)。依據(jù)糖 苷鍵連接的不同，葡聚糖可以分為1，4-0_葡聚糖，1，3-0_葡聚糖，1，6-0_葡聚糖，1， 3-1，6-3-葡聚糖，1，3-1，4-3-葡聚糖等。其中1，3-1，4-3-葡聚糖是由3-1，3和3-1， 4混合的糖苷鍵連接，通常是由3 _1，4糖苷鍵連接葡萄糖形成纖維三糖和纖維四糖，在由 3-1，3糖苷鍵相互連接成直鏈多聚體形式。在大麥和燕麥等淀粉胚乳的細(xì)胞壁中含量在 70%左右。0-1，3-1，4_葡聚糖屬植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，是以混合(1 — 3)和 (1 — 糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于麥類和糠麩中，在大麥整 粒和胚乳中的含量高達4% 8%。0 -葡聚糖會給啤酒生產(chǎn)帶來一系列問題，如降低麥汁 分離速度和麥汁浸出量，啤酒混濁度和膠狀沉淀物增多，啤酒過濾速度減慢。在啤酒生產(chǎn) 過程中添加葡聚糖酶能有效地解決上述問題。0-1，3-1，4_葡聚糖主要被3種葡聚糖 內(nèi)切酶分解，它們是0-1，4_葡聚糖酶0-1，3_葡聚糖酶和0-1，3-1，4_葡聚糖酶。另外， 葡聚糖外切酶也起一定的作用。其中作用最強的是0-1，3-1，4_葡聚糖酶，它分解3-1， 3-1，4-葡聚糖中0-1，3-鍵鄰接的0-1，4-鍵。其水解的主要產(chǎn)物為三糖(3-0-0-纖維 二糖-D-葡萄糖)和四糖3-0-0 -纖維三糖-D-葡萄糖)。當(dāng)含有葡聚糖的谷物用作飼料原料時，葡聚糖是重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子。 3 -葡聚糖包括水溶性和非水溶性兩類，單胃動物腸道中不能分泌相關(guān)的酶消化分解
葡聚糖。并且，水溶性葡聚糖可以增大食糜的粘性，減少動物消化酶與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸， 降低消化養(yǎng)分的吸收；食糜粘性增加還造成畜禽糞便含水量和粘稠度增加，影響禽畜舍周 圍環(huán)境；0 -葡聚糖可以結(jié)合、吸附金屬離子、有機質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，造成其代謝受阻；還能降 低其他消化酶的活力，影響脂肪和蛋白質(zhì)的消化吸收，有害于腸道健康，有利于一些病原菌 的繁殖，增加發(fā)病率，因此研究能夠降解葡聚糖的葡聚糖酶具有重要意義。纖維素是地球上含量最豐富的可再生利用的多糖，研究表明其完全降解至少需要 3類酶系內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和B-葡萄糖苷酶。目前已從40多種細(xì)菌和5種 以上的真菌中克隆到了纖維素酶基因，且大多數(shù)已獲得全序列。B-l，4-內(nèi)切葡聚糖酶可特 異性作用于B-l，4-葡萄糖苷鍵，從而部分酶解纖維素。該酶早期主要應(yīng)用于啤酒工業(yè)中分 解大麥及麥芽中的B-葡聚糖凝膠，降低麥汁粘度，提高麥汁的過濾速度及得率。近年來，以 B-葡聚糖酶為優(yōu)勢的復(fù)合酶制劑在大麥型豬飼糧中得到了廣泛的關(guān)注，為解決能量飼料資 源在飼料工業(yè)中的應(yīng)用開辟了一條新途徑。同時，B-l，4-葡聚糖酶也可作為一種重要的畜禽大麥飼料添加劑，以大大提高飼料的生物轉(zhuǎn)化率和減少排泄物對環(huán)境的污染。最近，B-1， 4-葡聚糖酶在染整及洗滌工業(yè)中的應(yīng)用也逐漸重視，這也給傳統(tǒng)的染整及洗滌工業(yè)帶來了 新的發(fā)展契機。
0 -葡聚糖酶是能分解0 -糖苷鍵鏈成的葡聚糖聚合物的一類酶的總稱。按作用 方式不同，葡聚糖酶可分為內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶兩類。其中內(nèi)切0-1，3-1， 4_葡聚糖酶可以水解0-1，3-1，4-葡聚糖，專一作用于0-1，3鍵相連的0-1，4糖苷鍵，使 其降解為低分子量的片段，失去親水性和粘性。從而改變單胃動物腸道內(nèi)容物的特性，提高 生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，在食品和飼料工業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。植物和微生物都能產(chǎn)生0-1，3-1，4_葡聚糖酶，在植物種子發(fā)芽過程中可以由糊 粉層和盾片分泌0-1，3-1，4_葡聚糖酶以分解胚乳細(xì)胞壁中的葡聚糖。生產(chǎn)中應(yīng)用 較多的是微生物所產(chǎn)生的0-1，3-1，4_葡聚糖酶，包括細(xì)菌(主要為芽孢桿菌)、真菌和 瘤胃微生物。目前已經(jīng)有多種不同來源的0-1，3-1，4_葡聚糖酶基因被克隆和表達。包 括芽抱桿菌 Bacillus sublitis、B. amyloliquefaciens、B. circulans、B. licheniformis， 它們所產(chǎn)的0-l，3-l，4-葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，并且都有一個保守 的氨基酸序列。在一些非芽孢桿菌的細(xì)菌中也克隆導(dǎo)0-1，3-1，4_葡聚糖酶基因，例如 熱纖梭菌Clostridium thermocellum、牛鏈球菌Str印tococcus bovis、產(chǎn)琥珀絲狀桿菌 Fibrobacter succinogenes，以及在厭氧真菌 Orpinomyces 中分離的 3-1, 3-1，4-葡聚糖 酶序列與芽孢桿菌也很相似。不同來源的基因在不同的載體和寄主系統(tǒng)中得到表達，包括大腸桿菌、芽孢桿菌、 釀酒酵母以及轉(zhuǎn)基因大麥和煙草等，但不同表達系統(tǒng)的葡聚糖酶活性有較大的差異。綜上所述，具有優(yōu)良特性的新型葡聚糖酶的研究具有重大意義?？寺『头蛛x具有 高比活、良好穩(wěn)定性和底物特異性的葡聚糖酶可以更好的應(yīng)用于飼料和啤酒工業(yè)，而較高 的表達量可以降低生產(chǎn)成本，都是葡聚糖酶應(yīng)用于飼料工業(yè)所必需的。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案，并獲得了良好的技術(shù)效果。本發(fā)明涉及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)來源的 0 _1，3-1，4 葡聚糖酶。 實施方式之一中，所述酶含有SEQ ID NO :4,SEQ ID N0:5或SEQ ID NO :6所示的氨基酸序 列。本發(fā)明涉及從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)中克隆的0 _1，3-1，4葡聚糖酶 的編碼序列。實施方式之一，本發(fā)明提取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌基因 組DNA，構(gòu)建基因組文庫，然后通過活性篩選的方法克隆到了編碼日-1，3-1，4葡聚糖酶的 全長序列。實施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的核酸序列，分別稱之為BL-glu、BS-glu和BC-glu。實施方式之一中，所述編碼 序列是SEQ ID NO :1中的核苷酸1至642，SEQ ID NO :2中的核苷酸1至642或SEQ ID NO: 3中的核苷酸1至642所示的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述0-1，3_1，4葡聚糖酶編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源 性信號肽序列。實施方式之一中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明0-1，3_1，4葡聚 糖酶編碼序列經(jīng)Ncol和EcoRI雙酶切后與Ncol和EcoRI雙酶切的pTrcHis2載體連接，分 別得到大腸桿菌重組表達載體 pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2_BSgluE 和 pTrcHis2_BCgluE。 另一實施方式中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明0 -1，3-1，4葡聚糖酶編碼序列 經(jīng)Xhol和Xbal雙酶切后與Xhol和Xbal雙酶切的pPICZ a載體連接，分別得到酵母重組 表達載體 pPICZ a -BLgluE,pPICZ a -BSgluE 和 pPICZ a -BCgluE。另一實施方式，將不帶內(nèi) 源性信號肽編碼序列的本發(fā)明0 -1，3-1，4葡聚糖酶編碼序列經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后 與EcoRI和NotI雙酶切的pPIC9k載體連接，分別得到酵母重組表達載體pPIC9k-BLgluE、 pPIC9k-BSgluE 和 pPIC9k-BCgluE。本發(fā)明還制備包含本發(fā)明0-1，3_1，4葡聚糖酶編碼序列的細(xì)胞。實施方式之一 中，所述細(xì)胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細(xì)胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表 達或發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞，此類細(xì)胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì) 胞。在本發(fā)明的實施方式之一中，選用大腸桿菌BL21和的畢氏酵母GS115構(gòu)建表達3-1， 3-1，4葡聚糖酶的重組細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達0-1，3_1，4葡聚糖酶的方法，包括培養(yǎng)前文所述本發(fā)明 包含日-1，3-1，4葡聚糖酶編碼序列的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達，收獲表達產(chǎn) 物，還可以可行性地包括純化表達產(chǎn)物的步驟。實施方式之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明 3-1，3-1，4葡聚糖酶編碼序列的酵母(例如畢氏酵母GS115)發(fā)酵來生產(chǎn)0-1，3-1，4葡聚 糖酶，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。本發(fā)明利用基因工程手段制備了能夠高效表達并分泌葡聚糖酶的重組生產(chǎn) 株，實現(xiàn)了 葡聚糖酶的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，并獲得了優(yōu)質(zhì)的葡聚糖酶產(chǎn)品。本發(fā)明通過酶 學(xué)性質(zhì)鑒定進行了酶的最適作用溫度、最適作用PH值、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及比活力等理 化性質(zhì)的分析，證明本發(fā)明的0-1，3-1，4葡聚糖酶具有很好的？11穩(wěn)定性，良好的熱穩(wěn)定性 以及抗蛋白酶水解能力。


圖1 來自蠟狀芽孢桿菌的編碼葡聚糖酶的核酸序列BC_glu(SEQ ID NO 3) 及其編碼的氨基酸序列；圖2 來自地衣芽孢桿菌的編碼3 -葡聚糖酶的核酸序列BL_glu(SEQ ID NO 1) 及其編碼的氨基酸序列；圖3 來自枯草芽孢桿菌的編碼0 -葡聚糖酶的核酸序列BS_glu(SEQ ID NO 2) 及其編碼的氨基酸序列；圖4 三種來源的3 -葡聚糖酶的氨基酸序列的比對；圖5 :BS-glu、BC-glu和BL-glu序列在大腸桿菌質(zhì)粒pTrcHis2上構(gòu)建的重組質(zhì)粒 結(jié)構(gòu)圖；圖6 :BS_glu、BC-glu和BL-glu序列在酵母質(zhì)粒pPICZ a上構(gòu)建的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 圖；圖7 :BS_glu、BC-glu和BL-glu序列在酵母質(zhì)粒pPIC9k上構(gòu)建的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；圖8 畢氏酵母表達的BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶的最適反應(yīng) pH；圖9 畢氏酵母表達的BS-glu、BL_glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶的最適反應(yīng)
溫度；圖10 畢氏酵母表達的BS-glu、BL_glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶的pH穩(wěn)定 性；圖11 畢氏酵母表達的BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶的熱穩(wěn)定 性；圖12 畢氏酵母表達BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶發(fā)酵過程的 酶活力；圖13 畢氏酵母表達BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶發(fā)酵過程中 樣品的SDS-PAGE ；圖14 經(jīng)純化的畢氏酵母表達的BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶 的分子量圖15 畢氏酵母表達的BS-glu、BL-glu和BC_glu序列所編碼葡聚糖酶的抗蛋白 酶活性
具體實施例方式材料與方法1.菌株和載體大腸桿菌BL21、JM109及表達載體pTrcHis2，畢氏酵母GSl 15及表達載體 pPICZ α、pPIC9k 均購自 Invitrogen 公司(Carlsbad, CA, USA)。2.酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、蛋白質(zhì)Maker均購自Fermentas (MBI)，底物地衣多糖 和大麥葡聚糖均購自Sigma公司，其他常規(guī)試劑皆為購得，例如可購自為上海生工等。3.培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基，丫 0，￥ 六0，8^^，8爾丫，匪，]\ 培養(yǎng)基均參照Invitrogen 畢氏酵母操作手冊。4.方法本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在 以下實施例中，除非特殊說明，所有實驗操作均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或 部分進行趙永芳等，《生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)》；朱檢等，《生物化學(xué)實驗 [M]));J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》。4. 1. β-1，3_1，4-葡聚糖酶活力的測定本發(fā)明各實施例中所提及的葡聚糖酶活性、酶活力或活性均是指β_1，3-1， 4-葡聚糖酶活性，可用主要成分為β -1,3-1,4-葡聚糖的地衣多糖或大麥葡聚糖為底物進 行檢測和測定。其中，酶活力的定量測定按照國際通用的DNS (3，5- 二硝基水楊酸)法進行。具體地說，將0. 45ml 8. Og/L的大麥葡聚糖溶液(乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，pH5. 5)加入試管，放入50°C水浴中預(yù)熱3min。用乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5. 5)將酶液樣品做10 倍梯度稀釋，選定顯色效果令人滿意的稀釋度。將0.05ml按照選定稀釋度(N)稀釋好的酶 液加入到試管中，繼續(xù)在50°C水浴中反應(yīng)lOmin。向試管中加入2ml DNS顯色劑(參照朱 檢等編寫的《生物化學(xué)實驗[M]》配制)終止反應(yīng)。將試管在沸水中加熱5min，立即冷卻至 室溫。室溫下放置IOmin顯色。然后于540nm處測定吸光值?？瞻讓φ諡橄葘?. 05ml同樣稀釋度的酶液加入到0. 2ml乙酸-乙酸鈉緩沖液中， 在100°C沸水中煮20min滅活。然后如上所述與底物反應(yīng)、加入DNS顯色并測定吸光值。如下繪制酶解產(chǎn)物(葡萄糖)顯色的標(biāo)準(zhǔn)曲線將1. Omg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙 酸-乙酸鈉緩沖液稀(ρΗ5· 5)釋成0· 0、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8、1. Omg/mL的溶液，按上述樣品測 定的操作步驟一起反應(yīng)。以葡萄糖濃度(C，mg/mL)為縱坐標(biāo)，以吸光值(A)為橫坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程(C = KA+b)。本文中，將以上反應(yīng)條件下，單位體積的酶液每分鐘分解底物生成Iumol的還原 糖(葡萄糖)定義為一個酶活力單位(U)。樣品的β -葡聚糖酶活力U按照下面的公式計算U = Kx(AD + b χΚχΙΟΟΟχ,Υ
MxtxV式中U——樣品β -葡聚糖酶活力，U/mL ；K——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；A——樣品溶液的吸光值；A0——空白對照的吸光值；b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；M——葡萄糖的摩爾質(zhì)量 M(C6H12O6) = 180. 2g/mol ；t-反應(yīng)時間，min ；V——反應(yīng)體系中酶液的加入量，ml ；V0——反應(yīng)體系的總體積，ml ；N——試樣稀釋倍數(shù)；1000-轉(zhuǎn)化因子，Immol = lOOOumol。每次測定均取兩個平行試驗結(jié)果的算術(shù)平均值，保留整數(shù)。β -葡聚糖酶的比活力按下面的公式計算Uc = U/c其中:UC——樣品β -葡聚糖酶比活性，U/mg ；U——樣品β -葡聚糖酶活力，U/ml ；c——樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量，mg/ml。純化倍數(shù)X按照下面的公式計算X = Uc/U⑶其中X——純化倍數(shù)；Uc——純化后葡聚糖酶樣品的比活力，U/mg ；Uco——純化前葡聚糖酶樣品的比活力，U/mg。
實施例1 β -葡聚糖酶編碼序列的克隆基因組DNA的提取取37°C培養(yǎng)2天，菌體濃度OD6tltlnm至0. 5 0. 8的地衣芽孢 桿菌(Bacillus licheniformis, ATCC21610，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))菌液 50ml, IOOOOrpm離心lOmin，取50mg菌體加500ul無菌水清洗，離心取沉淀。沉淀重新懸浮 于500ul lmg/ml的溶菌酶溶液中，于37°C溫浴30min，再補加溶菌酶液IOOul于40_50°C繼 續(xù)保溫30min，至菌液透明后，加10% SDS至終濃度2%，攪拌約5min至菌液粘度顯著下降， 15000rpm離心IOmin去除碎片。上清依次用等體積酚、酚氯仿( 1 1)、氯仿抽提。取氯 仿抽提所得上層溶液加0. 6-1倍體積的異丙醇常溫沉淀lOmin。16000rpm離心15min。沉 淀用70%乙醇清洗，低速離心，將沉淀晾干后用30ul無菌水溶解，備用。取提取的基因組DNA 5ug，利用BamHI酶切，與同樣酶切的pUC19載體連接，用所得 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購自寶生物工程(大連)有限公司，中國遼寧)，構(gòu)建基因文 庫。挑取白色的陽性克隆(LB培養(yǎng)基含有100ug/ml Amp、0. 5% Χ-gal和1. 5mM IPTG)，轉(zhuǎn)移 到活性篩選平板(LB培養(yǎng)基中含有3%的瓊脂和地衣多糖)上過夜培養(yǎng)。洗去平板上 的菌體，用剛果紅染色，再用0.5M NaCI溶液洗滌脫色。含有β-葡聚糖酶編碼序列的 克隆能夠產(chǎn)生降解圈。挑取產(chǎn)生降解圈的克隆，提取該克隆的質(zhì)粒，進行測序，得到葡 聚糖酶的編碼序列BL-glu，該序列包括645bp (圖1，SEQ ID NO 1)，其中第643-645位為終 止密碼子TAA、第1-642位編碼不含信號肽的成熟蛋白(圖1和圖4)，該成熟蛋白含有214 個氨基酸(SEQ ID NO 4)。分別用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，CICC 10090，購自中國工業(yè)微生物菌 株保藏管理中心(CICC))和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus，CGMCC 1.260，購自中國普 通微生物菌株保藏管理中心(CGMCC))重復(fù)以上過程，得到β-葡聚糖酶的全長編碼序列 BS-glu(SEQ ID NO 2)和BC_glu(SEQ ID NO 3)及其編碼的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6)(圖 2、3 和圖 4)。實施例2大腸桿菌重組表達載體的構(gòu)建及β -葡聚糖酶編碼序列在大腸桿菌中的 表達和擴增根據(jù)實施例1所得編碼β -葡聚糖酶的核酸序列設(shè)計引物引物 1:5' -CCATGGCCCAAACAGGTGGATCGTTC-3‘ (SEQ ID NO 7)引物 2:5' -GAATTCTTATTTCTTTGTATAGCGC-3‘ (SEQ ID NO 8)分別以實施例1中選擇和分離得到的含有BL-glu、BS-glu和BC-glu的pUC19 重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增3種β-葡聚糖酶的編碼序列。PCR擴增條件為94°C 5min ； 94 "C lmin, 55 "C lmin, 72 "C lmin, 32 個循環(huán)；72 "C IOmin0 用 NcoI 和 EcoRI 進行雙酶 切，連接到載體pTrcHiS2上，分別獲得含有3種β-葡聚糖酶編碼序列的重組質(zhì)粒 pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2-BSgluE 和 pTrcHis2_BCgluE (見圖 5 所示)。取IOul 構(gòu)建好的 pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2_BSgluE 和 pTrcHis2_BCgluE，分 別加入到IOOul制備好的感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌BL21和JM109)中，搖勻置于冰上，冰 浴30min ；置于42°C水浴中熱擊90s ；將離心管快速移至冰水混合物中冰浴2min ；每管加 Λ 400ul SOC 培養(yǎng)基(2% 蛋白胨，0. 5%酵母粉，IOmM NaCl, 2. 5mMKCl, IOmM MgCl2, IOmM MgSO4, 20mM葡萄糖，pH7. O 7. 2)，用移液器輕吸打散后于37°C搖床上復(fù)蘇lh(80rpm 200rpm)；離心，4000rpmX 5min，除去400ul上清，剩余部分混勻；涂平板(LB_agar平板，含80ug/ml Amp)，37°C正置Ih后，倒置培養(yǎng)過夜，在抗性平板上生長的為含有重組質(zhì)粒的陽性
克隆子。分別取3種重組質(zhì)粒陽性克隆的重組大腸桿菌菌株BL21，接種于50ml LB培養(yǎng)液中(250ml三角瓶，含50ug/ml Amp)，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)1-1. 5h，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度 為2umol/ml)，37°C 250rpm再振蕩培養(yǎng)3-3. 5h。取培養(yǎng)液IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體， 再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體，12000rpm離心lOmin，取沉淀用1/5體積pH6. 050mM 的PBS懸浮菌體，進行超聲波破碎，破碎條件為60%功率，間隔5s破碎lOmin，停止lOmin， 再破碎lOmin。12000rpm離心，收集上清液，測定β -葡聚糖酶活力，并通過SDS-PAGE電泳 分析目的蛋白的表達量，結(jié)果表明三種葡聚糖酶的編碼基因所編碼的葡聚糖酶均 可在大腸桿菌中表達，且均有葡聚糖酶活性，測得酶活力分別達到30U/ml、55U/ml和 43U/ml。分別取3種重組質(zhì)粒陽性克隆所在的重組大腸桿菌菌株JM109，接種于50mlLB培 養(yǎng)液中(250ml三角瓶，含50ug/ml Amp), 37 °C 250rpm振蕩培養(yǎng)2_2. 5h，取培養(yǎng)液IOOOOrpm 離心lOmin，收集菌體，提取質(zhì)粒，酶切回收目的序列備用(質(zhì)粒提取和膠回收分別用OMEGA 公司的 Ε. Z. N. A. Plasmid Mini Kit I 和 Ε. Ζ. N. Α. Gel Extraction Kit 試劑盒)。實施例3酵母重組表達載體的構(gòu)建根據(jù)實施例1所得編碼β -葡聚糖酶的核酸序列設(shè)計引物引物 3:5' -CTCGAGCAAACAGGTGGATCGTTCTTTGAC-3' (SEQ ID NO 9)引物 4:5' -TCTAGATTATTTCTTTGTATAGCGCACC-3' (SEQ ID NO: 10)引物 5 5 ‘ -GAATTCCAAACAGGTGGATCGTTCTTTGACC-3 ‘ (SEQ IDNO 11)引物 6:5' -GCGGCCGCTTATTTCTTTGTATAGCGC-3 ‘ (SEQ ID NO: 12)以實施例2中從重組大腸桿菌菌株JM109回收的目的序列為模板，分別以引物 3和引物4構(gòu)成的引物對和引物5和引物6構(gòu)成的引物對PCR擴增各種β-葡聚糖酶 的編碼序列。PCR 擴增條件為94°C 5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，32 個循環(huán)； 72°C IOmin0引物3和引物4的PCR產(chǎn)物用XhoI和XbaI進行雙酶切后，連接到載體pPICZ α 上，得到含有各β “葡聚糖酶編碼序列的重組質(zhì)粒pPICZ α -BLgluE、pPICZ α -BsgluE和 pPICZ α-BcgluE (圖6)。引物5和引物6的PCR產(chǎn)物用EcoRI和NotI進行雙酶切后，連 接到載體pPICZ9k上，得到含有各種β -葡聚糖酶編碼序列的重組質(zhì)粒pPIC9k-BLgluE、 pPIC9k-BSgluE 和 pPIC9k_BCgluE(圖 7)。以所得各pPICZ α重組質(zhì)粒和各pPlC9k重組質(zhì)粒為模板，分別以引物3和引物4 構(gòu)成的引物對和引物5和引物6構(gòu)成的引物對進行PCR，同時，以實施例2制備的各pTrcHis 重組質(zhì)粒與引物1和引物2所構(gòu)成的引物對做PCR，從DNA水平上驗證外源基因插入是否正 確。PCR所得到的3種產(chǎn)物序列長度均為645bp，與出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌 和蠟狀芽孢桿菌原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位點、方向 和序列正確。實施例4畢氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組β -葡聚糖酶將實施例3 制備的重組質(zhì)粒pPICZ α -BLgluE、pPICZ α -BsgluE 和 pPICZ α -BcgluE 經(jīng)SacI或者PmeI酶切，得到線性化質(zhì)粒pPICZ α -BLgluEl、pPICZ α -BsgluEl禾口 pPICZ α -BcgluEl。將實施例 3 制備的重組質(zhì)粒 pPIC9k_BLgluE、pPIC9k_BSgluE 和pPIC9k-BCgluE經(jīng)SacI或者88111酶切，得到線性化質(zhì)粒？？比91^-81^1詘14 比91^-8581詘1 和 pPIC9k-BCgluEl。分別取構(gòu)建好的各種線性重組質(zhì)粒DNA 50ug，直接加入到仍在零度以下的感受態(tài) 細(xì)胞中(畢氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鮭魚精DNA的溶液II (40% (w/v)聚乙 二醇1000，0. 2M N, N-二羥乙基甘氨酸，ρΗ8· 35)，或先加入1. Oml的溶液II，然后加入5ul lmg/ml的鮭魚精DNA并盡量的將兩者完全混勻；30°C水浴保溫Ih以上，每隔15min輕輕的 混勻一次；42°C保溫IOmin ；室溫3000Xg離心5min，棄去上清，用1. Oml的溶液III (0. 15M NaCiaOmM N, N-二羥乙基甘氨酸，pH8. 35)重新懸浮菌體；室溫3000X g離心5min，移去 800ul上清，用剩余的200ul上清重新懸浮菌體；將200ul菌液涂YPD平板(YP和20% D 單獨滅菌，倒平板之前按1 9向YP中加入20% D JipPICZa重組質(zhì)粒平板篩選抗性為 10ug/ml zeocin，對pPIC9k重組質(zhì)粒平板的篩選抗性為80ug/ml Amp或50ug/ml Kan)， 30°C倒置培養(yǎng)3-4天，在抗性平板上生長的為含有重組質(zhì)粒的陽性克隆子。分別取3種pPICZa重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢氏酵母GSl 15菌株陽性克隆子，各自接種 于150ml YPD培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm = 0. 3 0. 5 (約20hr)，然后接種 于3L發(fā)酵基本培養(yǎng)基(26. 5ml/L磷酸，0. 90g/L硫酸鈣，18. 5g/L硫酸鉀，15. Og/L硫酸鎂， 4. 15g/L氫氧化鉀，Glucose 40g/L葡萄糖)中，于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。在起始階段——菌體生長階段，發(fā)酵過程中用25 %的氨水調(diào)節(jié)pH，使其維持 在5. 5，并且以4. 2ml/hr的速度流加PTMl (25mM硫酸銅，0. 55mM碘化鈉，17. 7mM硫酸錳， 0. 82mM鉬酸鈉，0. 31mM硼酸，2. 2mM氯化鈷，0. 15mM氯化鋅，0. 24mM硫酸亞鐵，1. 7mM生物 素，0. 19M硫酸)，進行連續(xù)流加補料。攪拌并通氣培養(yǎng)20-24hr，在菌體生長過程中溶氧 逐漸下降至低于100%，直至碳源耗盡，溶氧又逐漸上升至高于80%，此時菌濕重可達到 80-100g/L。進入碳源飼喂階段，以25ml/hr的速度流加用蒸餾水配置的含有25% (w/v)葡萄 糖和12ml/L PTMl的溶液，持續(xù)流加4_6hr，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20%上下，到代該 階段的末期，菌濕重可達到170-210g/L。在誘導(dǎo)階段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTMl的甲醇，使培養(yǎng)基中甲 醇的終濃度最高不要超過0.3% (ν/ν)，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20%上下。在誘導(dǎo)階 段的發(fā)酵過程中每隔10-15hr取樣10ml，IOOOOrpm離心5min，收集上清液測定葡聚糖酶活 力并進行SDS-PAGE分析，結(jié)果分別如圖12和圖13所示。發(fā)酵達167hr時，菌濕重可達到 250-300g/L，BS、BL和BC來源的葡聚糖酶的表達水平(以發(fā)酵液上清的酶活力表示)可分 別達到240U/ml、450U/ml和300U/ml，這說明3種來源的β -葡聚糖酶基因均在畢氏酵母中 得到了表達和積累。實施例5重組β -葡聚糖酶的純化將實施例4所制備的發(fā)酵培養(yǎng)液(167hr后回收所得)10000rpm離心IOmin去除菌 體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至80% (w/v), 13000rpm離心15min，取沉淀，用pH8. 0,0. 05mM Tris-HCl緩沖液重新溶解，進一步用色譜
進行純化。經(jīng)硫酸銨沉淀后上TOSOH Toyopearl EDAE-650C陰離子柱。先用pH8. 0，0. 05mM Tris-HCl緩沖液平衡柱子，然后流加樣品，再用相同緩沖液配置的0-0. 8mol/L NaCl梯度洗脫5個柱體積，流速為lml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后對收集管中的溶液測 定葡聚糖酶活力及蛋白電泳分析。收集離子交換分離后的活性峰，濃縮、脫鹽、凍干后，再用pH7. 020mM PBS緩沖液溶 解，上TOSOH Toyopearl HW_50s HPLC柱。先用pH7. 020mM PBS緩沖液洗脫平衡柱子，然后 上樣，用pH7. 020mM PBS緩沖液洗脫1. 5個柱體積，流速為0. 25ml/min,按峰收集，然后對收 集的樣品測定葡聚糖酶活力及進行蛋白質(zhì)電泳分析。SDS-PAGE結(jié)果(圖14)表明，3種來 源的葡聚糖酶純化后的葡聚糖酶蛋白僅有單一的條帶，分子量均約為32kDa。純化完成后，BS-glu編碼的β -葡聚糖酶比活性從粗酶液的346U/mg提高到純酶 的3043U/mg，純化倍數(shù)為8. 8 ；BL-glu編碼的β -葡聚糖酶比活性從粗酶液的147U/mg提高 到純酶的1217U/mg，純化倍數(shù)為8. 3 ；BC-glu編碼的β -葡聚糖酶比活性從粗酶液的327U/ mg提高到純酶的3122U/mg，純化倍數(shù)為9. 5。實施例6重組β -葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析用上述畢氏酵母167hr發(fā)酵液上清進行以下酶學(xué)性質(zhì)分析。按照前所DNS法，在不同的pH下進行酶促反應(yīng)，法測定酶活力，由此確定其最適 PH。所用緩沖液為pH3. 0-10. O的Britton-Robinson緩沖液，50°C下測定pH的適性結(jié)果。 結(jié)果表明，BS-glu、BL-glu及BC-glu編碼的β -葡聚糖酶的最適pH均在6. O左右(圖8)。將酶液在不同pH值的Britton-Robinson緩沖液中于室溫下靜置30min，測定殘余 酶活性以研究β -葡聚糖酶的PH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖10)，在ρΗ4. 0-10. O之間，BS-glu 編碼的β-葡聚糖酶殘余活性在85%以上；在pH5. 0-10. O的范圍內(nèi)，BL-glu編碼的β-葡 聚糖酶的殘余活性在90%以上；在ρΗ3. 0-10. O的范圍內(nèi)，BC-glu編碼β -葡聚糖酶的殘 余活性在85%以上。這說明BS-glu、BL-glu及BC-glu編碼的β -葡聚糖酶均有很好的pH 穩(wěn)定性。最適反應(yīng)溫度的測定在乙酸-乙酸鈉(pH6.0)緩沖體系及不同溫度下 (30 0C -70 0C )進行，按照前述DNS法進行酶促反應(yīng)和活力測定。結(jié)果表明(圖9)， BS-glu β -葡聚糖酶和BL-glu β -葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度在40°C左右，BC-glu β -葡聚 糖酶的最適反應(yīng)溫度在50°C左右。熱穩(wěn)定性研究為在不同溫度下靜置60min，再進行DNS法酶活性測定。結(jié)果標(biāo) 明(圖11)，在30°C -50°c范圍內(nèi)，殘余酶活力都維持在70%以上，在50°C和60°C下保溫 30min，殘余酶活力為80%左右。說明3種來源的β -葡聚糖酶均有較好的熱穩(wěn)定性。分別在3種來源酶溶液中加入0. 05ml胰蛋白酶(0. lmg/ml，用pH7. 0PBS緩沖液 配置)和胃蛋白酶(0. lmg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL緩沖液配置)于37°C反應(yīng)120min，測 定β-葡聚糖酶活性。經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶分別處理120min后，酶殘余酶活力均在65% 以上(圖15)，說明3種基因來源的葡聚糖酶均具有較好的抗蛋白酶水解能力。序列表<110>福建福大百特科技發(fā)展有限公司<120>葡聚糖酶、其編碼核酸及其表達<130)090230<160>12 <170>PatentIn version 3. 3
<210>1<211>645<212>DNA〈213〉地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>1caaacaggtg gatcgttctt tgaccctttt aacggctata actccggttt ttggcaaaaa 60gcagatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcacgt ggcgggctaa taacgtatca 120gtgacgtcat tgggtgaaat gcgtttagcg ctaacaagcc catcttataa caagtttgac 180tgcggggaaa accgttctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa 240ccagctaaaa acacagggat cgtttcatcg ttctttactt acacaggtcc aacagatgga 300actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaagggttcaattt 360aactattata caaatggtgc aggaaaccat gagaagattg ttgatctcgg gtttgatgca 420gccaatgcct atcatactta tgcattcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtc 480gacgggcaat taaaacatac tgcaacaaac caaattccga caacacctgg aaagatcatg 540atgaacttgt ggaatggtac gggtgtcgat gaatggcttg gctcctacaa tggtgtaaat 600ccgctatacg ctcattatga ttgggtgcgc tatacaaaga aataa645<210>2<211>645<212>DNA〈213〉枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>2caaacaggtg gatcgttctt tgaccctttt aacggctata actccggttt ttggcaaaaa 60gcagatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcactt ggcgggctaa taacgtatca 120atgacgtcat tgggtgaaat gcgtttagcg ctaacaagcc catcttataa caagtttgac 180tgcggggaaa accgttctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa 240ccagctaaaa acacagggat cgtttcatcg ttcttcactt acacaggtcc aacagatgga 300actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag
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atgacgtcat taggtgaaat gcgtttggcg ctaacaagtc catcttataa caagtttgac 180tgcggggaaa accgctctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa 240ccagctaaaa acgtagggat cgtttcatcg ttcttcactt acacaggtcc aacggatgga 300actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag acacaacaag ggttcaattt 360aactattata caaatggtgt aggaaaccgt gagaagattg tggatctcgg atttgatgca 420gccaatgcca atcatacgta tgcgttcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtc 480gatgggcaat taaaacatac tgcgacaagc caaattccga caacaccagg taagatcatg 540atgaacttgt ggaatggtac gggtgtagat gaatggctcg gttcctacaa tggtgtaaca 600ccgctatacg ctcattacga ttgggtgcgc tatacaaaga aataa645<210>4<211>214<212>PRT<213> 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>4Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Gly Tyr Asn Ser Gly151015Phe Trp Gln Lys Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys202530Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Val Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg354045Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn505560Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly L6u Tyr Glu Val Arg Met Lys65707580Pro Ala Lys Asn Thr Gly lie Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly859095Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu lie Asp lie Glu Phe Leu Gly100105110Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly115120125Asn His Glu Lys lie Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr130135140His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser lie Lys Trp Tyr Val145150155160Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Asn Gln lie Pro Thr Thr Pro165170175Gly Lys lie Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp180185190Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp
195200205Val Arg Tyr Thr Lys Lys
210<210>5<211>214<212>PRT<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>5Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Gly Tyr Asn Ser Gly151015Phe Trp Gln Lys Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys202530Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg354045Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn505560Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys65707580Pro Ala Lys Asn Thr Gly lie Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly859095Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu lie Asp lie Glu Phe Leu Gly100105110Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly115120125Asn His Glu Lys lie Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr130135140His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser lie Lys Trp Tyr Val145150155160Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Asn Gln lie Pro Thr Thr Pro165170175Gly Lys lie Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp180185190Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp195200205Val Arg Tyr Thr Lys Lys210<210>6<211>214<212>PRT
<213> 賭狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)<400>6Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly
151015Ser Trp Gln Lys Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys202530Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg354045Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn505560Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys65707580Pro Ala Lys Asn Val Gly lie Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly859095Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu lie Asp lie Glu Phe Leu Gly100105110Lys Asp Thr Thr Arg Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Val Gly115120125Asn Arg Glu Lys lie Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Asn130135140His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser lie Lys Trp Tyr Val145150155160Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Ser Gln lie Pro Thr Thr Pro165170175Gly Lys lie Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp180185190Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Thr Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp195200205Val Arg Tyr Thr Lys Lys210<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>7ccatggccca aacaggtgga tcgttc26<210>8
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>8gaattcttat ttctttgtat agcgc25<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>9ctcgagcaaa caggtggatc gttctttgac30<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>10tctagattat ttctttgtat agcgcacc28<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>11gaattccaaa caggtggatc gttctttgac c31<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>12
gcggccgctt atttctttgt atagcgc2權(quán)利要求
β-1，3-1，4葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO4，SEQ ID NO5或SEQID NO6所示。
2.—種核酸分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的β_1，3-1，4葡聚糖酶，較好的 是，其序列如SEQ ID NO 1中的核苷酸1至642，SEQ ID NO 2中的核苷酸1至642或SEQ ID NO 3中的核苷酸1至642所示。
3.包含權(quán)利要求2所述核酸分子的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，是大腸桿菌質(zhì)?；蚪湍纲|(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求3所述的載體，選自PTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2_BSgluE、 pTrcHis2-BCgluE、pPICZ α -BLgluE, pPICZ α -BSgluE、pPICZ α -BCgluE、pPIC9k_BLgluE、 pPIC9k-BsgluE 或 pPIC9k_BCgluE。
6.包含權(quán)利要求2所述核酸分子的細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，用權(quán)利要求3-5中任一項所述載體轉(zhuǎn)化而得。
8.如權(quán)利要求6或7所述的細(xì)胞，是包含所述核酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 BL21或包含所述核酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的畢氏酵母GS115。
9.一種生產(chǎn)β_1，3-1，4葡聚糖酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7或8所述的細(xì)胞，誘 導(dǎo)其表達，收獲表達產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，還包括純化表達產(chǎn)物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡聚糖酶、其編碼核酸及其表達，尤其是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)來源的β-1，3-1，4葡聚糖酶，其編碼序列、重組載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其表達和生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/085GK101824401SQ20091004690
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日
發(fā)明者葉秀云, 張洋, 李仁寬, 羅鋆琳, 賴慶安, 靳偉剛 申請人:福建福大百特科技發(fā)展有限公司